響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)晶麥芽制備工藝

趙川艷，尹永祺，楊正飛，方維明

(揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州 225127)

結(jié)晶麥芽是特種麥芽[1]的重要品種之一，屬于焙烤麥芽，是指胚乳部分能夠呈現(xiàn)出穩(wěn)定的水晶、玻璃狀的麥芽顆粒[2]。結(jié)晶麥芽內(nèi)部核心的堅硬玻璃質(zhì)能夠賦予啤酒更好的口感，并增加其醇厚性、非生物穩(wěn)定性[3]、泡持性和麥芽香味[4]。結(jié)晶麥芽在發(fā)芽工序上區(qū)別于普通麥芽之處在于其需要將發(fā)芽后的綠麥芽完整地進行預(yù)糖化，然后在高溫下焙烤完成[5-6]。預(yù)糖化工藝分為蛋白質(zhì)休止和糖化兩個階段，在此工藝過程中，麥芽中的蛋白質(zhì)和淀粉分別在蛋白酶和淀粉酶的作用下分解為氨基酸和糖類，為后續(xù)焙焦過程中的美拉德反應(yīng)[7-10]和焦糖化反應(yīng)[11-12]做準(zhǔn)備。美拉德反應(yīng)的底物是由綠麥芽糖化過程中內(nèi)源酶制劑降解淀粉和蛋白質(zhì)形成的，該過程是麥芽中糖類物質(zhì)和氨基酸積累的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時也對結(jié)晶麥芽后續(xù)焙焦過程中結(jié)晶物質(zhì)的形成有著重要影響[13]。焙焦階段是麥芽色、香、味形成的重要階段[5,14-16]，焙焦溫度和時間的合理搭配能夠提高麥芽的品質(zhì)，繼而提高啤酒的品質(zhì)[17-18]。當(dāng)前，國內(nèi)對結(jié)晶麥芽的生產(chǎn)工藝研究較少，具體制備工藝條件尚不明確，而且國內(nèi)所使用的結(jié)晶麥芽主要依賴于進口，國內(nèi)少量的結(jié)晶麥芽普遍存在結(jié)晶率不高、結(jié)晶品質(zhì)不佳等缺陷，所以從結(jié)晶麥芽的生產(chǎn)工藝入手來優(yōu)化結(jié)晶麥芽的品質(zhì)至關(guān)重要[19]。

本研究優(yōu)化制備適合用于結(jié)晶麥芽的綠麥芽，進一步通過單因素實驗和響應(yīng)面法[20]分析優(yōu)化預(yù)糖化工藝和焙焦工藝，增加結(jié)晶麥芽的結(jié)晶率，提升其結(jié)晶品質(zhì)，以期為國內(nèi)優(yōu)質(zhì)結(jié)晶麥芽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳麥 市售結(jié)晶麥芽，永順泰(寶應(yīng))麥芽有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、果糖、碘酸鉀、乙醇、甘氨酸、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、L-酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、可溶性淀粉、乙酸、乙酸鈉、硫酸、硫代硫酸鈉、四硼酸鈉、碘化鉀、百里酚酞(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；食品級乳酸 上海瑞祥生物科技有限公司。

PGX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；BGT-8A糖化儀 杭州博日科技有限公司；UV752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；pHS-25 pH計 上海雷磁儀器有限公司；HC-2066高速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；MA-110-3H水分含量測定儀 蘇州坤宏科技有限公司；T1-L1O1B烤箱 美的集團股份有限公司；090834TS高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結(jié)晶麥芽制備工藝流程 大麥清洗除雜→浸麥→發(fā)芽→綠麥芽預(yù)糖化→排潮→焙焦→除根→成品結(jié)晶麥芽

1.2.2 綠麥芽發(fā)芽時間選擇 稱取300 g除雜后的大麥洗凈，恒溫恒濕培養(yǎng)箱溫度為16 ℃，濕度為95% RH，采用浸四斷八[21]的浸麥方式浸麥。浸麥48 h后，于15 ℃下避光發(fā)芽。分別發(fā)芽24、36、48、60、72、84和96 h，在發(fā)芽過程中每隔6 h補水使大麥保持濕潤最終得到綠麥芽。

取不同發(fā)芽時間的綠麥芽25 g，加入100 mL蒸餾水在65 ℃下糖化1 h。之后取5 g糖化好的綠麥芽，加入50 mL蒸餾水，用攪拌器粉碎，在8000×g下離心15 min，取上清，測定游離氨基氮與還原糖含量。

1.2.3 綠麥芽預(yù)糖化工藝優(yōu)化

1.2.3.1 蛋白質(zhì)休止階段單因素實驗 將發(fā)芽3 d的綠麥芽浸入糖化水中，分別在40、45、50、55、60 ℃下進行蛋白質(zhì)休止1.5 h(pH為6.5)；用食品級乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)，在45 ℃下進行蛋白質(zhì)休止1.5 h；溫度固定為45 ℃(pH自然)，蛋白質(zhì)休止時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。取樣測定游離氨基氮含量。

1.2.3.2 綠麥芽糖化階段單因素實驗 將發(fā)芽3 d的綠麥芽浸入糖化水中，分別在50、55、60、65和70 ℃下糖化1.5 h(pH為6.5)；用食品級乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)，在65 ℃下糖化1.5 h；固定糖化溫度為65 ℃，pH為6.5，分別進行糖化0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。取樣測定還原糖含量。

1.2.3.3 綠麥芽糖化階段響應(yīng)面試驗 基于單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理采用響應(yīng)面法確定綠麥芽預(yù)糖化工藝中糖化階段的最優(yōu)工藝參數(shù)。以溫度(A)、pH(B)和時間(C)為自變量，還原糖含量(Y)為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.4 焙焦階段工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗 將預(yù)糖化好的綠麥芽在90 ℃下干燥1 h使其凋萎，分別在100、110、120、130、140和150 ℃下焙焦20 min；固定焙焦溫度為120 ℃，分別焙焦10、15、20、25、30 min，分別取樣測定麥芽水分含量、結(jié)晶率和色度。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗 基于單因素實驗結(jié)果，為得到結(jié)晶率最高且色度范圍在130～160 EBC之間的結(jié)晶麥芽的最優(yōu)工藝參數(shù)，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計(CCD)原理采用響應(yīng)面法確定焙焦階段的最佳工藝條件。以焙焦溫度(A)和焙焦時間(B)兩個因素為自變量，水分含量、結(jié)晶率、色度為響應(yīng)值，進行兩因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 指標(biāo)測定 游離氨基氮含量：參考茚三酮方法[22]進行測定；還原糖含量：采用DNS光度法[23]進行測定；水分含量：使用快速水分含量測定儀進行測定[24]；色度：按照歐洲啤酒協(xié)會的檢測方法，采用分光光度法測定[11]；浸出物：參考QB/T 1686-2008《啤酒麥芽》密度瓶法[22]；糖化力：參考QB/T 1686-2008《啤酒麥芽》糖化力的測定方法[22]；麥汁pH：參考焦健[25]的總酸含量的測定方法；結(jié)晶率[26]：隨機數(shù)100粒結(jié)晶麥芽用剪刀沿著腹溝剪開，觀察內(nèi)部結(jié)晶程度；

計算方法：大于1/2的結(jié)晶質(zhì)算作1粒，小于1/2的結(jié)晶質(zhì)算作半粒。

式中：x：一粒結(jié)晶質(zhì)數(shù)，單位為粒；y：半粒結(jié)晶質(zhì)數(shù)，單位為粒。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗進行3次平行，測定結(jié)果采用Microsoft Excel和Origin 8.5統(tǒng)計處理和作圖，利用DPS 7.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行隨機單因素方差分析，采用Tukey多重比較法進行顯著性檢驗。利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面實驗進行設(shè)計、分析并繪制響應(yīng)曲面。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠麥芽發(fā)芽時間的選擇

如圖1所示，大麥在發(fā)芽24～72 h時，游離氨基氮與還原糖含量持續(xù)升高，72 h時達到最高，分別達到432.91 mg/L、109.40 g/L，而后開始下降。這是因為發(fā)芽72 h時麥芽中蛋白酶的酶量與活性較高，游離氨基氮的含量處于較高水平，這與周蕓蕓等[27]的研究基本一致。在發(fā)芽后期，麥粒中的各種酶被激活來降解大麥中的淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素，利用這些降解的小分子物質(zhì)去合成新的細胞并生長出根芽和葉芽[28]。所以，選擇發(fā)芽72 h的綠麥芽作為制備結(jié)晶麥芽的原料，有利于在結(jié)晶麥芽制備過程中形成更多的還原糖和氨基酸，進而提高結(jié)晶率和增加美拉德產(chǎn)物。

圖1 綠麥芽糖化后游離氨基氮和還原糖含量的變化Fig.1 Changes of free amino nitrogen and reducing sugar content after green malt saccharification

2.2 綠麥芽預(yù)糖化工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗 圖2中A、B、C三圖為綠麥芽預(yù)糖化工藝中蛋白質(zhì)休止階段的單因素實驗結(jié)果，D、E、F三圖為糖化階段的單因素實驗結(jié)果。結(jié)果表明，在45 ℃時，綠麥芽中的蛋白酶能夠更好地將麥芽中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸，使得游離氨基氮含量顯著增高(P<0.05)，達841.21 mg·L-1(圖2A)。圖2B表明，pH的變化對蛋白質(zhì)休止無顯著影響(P>0.05)；圖2C中蛋白休止時間在0.5～1.5 h游離氨基氮含量顯著增加(P<0.05)，但在1.5 h后，游離氨基氮的含量無顯著變化(P>0.05)，所以蛋白休止時間選擇1.5 h較為合適。

圖2 預(yù)糖化工藝中溫度、pH和時間對蛋白質(zhì)休止和糖化效果的影響Fig.2 The influence of temperature, pH and time on protein resting and saccharification effect in pre-saccharification process

如圖2D所示，還原糖含量在50～70 ℃之間變化顯著(P<0.05)，65 ℃時，綠麥芽的還原糖含量最高，達到110.28 g·L-1；由圖2E可知，pH為6時，綠麥芽的還原糖含量最高；所以可以初步確定糖化階段的最適溫度為65 ℃，最適pH為6.0。圖2F表明，糖化時間在0.5～2.0 h之間還原糖含量顯著增加(P<0.05)，但在2.0 h后，還原糖的含量增加無顯著變化(P>0.05)，所以糖化時間選擇2.0 h較為合適。

2.2.2 綠麥芽糖化階段響應(yīng)面試驗

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 基于單因素實驗，采用Box-Behnken模型，以還原糖含量Y為響應(yīng)值，對溫度(A)、pH(B)和時間(C)進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 預(yù)糖化工藝響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology of pre-saccharification process

2.2.2.2 建立多元二次回歸方程與顯著性檢驗表 通過Design-Expert軟件，對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，擬合得出結(jié)晶麥芽糖化工藝中還原糖含量(Y)關(guān)于溫度(A)、pH(B)、時間(C)的多元二次回歸方程：

由回歸方程可以看出，三項因素對指標(biāo)值的影響程度為A>C>B。

通過表4可知，R2為0.9972，R2Adj為0.9936，說明模型的預(yù)測值和實際值吻合度較好[29]。選擇的模型差異極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明該線性回歸方程的模型擬合可用于預(yù)測綠麥芽糖化。通過顯著性檢驗P值的大小可以得到溫度、pH和時間這三個因素中，溫度對于糖化效果的影響極顯著(P<0.001)，溫度、pH和時間的交互作用對糖化效果均無顯著影響(P>0.05)。響應(yīng)面圖和等高線圖顯示各因素的變化趨勢與回歸模型的方差分析結(jié)果相吻合(圖3)。

表4 Box-Behnken 試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Behnken experiment

圖3 兩因素交互作用對還原糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of the influence of two factors interaction on reducing sugar content

2.2.2.3 模型驗證試驗 綠麥芽預(yù)糖化工藝中糖化階段的最佳條件為：溫度為66.35 ℃，pH為6.01，時間為2.02 h。因考慮到實際操作情況，調(diào)整最佳工藝條件為溫度為66.4 ℃，pH為6.0，時間為2.0 h。在此工藝條件下進行驗證實驗，得到的還原糖含量實測值為135.23 g·L-1，相對于單因素實驗，糖化效果得到明顯優(yōu)化。

2.3 焙焦階段工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實驗 將凋萎的綠麥芽分別在100～150 ℃下焙焦10～30min，不同焙焦溫度和時間下水分含量、結(jié)晶率和色度的變化如圖4所示。圖4A表明水分含量隨焙焦溫度的升高而降低，且在100～130 ℃差異顯著(P<0.05)。焙焦結(jié)束時，麥芽的水分含量應(yīng)達到5%以下[30]，如圖4A所示，焙焦溫度在130～150 ℃范圍內(nèi)，水分含量均達到要求。由圖4B可看出焙焦溫度在130 ℃時，結(jié)晶率達到最高，且差異顯著(P<0.05)，但高于140 ℃時結(jié)晶率降低，說明焙焦溫度不宜過高；由圖4C可知，色度隨焙焦溫度的升高而升高，且存在顯著性差異(P<0.05)；焙焦溫度在120～130 ℃時，色度在130～160 EBC范圍內(nèi)。圖4D表明隨著焙焦時間的增加(10～20 min)，水分含量顯著降低(P<0.05)，結(jié)晶率和色度顯著升高(P<0.05)；焙焦30 min水分含量能達到5%以下，且結(jié)晶率最高，達到98%，色度也在120 EBC以上。因考慮到實際情況，焙焦溫度過高或焙焦時間過長都會導(dǎo)致麥芽烤焦，所以選擇焙焦溫度120～140 ℃，焙焦時間25～30 min用于響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖4 焙焦溫度和焙焦時間對水分含量、結(jié)晶率和色度的影響Fig.4 Effects of baking temperatures and baking time on moisture content, crystallinity and chromaticity

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.2.1 中心組合試驗設(shè)計 試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表5。

2.3.2.2 建立多元二次回歸方程與顯著性檢驗表 對表5中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合得出結(jié)晶麥芽焙焦工藝中焙焦溫度(A)和焙焦時間(B)對水分含量、結(jié)晶率和色度的二次回歸方程：

表5 焙焦工藝響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface methodology of baking process

由表6可知，三個模型的R2和R2Adj均較為接近，說明模型的預(yù)測值和實際值吻合度較好，且模型差異極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，表明模型有很好的預(yù)測性[31]。表6表明，焙焦溫度對水分含量和色度有極顯著影響(P<0.001)，對結(jié)晶率有非常顯著影響(P<0.01)；焙焦時間對色度有極顯著影響(P<0.001)，對水分含量有非常顯著影響(P<0.01)；焙焦溫度和時間的交互作用對色度具有極顯著影響(P<0.001)。

表6 水分含量、結(jié)晶率和色度的方差分析Table 6 Variance analysis of moisture content, crystallization rate and chromaticity

2.3.2.3 模型驗證試驗 利用Design-Expert軟件進行分析，得到結(jié)晶麥芽的最佳焙焦工藝為：溫度127.23 ℃，時間26.86 min，預(yù)測理論值：水分含量3.69%(指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)在5%以下)，結(jié)晶率98.8%(最大值100%)，色度159.6 EBC(范圍在130～160 EBC)。結(jié)合實驗可操作性，將最優(yōu)焙焦工藝實驗參數(shù)確定為溫度127 ℃，時間27 min，按照此工藝條件進行驗證實驗，得到水分含量、結(jié)晶率和色度的平均值分別為3.75%、99%和158.9 EBC，與預(yù)測值相差較小，進一步驗證了該回歸模型較為合理有效。

2.4 結(jié)晶麥芽品質(zhì)分析

結(jié)晶麥芽表皮呈金黃色或焦黃色，與市售結(jié)晶麥芽相比，本工藝制備的結(jié)晶麥芽顆粒更加飽滿、均勻、有光澤(圖5B)。將結(jié)晶麥芽剖開，其胚乳部分呈現(xiàn)棕色或黑棕色的結(jié)晶狀。本工藝制備的結(jié)晶麥芽內(nèi)部能夠完全結(jié)晶(圖5D)，而市售結(jié)晶麥芽只有部分結(jié)晶(圖5C)。從表7中可以看出，市售結(jié)晶麥芽和本工藝制備結(jié)晶麥芽在糖化力、麥汁pH上差別不顯著(P>0.05)，但游離氨基氮的含量顯著提高了24.4%(P<0.05)，還原糖含量和浸出率也比市售結(jié)晶麥芽顯著高出16.5%和10.3%(P<0.05)。本工藝制備的結(jié)晶麥芽整體的結(jié)晶率也高于市售的結(jié)晶麥芽。經(jīng)過工藝優(yōu)化后，結(jié)晶麥芽的品質(zhì)得到了明顯的改善。

表7 結(jié)晶麥芽質(zhì)量指標(biāo)對比Table 7 Comparison of quality indicators of crystalline malt

圖5 市售結(jié)晶麥芽(A、C)與本工藝制備結(jié)晶麥芽(B、D)的外觀圖和剖面圖Fig.5 Appearance and cross-sectional views of commercially available crystalline malt(A,C) and crystalline malt (B,D)prepared by this process

3 討論

結(jié)晶麥芽的主要生產(chǎn)工序是使已經(jīng)充分溶解的綠麥芽蛋白質(zhì)休止、糖化、排潮、高溫焙焦。蛋白質(zhì)休止過程是麥芽中的羧基肽酶分解多肽形成氨基酸(α-氨基氮)和利用內(nèi)切肽酶分解蛋白質(zhì)形成多肽和氨基酸的過程。麥芽中主要蛋白酶的最適作用溫度[31]為40～55 ℃，形成α-氨基氮的最適溫度為45～50 ℃，所以蛋白質(zhì)休止最適溫度為45 ℃。pH的變化對蛋白質(zhì)休止無顯著影響(P>0.05)，是由于在麥芽中含有酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[32]，使其對pH敏感性變小，從而導(dǎo)致pH的變化對蛋白休止無顯著影響。

糖化是在存在于綠麥芽中的α-淀粉酶與β-淀粉酶[33]的共同作用下完成的[14]，其中α-淀粉酶的最適pH為5.7～5.9，β-淀粉酶的最適pH與α-淀粉酶大體相同，而且其最適溫度為50～55 ℃。但由于糖化時使用的是完整的綠麥芽，大麥皮殼的保護導(dǎo)致麥芽內(nèi)部的溫度與環(huán)境存在差異，所以可使糖化階段的最適溫度為66.4 ℃，最適pH為6.0。糖化結(jié)束升溫至90 ℃進行排潮處理，麥芽內(nèi)部初步發(fā)生美拉德反應(yīng)；排潮結(jié)束后的高溫焙焦過程可使麥芽內(nèi)部還原性糖脫水縮合發(fā)生焦糖化反應(yīng)[12]，并伴隨發(fā)生美拉德反應(yīng)[34-35]，生成呈色呈香類物質(zhì)，結(jié)晶麥芽中內(nèi)部結(jié)晶的形成也發(fā)生在此過程。Coghe等[9]研究得出麥芽色度的形成取決于焙焦溫度和時間，這是由于焙焦溫度越高，類黑精的生成量也越多[36]。結(jié)晶麥芽要求的色度越高，所需要相應(yīng)的焙焦溫度越高，時間也越長，所以應(yīng)根據(jù)實際需求來調(diào)整最適的焙焦溫度和時間的組合。對于結(jié)晶麥芽的色度范圍，目前并沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)。淺色結(jié)晶麥芽的色度一般在50～80 EBC，深色結(jié)晶麥芽在280～320 EBC左右，用于釀造一定色度的啤酒時，淺色結(jié)晶麥芽的著色能力相對較差，所以添加量相對較高，這可能會對麥芽糖化過程中的糖化力產(chǎn)生不利影響[37]；深色結(jié)晶麥芽添加不當(dāng)則會對啤酒的著色情況和風(fēng)味方面(如焦苦味的產(chǎn)生)產(chǎn)生影響[38]；李琳娜等[39]利用色度在120～140 EBC的焦香麥芽釀造出來的啤酒色澤明亮，泡沫細膩持久，麥芽香氣濃郁，口感醇厚柔和，品質(zhì)較好。綜上所述，本研究選擇優(yōu)化生產(chǎn)色度范圍在130～160 EBC的結(jié)晶麥芽，此色度范圍內(nèi)的結(jié)晶麥芽在啤酒釀造時既能夠更好的著色，且不影響調(diào)色時的糖化力，也不會對啤酒風(fēng)味產(chǎn)生不利影響。

4 結(jié)論

本研究通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到綠麥芽預(yù)糖化工藝和焙焦工藝的最佳工藝參數(shù)：將綠麥芽在45 ℃下蛋白質(zhì)休止1.5 h，在66.4 ℃，pH為6.0的條件下糖化2.0 h可使得綠麥芽中游離氨基氮和還原糖含量達到最高。進一步在127 ℃下焙焦27 min，可得到水分含量為3.75%、色度為(158.9±1.19)EBC、結(jié)晶率高達99%的結(jié)晶麥芽，且該結(jié)晶麥芽內(nèi)部能夠完全結(jié)晶，結(jié)晶品質(zhì)較高，與市售結(jié)晶麥芽相比，其游離氨基氮含量、還原糖含量和浸出率也得到了顯著提高(P<0.05)，整體品質(zhì)得到改善。