SNX10 在石骨癥中的分子機(jī)制研究進(jìn)展*

周衛(wèi)軍 唐尚坤 沈曄 陳敏杰

石骨癥（osteopetrosis）又稱骨硬化癥，是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，是由于骨吸收障礙導(dǎo)致的骨密度增加為主要特征的全身性疾病。根據(jù)遺傳形式，石骨癥可以分為3 種類型：常染色體隱性遺傳（autosomalrecessive osteopetrosis，ARO）、常染色體顯性遺傳（autosomal dominant osteopetrosis，ADO）和伴X 染色體遺傳[1]。本文將從ARO 型石骨癥的主要臨床表現(xiàn)出發(fā)，并著重以分選連接蛋白10 型（sorting nexin 10，SNX10）突變引起的ARO 型為例，闡述其研究現(xiàn)狀。

ARO 的發(fā)病率約為25 萬(wàn)分之一，并且存在地域性與遺傳性差異，在特定的地區(qū)與人群中，ARO 有著相對(duì)較高的發(fā)病率。ARO 也被稱作惡性嬰兒型，大多數(shù)患者發(fā)病于出生后數(shù)月，此類嬰兒的壽命在10 年以內(nèi)，少數(shù)可以達(dá)到20年以上。而ADO 的發(fā)病率相對(duì)較低，多于青少年或者成年時(shí)期發(fā)病。ADO 的發(fā)病嚴(yán)重程度呈現(xiàn)了較高的可變性，輕者無(wú)癥狀，故又稱溫和型，但也有少數(shù)兒童時(shí)期即起病的患者，其表型常常較為嚴(yán)重[2]。相比之下，伴X 染色體遺傳的石骨癥是極其罕見(jiàn)的[3-6]。

根據(jù)發(fā)病機(jī)制，石骨癥分為兩種類型：一種為OCL 缺少型，主要影響OCL 的分化過(guò)程，涉及此型的主要基因突變類型有RANK、RANKL；另一種為OCL 豐富型，主要影響OCL 的溶骨功能，涉及此型的主要基因突變類型有TCIRG1、CLCN7、SNX10、OSTM1、PLEKHM1、CAII，其中SNX10 是參與OCLV-ATP 酶囊泡運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白[7]。作為一種最新被發(fā)現(xiàn)的ARO 相關(guān)基因，近些年來(lái)，若干SNX10 突變型石骨癥病例被陸續(xù)報(bào)道，其突變類型也被依次闡明。盡管如此，對(duì)于SNX10 突變型石骨癥的機(jī)制研究尚不完全清楚，這對(duì)該型石骨癥患者的治療及預(yù)后的改善至關(guān)重要。因此，本文將對(duì)SNX10 分子機(jī)制做一綜述。

1 SNX10 的結(jié)構(gòu)及功能

SNXs 家族包含30 多個(gè)成員，均含有PX 結(jié)構(gòu)域。該家族蛋白通過(guò)PX 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合特定的磷酸化磷脂酰肌醇（phosphorylated phosphatidylinositols，PIs），并將蛋白質(zhì)靶向富含PI 的膜，從而參與蛋白質(zhì)分選、運(yùn)輸和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。其中，SNX10 是該家族中一種僅含有PX 結(jié)構(gòu)域的蛋白[8-10]，其表達(dá)產(chǎn)物在胞質(zhì)、內(nèi)小體膜、外周膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)側(cè)、細(xì)胞骨架、微管組織中心、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等處都有分布[11]。

SNX10 在RANKL 誘導(dǎo)的破骨分化過(guò)程中高表達(dá)，其中最主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞核。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，SNX10與TRAP、MMP-9 存在共定位，并且SNX10 還參與MMP-9的分泌（具有降解胞外基質(zhì)作用）[11]。此外，在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中沉默OCL 的SNX10 基因后發(fā)現(xiàn)，破骨特異性的基因表達(dá)明顯下降（TRAP、CTsk 及MMP-9）[12]。SNX10 與V-ATP酶也存在相互作用，介導(dǎo)了V-ATP 酶通過(guò)囊泡運(yùn)輸發(fā)揮作用[13]。再者，SNX10 可能參與褶皺邊界（OCL 骨吸收功能區(qū)）的形成。在對(duì)最新一種SNX10 突變亞型的病例分析顯示，患者破骨骨吸收功能出現(xiàn)障礙，但是OCL 的分化與肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成均正常，猜想這可能與SXN10 突變導(dǎo)致褶皺邊界形成障礙有關(guān)[14]。綜上所述，SNX10 在OCL 的囊泡運(yùn)輸、內(nèi)小體穩(wěn)態(tài)及破骨骨吸收中有著重要作用。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)，SNX10 全身敲除還對(duì)小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)生、發(fā)展有影響。由于OCL的成熟與分化是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨損傷的主要因素之一，因此抑制OCL 的活動(dòng)理論上可以在一定程度上緩解RA 的進(jìn)展。具體來(lái)說(shuō)，SNX10 敲除主要導(dǎo)致了密閉功能區(qū)（sealing zone）的破壞，以及TRAP、CTSK 和MMP-9 分泌減少，以上癥狀均可以通過(guò)過(guò)表達(dá)SNX10 改善。對(duì)其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SNX10 敲除造成了內(nèi)小體的過(guò)度酸化，從而加速了NFATc1的降解。然而，NFATc1 含量的下降影響了整合素3（肌動(dòng)蛋白帶形成的關(guān)鍵因子）及其下游蛋白的表達(dá)，如c-Src 和PYK2 的活動(dòng)。這一系列的機(jī)制導(dǎo)致的OCL 功能的障礙，說(shuō)明了SNX10 在破骨重吸收中發(fā)揮了重要作用[15]。

除了在OCL 中的作用，SNX10 還存在其他組織表達(dá)。其中，胃壁細(xì)胞也高表達(dá)SNX10。當(dāng)SNX10 發(fā)生突變時(shí)，胃液pH 上升，鈣吸收出現(xiàn)障礙，游離血鈣降低，進(jìn)而導(dǎo)致了兩種疾病表現(xiàn)：石骨癥（OCL 功能障礙）、佝僂?。ㄢ}吸收障礙）。研究發(fā)現(xiàn)，全身SNX10 敲除的小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重石骨癥癥狀，如嚴(yán)重生長(zhǎng)滯后、牙齒萌出障礙、高骨骼密度，以及骨髓腔的缺損，并且合并嚴(yán)重的佝僂病癥狀（如低血鈣、高PTH）。這種綜合石骨癥與佝僂病的合并癥，也叫作石骨癥化佝僂?。╫steopetrorickets），是一種全身正鈣平衡下的骨質(zhì)鈣化不足的疾病，其發(fā)病可能與OCL 失去維持鈣磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力有關(guān)。此外，此類全敲除小鼠還出現(xiàn)了消化道畸形（主要是胃）：出血性壞死、胃壁細(xì)胞受損、胃pH上升。在外源性給予鈣劑后，以上消化道癥狀有所改善。然而，在SNX10 的OCL 條件性敲除的小鼠中情況完全不同，僅僅出現(xiàn)了石骨癥表現(xiàn)，而無(wú)佝僂病癥狀（低血鈣、消化道畸形等），這就印證了SNX10 在不同組織存在特異性表達(dá)，并且發(fā)揮不同的功能。其中，SNX10 表達(dá)于胃壁細(xì)胞中，參與胃的泌酸作用與鈣的吸收；而表達(dá)于OCL 中，參與破骨骨吸收過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的SNX10 過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，反面印證了該觀點(diǎn)。無(wú)論是全身性敲除，還是條件性敲除SNX10的小鼠，其石骨癥或石骨癥佝僂病的癥狀都通過(guò)過(guò)表達(dá)SNX10 得到大幅度改善[8，16-18]。

Stein 等[19]新構(gòu)建了還原人R51Q 突變的ARO 小鼠模型，該模型鼠并未患有石骨癥性佝僂病，即胃內(nèi)pH 以及血Ca2+、PTH 水平都是正常的，僅表現(xiàn)出：顯著增高的骨量，骨髓腔嚴(yán)重狹小，嚴(yán)重的牙齒萌出受限。此外，組織細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)，R51Q 小鼠股骨和椎骨OCL 數(shù)量與吸收面積顯著減少；后在R51Q 小鼠脾臟來(lái)源的破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)其褶皺邊界形成障礙、吸收區(qū)酸化不足；然而，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原交聯(lián)C 端肽（CTX）水平是正常的，說(shuō)明可能CTX 不能很好反映體內(nèi)的骨吸收，因此進(jìn)一步對(duì)成骨研究發(fā)現(xiàn)：骨細(xì)胞數(shù)量是正常甚至增加的、但是成骨水平并沒(méi)有明顯變化。這就從側(cè)面提示，該變化（吸收區(qū)酸化不足）可能與OCL 功能不足相關(guān)。

除此以外，SNX10 還能增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力。SNX10通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中mon1-ccz 1 復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了rab5和rab7 的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而誘導(dǎo)早期內(nèi)小體的成熟，最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞的成熟，從而增強(qiáng)了小鼠的抗感染能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠在李司特氏菌感染后，SNX10 表達(dá)明顯上調(diào)。同樣的結(jié)果在SNX10 全敲的小鼠中得到呈現(xiàn)，該類小鼠死亡率較高、出現(xiàn)更嚴(yán)重的菌血癥和肝脾損傷，而過(guò)表達(dá)SNX10 后，小鼠的抗感染能力明顯增強(qiáng)[20]。

2 已知SNX10 突變類型

目前研究發(fā)現(xiàn)，SNX10 突變型ARO 多種類型的突變，其中大多數(shù)突變都是作用于SNX10 的PX 結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，從而影響了蛋白間或蛋白與脂質(zhì)的相互作用。

2.1 c.46C＞T（g.69102C＞T）

2012 年，研究者在3 個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的巴勒斯坦籍的ARO患者中發(fā)現(xiàn)了SNX10 的突變——Arg16Leu，Arg 坐落于1鏈上，是發(fā)生在外顯子3（高度保守殘基）中的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)早終止，從而影響了SNX10分子二聚體的形成[21]。

2.2 c.95A＞C（Tyr32Ser）

（g.69151A＞C）目前已有3 個(gè)不同家庭的病例，都具有正常的父母和兄弟。坐落于Tyr32 2 鏈，是 折疊與 螺旋連接的疏水內(nèi)核，該突變將影響PX結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)與相鄰 折疊的結(jié)構(gòu)，因此影響了蛋白的相互作用及與磷酸基團(tuán)的結(jié)合[22]。

2.3 c.111+5G＞C

（g.69746G＞C）是SNX10 外顯子3 上的一種突變[22]。

2.4 c.212+1G＞T（g.72742G＞T）

2013 年，首次由Pangrazio 在3 個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的瑞典家庭發(fā)現(xiàn)[22]。由于SNX10 c.212+1G＞T 突變?cè)斐傻耐怙@子4 隱匿剪接位點(diǎn)激活與異常剪接。從而干擾細(xì)胞內(nèi)皺褶邊界的形成而導(dǎo)致OCL 功能失調(diào)。2017 年，科學(xué)家首次通過(guò)一位41歲女性患者的真皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化出了攜帶此類純合突變誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induction pluripotent stem cells，iPSCs），這是今后研究SNX10 突變型ARO 極其重要的基礎(chǔ)[23]。

2.5 c.152 G＞C（Arg51Pro）

（g.72681G＞C）是SNX10 外顯子3 上的一種突變。Arg51結(jié)合于相鄰1 與3 折疊間，該突變將改變了PX 結(jié)構(gòu)域主鏈構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白相互作用的障礙，對(duì)患者OCL分離研究發(fā)現(xiàn)：廣泛性細(xì)胞質(zhì)空泡化、突變體SNX10 的亞細(xì)胞異常分布以及細(xì)胞重吸收功能障礙[24]。

2.6 c.43delG（Val15Phe）

2016 年，Akbar 首次在一個(gè)近交家庭發(fā)現(xiàn)了此突變，育有一兒一女?；疾∧泻⑺烙? 歲，然而女孩活了17 歲。外顯子2 上的鳥苷酸缺失，導(dǎo)致移碼突變，造成在缺失點(diǎn)后的第30 個(gè)氨基酸處過(guò)早終止翻譯[25]。

2.7 c.24+36T＞A 及c.112-84G＞A

2019 年，在對(duì)土耳其患者的Sanger 測(cè)序分析，驗(yàn)證了該患者內(nèi)含子3 以及內(nèi)含子4 上突變的存在[26]。

2.8 c.284G＞A（Arg95His）

2016 年，全外顯子測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，一種新型SNX10純合突變——（Arg95His）被闡明[27]。

3 SNX10 相關(guān)ARO 臨床案例

相關(guān)臨床案例如表1-3 所示。

表1 SNX10 Exon3 c.152 G＞A 突變案例[24]

表2 SNX10 c.212+1G＞T 突變病例[14，22，24-25]

表3 SNX10 其他突變病例[21，25，27]

4 目前的治療方法――HSCT

由于OCL 是單核巨噬細(xì)胞來(lái)源的髓系細(xì)胞，因此造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前針對(duì)OCL 導(dǎo)致的石骨癥唯一有效的治療方法，但需要在明確診斷后盡早進(jìn)行。目前已有幾例成功的案例[28-29]（見(jiàn)表4）。此外，需要注意的是，HSCT 有嚴(yán)格的手術(shù)指征與禁忌證——并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的患者不適合HSCT治療，因?yàn)樯窠?jīng)退行并非繼發(fā)于骨骼變化，因此對(duì)于確診的SNX10 突變患者，HSCT 前同樣需要進(jìn)行嚴(yán)格的MRI 和腦電圖檢測(cè)，排除此類情況[1]。

根據(jù)Stepensky 等[28]的研究，HSCT 的療效如下：存活率為6/7，移植后現(xiàn)存平均年齡4 歲（小至1 歲，大至8 歲），患者的臨床狀況與生活質(zhì)量得到較大改善，尤其是血液異常改善顯著（不再需要輸血或血小板）。其中5 位患者在移植后1 個(gè)月，查體中性粒細(xì)胞＞0.5×109/L，血小板為20×109/L?；颊叩囊暳吐?tīng)力也得到較大提高。所有患者的骨密度和骨變形在數(shù)月和數(shù)年間都有改善，移植后1 年幾乎沒(méi)有病理性骨折發(fā)生，能正常生活和工作。術(shù)后并發(fā)癥：①排異反應(yīng)。1 位患者移植后出現(xiàn)了排異反應(yīng)移植，后多次移植。最終在3 次移植后，死于巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染和肺動(dòng)脈高壓；1 位患者術(shù)后出現(xiàn)了2-3 級(jí)急性移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD），治療后好轉(zhuǎn)。②感染性并發(fā)癥。5 位患者出現(xiàn)細(xì)菌敗血癥或菌血癥、3 位出現(xiàn)了CMV 活動(dòng)、1 位出現(xiàn)EBV 活動(dòng)。此外，高鈣血癥、病理性骨折偶爾可見(jiàn)。

HSCT 的治療效果在多位患者中得到印證（見(jiàn)表4）。①R51Q 突變的男孩，患者骨折、矮小、額骨隆起、一側(cè)失明、脾腫大被確診為ARO，HSCT 后恢復(fù)良好，并已經(jīng)能夠恢復(fù)學(xué)業(yè)[28]。②純合70kb SNX10 缺失的女孩，9 歲出現(xiàn)右側(cè)股骨骨髓炎，伴有廣泛骨密度增加，測(cè)序提示7p15.2上70kb 缺失突變型ARO，并于13 歲出現(xiàn)止痛劑無(wú)效的嚴(yán)重骨痛。行HSCT 治療，疼痛逐漸減輕，骨密度明顯改善。術(shù)后2 年，血液及影像學(xué)檢查正常[29]。

表4 SNX10 型ARO 的HSCT 前后對(duì)比[28-29]

5 總結(jié)

石骨癥是一種罕見(jiàn)的、具有遺傳異質(zhì)性的骨硬化疾病，其中SNX10 突變型是一種新發(fā)現(xiàn)的常染色體隱性遺傳型石骨癥。鑒于該型石骨癥高度嬰兒致死性與較高發(fā)病率以及對(duì)于新型基因SNX10 研究的不足，因此研究SNX10 突變型ARO 具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義[1，7]。隨著對(duì)SNX10 結(jié)構(gòu)功能的揭示，SNX10 型石骨癥的發(fā)病機(jī)制將會(huì)更加明了，這也為日后診治工作打下了基礎(chǔ)。