以黃水為培養(yǎng)基生產(chǎn)細(xì)菌纖維素

文 章，何朝玖，陳 才，錢芪云，王橋慧，劉緒興，楊生智，程 鵬，陳 杰,

(1.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北黃石 435000)

細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)是由微生物合成的由D-葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成的多孔網(wǎng)狀納米級生物高分子聚合物[1]，其機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、高結(jié)晶度、高純度(無木質(zhì)素、半纖維素和果膠等雜質(zhì))、低密度、高比表面積、良好的透氣性、高孔隙度、高含水量、保水能力高和良好的生物相容性等獨(dú)特優(yōu)良性質(zhì)，使其在食品、造紙、紡織、生物醫(yī)用材料、光學(xué)電子材料等方面都有著廣泛應(yīng)用[2-3]。BC的生物合成是一個(gè)受到多種微生物酶協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜代謝過程[4]。糖類和醇類物質(zhì)是BC生物合成最常用的碳源，葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)是被用于研究生物合成BC最多的菌種之一，其合成BC的主要途徑見圖1[5]。在不同碳源和生長因子(酵母提取物和蛋白胨)的合成介質(zhì)中生產(chǎn)BC，成本昂貴，且BC產(chǎn)量低，同時(shí)對底物的利用率也不高，這些因素非常不利于BC的工業(yè)化大生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，尋找適宜的、價(jià)格低廉的原料來降低BC的生產(chǎn)成本是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

圖1 木醋桿菌合成纖維素的主要途徑Fig.1 The principal pathway of cellulose synthesis in Gluconacebacter xylinum

近年來，國內(nèi)外先后報(bào)道了許多利用廉價(jià)原料生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究。這些原料大多數(shù)都是工業(yè)和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，如煙草廢料提取[6]、甜菜糖蜜和奶酪乳清介質(zhì)[7]、酒廠廢水[8]、玉米漿[9]、果汁[10]、玉米秸稈[11]、荔枝提取物[12]、飲料工業(yè)廢物[13]、玉米芯酸水解液[14]、酒糟浸出液[15]、酒糟酶解液[16]、廢啤酒酵母[17]和葡萄酒廢料[18]等。黃水是在中國白酒的釀造過程中糧糟經(jīng)各類微生物進(jìn)行復(fù)雜分解代謝后產(chǎn)生的含有大量有機(jī)酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、還原糖、酒精及香味物質(zhì)的棕褐色的液體[19]。已有的研究表明，黃水中含有的葡萄糖等糖類，乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸，乙醇、丙三醇等醇類均有利于BC生產(chǎn)[7,20-21]。本實(shí)驗(yàn)為探究葡糖醋桿菌利用黃水生物合成BC的可行性，將黃水按照不同稀釋比稀釋后作為培養(yǎng)基，再將葡糖醋桿菌接種培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)14 d，發(fā)酵結(jié)束后測定BC產(chǎn)量、BC產(chǎn)率、BC日均產(chǎn)量、還原糖消耗率、總酸含量、pH值等指標(biāo)，從而得到最佳的黃水稀釋比，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)一步探究黃水最佳稀釋比下發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)的變化趨勢，以及不同滅菌方式對BC產(chǎn)量及各項(xiàng)理化指標(biāo)的影響，從而為葡糖醋桿菌利用黃水發(fā)酵生產(chǎn)BC奠定理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)NZ9 六尺巷酒業(yè)有限公司篩選并保藏；新鮮黃水 六尺巷酒業(yè)有限公司釀造一車間；對羥基苯苯甲酰肼 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、無水檸檬酸、十二水磷酸氫二鈉、瓊脂、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HS培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，無水檸檬酸1.13 g/L，Na2HPO45.0 g/L，pH 6.0，115 ℃滅菌20 min[22]。

PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃水理化性質(zhì)測定 從釀造車間黃水坑中取新鮮黃水10 L，于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。測定黃水總酸含量、pH、還原糖含量、乙醇含量。

總酸含量(以乙酸計(jì))的測定參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的方法(下同)；pH的測定參考GB 5009. 237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》中的方法(下同)；還原糖含量的測定[23]：采用對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)試劑法(下同)；乙醇含量的測定參考GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的方法。

1.2.2 不同黃水稀釋比例對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響 將黃水直接采用蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋比例依次為(黃水∶水，體積比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，調(diào)節(jié)pH為6.0，將50 mL培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌20 min。以HS培養(yǎng)基為對照組，按照10%的接種量將經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)的葡糖醋桿菌NZ19分別接種于以上培養(yǎng)基中，輕輕振蕩，置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的總酸含量、pH、還原糖消耗量、還原糖消耗率、BC產(chǎn)量、BC平均日產(chǎn)量、BC產(chǎn)率。

1.2.2.1 還原糖消耗量及消耗率 計(jì)算公式如下：

1.2.2.2 BC產(chǎn)量的測定 參考文獻(xiàn)[21]，將發(fā)酵液中生成的BC膜用純水沖洗浸泡多次，至顏色較淡，再將BC膜置于80 ℃氫氧化鈉(1 mol/L)溶液中浸泡90 min，然后再置于80 ℃蒸餾水中洗滌至中性，置于烘箱中75 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量。BC產(chǎn)量、平均日產(chǎn)量及產(chǎn)率計(jì)算公式如下：

1.2.3 發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)的變化 選擇1.2.2中BC產(chǎn)量最高時(shí)的黃水稀釋比例，配制培養(yǎng)基，將50 mL培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌NZ19接種到培養(yǎng)基中，以HS培養(yǎng)基作對照，輕輕振蕩，置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的總酸含量、pH、剩余還原糖含量、還原糖消耗率、BC產(chǎn)率及BC產(chǎn)量。

這樣一來，中糧改變了傳統(tǒng)的糧食貿(mào)易中間商角色，發(fā)揮起了龍頭企業(yè)市場優(yōu)勢、物流優(yōu)勢、規(guī)模優(yōu)勢，把農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和物流、加工環(huán)節(jié)對接起來，成為農(nóng)業(yè)生態(tài)圈的有機(jī)組織者，鏈接起小農(nóng)戶和大市場。形象地說，這就是打通線上線下全產(chǎn)業(yè)鏈的“糧圈兒”。2017年，中糧“糧食銀行+”體系涉地面積40萬公頃，惠及約41萬戶農(nóng)民，帶動(dòng)農(nóng)民增收5949萬元。

1.2.4 不同過濾除菌方法對BC產(chǎn)量及理化指標(biāo)的影響 將配制好的培養(yǎng)基用0.22 μm濾頭在無菌條件下過濾至已滅菌的錐形瓶中，然后將50 mL無菌培養(yǎng)基分裝于250 mL無菌錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌NZ19接種到培養(yǎng)基中，以HS培養(yǎng)基作對照，輕輕振蕩，置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的總酸含量、pH、BC產(chǎn)率及BC產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖表分析由Excel 2010完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水成分分析

將從釀造車間取回的新鮮黃水于4 ℃冰箱靜置過夜，待黃水清澈后取上層黃水檢測總酸含量、pH、還原糖含量、乙醇含量，檢測結(jié)果見表1。

從表1可知，新鮮黃水中含有還原糖12.43 g/L、總酸5.85 g/L以及乙醇3.61%。由此可知黃水中含有豐富的營養(yǎng)成分。王傳榮[24]指出黃水中含有較多可發(fā)酵性糖，以及發(fā)酵降解和酵母細(xì)胞自溶而得來的蛋白質(zhì)和氨基酸等，這些碳水化合物和含氮化合物是微生物良好的營養(yǎng)物質(zhì)。在傳統(tǒng)BC發(fā)酵培養(yǎng)基HS培養(yǎng)基中，合成細(xì)菌纖維素的前體物質(zhì)主要來源于葡萄糖，營養(yǎng)物質(zhì)則來源于蛋白胨、酵母浸粉等。因此，黃水中可供葡糖醋桿菌生長和BC合成的營養(yǎng)物質(zhì)基本可以與HS培養(yǎng)基基本相當(dāng)。馬霞等[25-26]研究表明混合糖和有機(jī)酸(乙酸、檸檬酸)能夠提高BC產(chǎn)量。張麗平等[27]研究結(jié)果表明乙醇、有機(jī)酸等多種混合碳源有利于菌株發(fā)酵合成BC。李周等[21]研究表明利用黃水-HS培養(yǎng)基靜態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)BC是可行的。因此，白酒釀造副產(chǎn)物黃水具有生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品BC的潛在價(jià)值。

表1 黃水的理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Detection results of physicochemical indexes of“yellow water”

2.2 不同黃水稀釋比例對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響

為探究不同黃水稀釋比對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響，直接將經(jīng)過夜低溫靜置處理的上層黃水按照不同稀釋比例用純水進(jìn)行稀釋，調(diào)節(jié)pH 6.0經(jīng)滅菌后作為BC靜置發(fā)酵培養(yǎng)基(未添加任何外源營養(yǎng)物質(zhì))。不同黃水稀釋比對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液中還原糖消耗率的影響情況如圖2所示。

圖2 黃水體積比對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和還原糖消耗率的影響Fig.2 Effect of dilution ratio of "yellow water" on bacterial cellulose yield and reducing sugar consumption ratio

隨著黃水稀釋比的減小，BC產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)以純水為培養(yǎng)基時(shí)，其仍有BC合成(0.26 g/L)，合成BC的營養(yǎng)物質(zhì)完全來自接種培養(yǎng)基，這表明葡糖醋桿菌可以利用較低濃度葡萄糖合成BC。其當(dāng)黃水稀釋比為2∶8時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最高值(2.42 g/L)，比對照組的HS培養(yǎng)基BC產(chǎn)量(1.58 g/L)提高了53.2%。這表明黃水稀釋比為2∶8時(shí)最適合BC的合成，此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)達(dá)到最佳比例。由于黃水中含有豐富的碳源和碳源，其中還原糖、乙酸、乳酸等均能提高BC產(chǎn)量[21]。同時(shí)由于黃水中還含有大量的可溶性淀粉，其能適當(dāng)增加發(fā)酵液的黏度，防止菌體與細(xì)菌纖維素之間的交聯(lián)凝聚，從而使得BC的產(chǎn)量提高[28]。當(dāng)黃水稀釋比超過2∶8后，隨著稀釋比例的下降，BC產(chǎn)量逐漸下降；當(dāng)黃水未經(jīng)稀釋時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)生BC，且稀釋比越低，BC產(chǎn)量下降越明顯。這表明黃水中雖然含有葡萄糖、乳酸等有利于葡糖醋桿菌合成BC的物質(zhì)，但同樣也含有其他對葡糖醋桿菌生長和抑制BC合成的抑制劑(如糠醛、單寧等)[21,29-30]，當(dāng)黃水稀釋比例越低，有毒物質(zhì)的含量越高，對葡糖醋桿菌的毒害作用越大；同時(shí)黃水稀釋比例越低，其含有的酸類物質(zhì)濃度越多，調(diào)節(jié)pH時(shí)消耗的NaOH量就越多，導(dǎo)致培養(yǎng)基集中Na+濃度越高，高離子強(qiáng)度也會(huì)抑制葡糖醋桿菌的生長和BC的生物合成[31]。以上這些因素都可能是當(dāng)黃水稀釋比過低時(shí)制約BC合成的原因。隨著黃水稀釋比例的下降，還原糖消耗率逐漸下降，且都顯著低于對照組(78.53%)。當(dāng)黃水稀釋比在1∶9～3∶7時(shí)，還原糖消耗量均維持在66%左右。在黃水稀釋比例為0時(shí)(未稀釋)，此時(shí)培養(yǎng)基中雖然沒有BC的生成，但是仍有少量(2.21%)的還原糖被消耗，可能是因?yàn)榻臃N后葡糖醋桿菌雖然受到培養(yǎng)基中高抑制劑和高鹽濃度的抑制而沒有合成BC，但菌體仍進(jìn)行了緩慢的生長繁殖，從而消耗了少量的還原糖。以上結(jié)果表明，將黃水進(jìn)行合適的稀釋后，相對于傳統(tǒng)HS培養(yǎng)基能夠明顯提高BC產(chǎn)量，且稀釋比2∶8時(shí)，BC產(chǎn)量最高。

檢測不同黃水稀釋比培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的BC產(chǎn)率、還原糖消耗量、總酸含量、pH以及BC平均日產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，隨著黃水稀釋比降低，BC產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且所有實(shí)驗(yàn)組BC產(chǎn)率都顯著高于對照組(10.27%)。BC產(chǎn)率高，表明葡糖醋桿菌消耗相同的還原糖能產(chǎn)生更多的BC。隨著黃水稀釋比例降低，BC平均日產(chǎn)量、還原糖消耗量也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。還原糖消耗量高，而BC產(chǎn)量不高主要是因?yàn)槠咸谴讞U菌在消耗葡萄糖合成BC的同時(shí)，又將葡萄糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖酸和其他酸[31-32]。當(dāng)稀釋比為2∶8時(shí)，BC產(chǎn)率和平均日產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為93.77%，0.174 g·d-1·L-1，相比對照組分別提高了813.05%，53.98%。隨著黃水稀釋比降低，發(fā)酵液中酸度和pH逐漸升高；發(fā)酵結(jié)束后黃水稀釋發(fā)酵液pH均在4.39～5.85之間，均顯著高于對照組(pH3.59)(P<0.05)。Keshk等[33]研究表明葡糖醋桿菌生物合成最適pH為4.0～6.0。葡糖醋桿菌以葡萄糖等還原糖作為碳源發(fā)酵合成BC時(shí)，會(huì)通過自身酶系將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟撬岷推渌袡C(jī)酸[34]，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，葡萄糖酸等逐漸積累，使發(fā)酵培養(yǎng)基pH降低[35]，一旦培養(yǎng)基pH降低到葡糖醋桿菌可耐受pH以下，就會(huì)導(dǎo)致菌體代謝活性以及數(shù)量降低，最終導(dǎo)致細(xì)BC產(chǎn)量下降[36]。稀釋黃水培養(yǎng)基中含有大量有機(jī)酸，在以NaOH調(diào)節(jié)pH后會(huì)形成大量強(qiáng)堿弱酸鹽，這些鹽類在培養(yǎng)基中能起到一定的緩沖作用，防止BC合成過程中培養(yǎng)液pH快速下降[21]。同時(shí)黃水中糖類、有機(jī)酸、醇類等豐富的碳源，能減少葡萄糖酸的產(chǎn)生，這樣既能維持培養(yǎng)液pH穩(wěn)定，又能促使培養(yǎng)基中的還原糖合成BC，從而提高BC產(chǎn)率[26]。

表2 不同黃水稀釋比培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束后理化性質(zhì)的比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of medium with different "yellow water dilution ratio" after fermentation

結(jié)果表明，適當(dāng)黃水稀釋比例可以使發(fā)酵液的pH維持在BC合成最佳范圍內(nèi)，從而有利BC的生物合成，并提高BC產(chǎn)率。當(dāng)黃水稀釋比為2∶8時(shí)，BC產(chǎn)量和BC產(chǎn)率均為最高，因此選擇最佳黃水稀釋比為2∶8進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 最佳稀釋比例培養(yǎng)基發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量及理化指標(biāo)變化

將10%葡糖醋桿菌種子液分別接種于2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基和HS培養(yǎng)基中，30 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)，每兩天取樣測定BC產(chǎn)量和還原糖含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過程中剩余還原糖含量和BC產(chǎn)量Fig.3 Reducing sugar content and BC yield during fermentation

由圖3可知，HS培養(yǎng)基中BC產(chǎn)量在第10 d達(dá)到最大值(1.51 g/L)，2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基BC產(chǎn)量在第6 d達(dá)到最大值(2.38 g/L)，較HS培養(yǎng)基提前4 d達(dá)到最高產(chǎn)量，同時(shí)產(chǎn)量也提高了57.62%。HS培養(yǎng)基與2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基中剩余還原糖含量隨著發(fā)酵進(jìn)程的進(jìn)行，均呈現(xiàn)逐漸較少的趨勢，HS培養(yǎng)基與2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基均在第10 d還原糖含量最低，分別為3.88、1.36 g/L，其中HS培養(yǎng)基中前4 d還原糖含量下降速度最快。結(jié)果表明2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基中的葡糖醋桿菌能更快更多地合成BC，這可能是因?yàn)辄S水含有豐富的營養(yǎng)成分，能促進(jìn)葡糖醋桿菌的快速繁殖，加快BC的生物合成，從而使培養(yǎng)基中的BC產(chǎn)量快速達(dá)到較高水平[21]。同時(shí)2∶8稀釋比黃水培養(yǎng)基中消耗更少的還原糖產(chǎn)生更多的BC，這表明葡糖醋桿菌利用了黃水中還原糖以外的其他物質(zhì)合成BC。

從表3可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，HS培養(yǎng)基和2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基中BC產(chǎn)率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，均在第6 d達(dá)到最大產(chǎn)率，分別為9.39%和94.16%，2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基BC產(chǎn)率較HS培養(yǎng)基提高了9.35倍。HS培養(yǎng)基和2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基中還原糖消耗率都呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，且HS培養(yǎng)基中的還原糖消耗率均高于同時(shí)期2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基。2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基相對于HS培養(yǎng)基中消耗了更少還原糖而產(chǎn)生了更多的BC，這與圖2的結(jié)論一致，原因之一是黃水提供了除還原糖以外其他可以促進(jìn)或用于葡糖醋桿菌生長和合成BC的營養(yǎng)物質(zhì)或其前提物質(zhì)，這也解釋了2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基中BC產(chǎn)率達(dá)到90%以上的原因。在整個(gè)發(fā)酵過程中，HS培養(yǎng)基中總酸含量逐漸增加，pH逐漸降低，最后降至3.59；而2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基總酸先增加后降低，pH在第6天時(shí)降至最低，后波動(dòng)上升，發(fā)酵終pH為4.82，說明2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基的pH更加穩(wěn)定，在整個(gè)發(fā)酵過程中都在葡糖醋桿菌生物合成BC的最適pH范圍內(nèi)(pH4.0～6.0)[33]。Kuo等[31]指出，雖然葡糖醋桿菌可以利用多種糖來合成BC，但葡萄糖等還原糖對BC的轉(zhuǎn)化率很低，主要是因?yàn)槠咸烟敲摎涿肝挥诩?xì)胞膜上，也將葡萄糖等還原糖轉(zhuǎn)化為細(xì)胞外產(chǎn)生葡萄糖酸，從而降低培養(yǎng)物的pH，最終使BC的生物合成受到阻礙，這從另一方面也解釋了HS培養(yǎng)基中糖消耗率高而BC產(chǎn)量較低的原因。2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基的pH更加穩(wěn)定主要原因可能是雖然葡糖醋桿菌在合成BC的過程中伴隨著葡糖糖酸等有機(jī)酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，但黃水中的乳酸、乙酸等有機(jī)酸及其鹽類能夠起到很好的緩沖作用，避免BC合成過程中發(fā)酵液pH出現(xiàn)快速下降，使培養(yǎng)過程保持在合成BC最佳pH范圍內(nèi)，從而顯著提高BC產(chǎn)量[31]。黃水中的乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸及鹽除了起到緩沖作用之外，這些酸類也能夠進(jìn)入三羧酸循環(huán)或通過經(jīng)過糖異生途徑合成葡萄糖等方式促進(jìn)BC合成[37-38]。因此，綜合發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量、糖消耗率、pH和酸度來看，2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基要優(yōu)于HS培養(yǎng)基，黃水組分起到了良好的緩沖作用和提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。

2.4 培養(yǎng)基不同滅菌方式對BC產(chǎn)量及理化指標(biāo)影響

為探究培養(yǎng)基不同滅菌方式對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液理化指標(biāo)的影響，分別將2∶8黃水稀釋培養(yǎng)基采用濕熱高壓滅菌和常溫過濾滅菌后，將10%葡糖醋桿菌種子液分別接種于兩種培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)14 d，然后測定相應(yīng)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，過濾除菌培養(yǎng)基BC產(chǎn)量(3.19 g/L)顯著(P<0.05)高于濕熱高壓滅菌(2.38 g/L)，BC產(chǎn)量提高了34.03%；過濾除菌培養(yǎng)基BC產(chǎn)率(107.56%)顯著(P<0.05)高于濕熱高壓滅菌(92.32%)，BC產(chǎn)量和產(chǎn)率提高了34.03%和16.51%。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液酸度和pH無明顯差異。

高溫滅菌造成培養(yǎng)基中的乙醇和乙酸等可揮發(fā)性物質(zhì)損失較大，而過濾除菌對培養(yǎng)基中乙醇和乙酸損失影響較小。Li等[39]指出乙醇氧化所產(chǎn)生的ATP是戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而使代謝流量更多的向BC合成方向流入。Sakurai等[40]研究結(jié)果也表明葡萄醋桿菌能利用乙醇作為碳源。Hyun等[41]研究也表明，乙醇既可用作為BC合成的碳源，同時(shí)低濃度時(shí)還會(huì)減少葡糖醋桿菌陽性菌突變成不產(chǎn)纖維素陽性菌的概率，并最終提高BC產(chǎn)量。馬霞等[26]研究表明，低濃度的乙酸可彌補(bǔ)葡萄糖降解生成ATP的那部分能量，使得葡萄糖轉(zhuǎn)化為纖維素的量增加。Mohammadkazemi等[37]研究表明乙酸可以被活化成乙酰輔酶A進(jìn)入乙醛酸途徑，經(jīng)糖異生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。張麗平等[27]研究也發(fā)現(xiàn)乙酸對木醋桿菌合成BC有促進(jìn)作用。同時(shí)，培養(yǎng)基中的乙酸與其他弱酸鹽還能起到很好的pH緩沖作用，避免BC合成過程中產(chǎn)生的葡萄糖酸等酸性物質(zhì)使得培養(yǎng)基pH急劇下降影響B(tài)C的合成。以上這些結(jié)果充分表明了不同滅菌方式對提升BC產(chǎn)量有顯著作用，培養(yǎng)基過濾滅菌方式使乙醇、乙酸等揮發(fā)性成分損失較少，而這些揮發(fā)性成分既有助于BC的合成，又能為BC的合成提供良好的緩沖環(huán)境，最終使得過濾滅菌培養(yǎng)基中BC產(chǎn)量明顯高于高壓滅菌方式。

表3 培養(yǎng)基pH、總酸含量、BC產(chǎn)率及還原糖消耗率的變化Table 3 Changes of pH,total acid content,BC yield and reducing sugar consumption of medium

表4 不同滅菌方式對BC產(chǎn)量及理化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different sterilization methods on BC yield and physicochemical indexes

3 結(jié)論

黃水雖然酸度高且pH低，但其含有豐富的營養(yǎng)成分，具有極大的利用價(jià)值。將黃水用水進(jìn)行稀釋制成不同培養(yǎng)基，然后在不同培養(yǎng)基中接種葡糖醋桿菌靜置發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定BC產(chǎn)量和BC產(chǎn)率等理化指標(biāo)。結(jié)果表明，黃水最佳稀釋比為2∶8，此時(shí)BC產(chǎn)量最高(2.42 g/L)，比對照組HS培養(yǎng)基BC產(chǎn)量(1.58 g/L)提高了53.2%；BC產(chǎn)率為93.77%，比對照組提高了813.05%。同時(shí)發(fā)酵結(jié)束(14 d)后還原糖消耗率和剩余還原糖含量分別為64.84%和1.36 g/L，均低于同時(shí)期的對照組。在不同滅菌方式培養(yǎng)基中，過濾滅菌培養(yǎng)基中BC產(chǎn)量為3.19 g/L，BC產(chǎn)率為107.56%，較高壓濕熱滅菌方式均有明顯提高。因此，以黃水為唯一營養(yǎng)源作為培養(yǎng)基，既能提高BC產(chǎn)量，又降低了BC生產(chǎn)成本，同時(shí)也為黃水的開發(fā)利用和BC的生產(chǎn)提供了新的途徑。