可注射生物降解型復(fù)合淀粉水凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損的應(yīng)用研究*

李鵬 劉慧玲 吳康 林瀟楊磊，3

骨關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的臨床疾病，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量[1]。據(jù)報(bào)道，全球約5%的人因骨性關(guān)節(jié)炎造成嚴(yán)重的痛苦，給患者和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的壓力和負(fù)擔(dān)[2]。2016 年，中國(guó)膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率為8.1%，即大約有1.1 億的患者[3]。此外，暴力擠壓或撕裂以及長(zhǎng)期大運(yùn)動(dòng)量、高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)均可對(duì)骨關(guān)節(jié)造成慢性磨損[4]。關(guān)節(jié)疾病周期可長(zhǎng)達(dá)幾十年并逐漸惡化，致殘率可達(dá)53%[5]。

通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射方式對(duì)關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。目前臨床上常用的醫(yī)用透明質(zhì)酸注射液在關(guān)節(jié)腔內(nèi)降解速度過(guò)快，需要多次反復(fù)注射[6-7]，而且不具備骨-軟骨修復(fù)的作用。因此，亟需開(kāi)發(fā)一類(lèi)降解速率適中，且具有骨-軟骨修復(fù)能力的可注射材料用于關(guān)節(jié)面保護(hù)和骨-軟骨缺損修復(fù)。本研究目標(biāo)開(kāi)發(fā)一種可注射和可降解的復(fù)合淀粉水凝膠材料，并對(duì)水凝膠流變學(xué)性能、可注射性和降解性能進(jìn)行研究，通過(guò)大鼠軟骨細(xì)胞觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞增殖、相關(guān)基因表達(dá)的影響，最后評(píng)價(jià)該水凝膠在體內(nèi)修復(fù)骨-軟骨中的效果。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料

硅酸鈣（CaSiO3，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）、玉米淀粉[（C6H10O5） n，河南建杰實(shí)業(yè)有限公司]、四水硝酸鈣[Ca （NO3）2·4H2O，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司]、F-12 培養(yǎng)基（Dojindo 公司，日本）、胎牛血清（FBS，Gibco 公司，美國(guó)）、流變儀（AR2000，TA.Instruments，美國(guó)）、一次性注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）、Real-time PCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）、倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)（Carl Zeiss 公司，德國(guó)）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Biotek 公司，美國(guó)），醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉（HA，日本生化學(xué)株式公社，日本）。

1.2 復(fù)合淀粉水凝膠的制備

1.2.1 硅酸鈣溶液的制備

將5 g 硅酸鈣溶于50 mL 去離子水中并在37℃持續(xù)攪拌12 h，然后倒入50 mL 無(wú)菌離心管中，以3×103rpm 的速度在離心機(jī)上離心10min，取離心后的上清液倒入新的50mL無(wú)菌離心管中。用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，即可得到無(wú)菌的飽和硅酸鈣溶液（CS）。

1.2.2 復(fù)合淀粉水凝膠的制備

稱(chēng)量四水硝酸鈣倒入飽和硅酸鈣溶液燒杯中，制備0.05g/mL濃度的溶液，溶解后加入Waxy 淀粉，濃度為0.2 g/mL。60℃充分?jǐn)嚢?0～40 min，直到淀粉發(fā)生糊化變?yōu)闊o(wú)色透明狀，即得到復(fù)合淀粉水凝膠（14 CS Gel）。同時(shí)，用去離子水代替飽和硅酸鈣溶液制備淀粉水凝膠（14 Gel）。材料制備后用紫外線(xiàn)進(jìn)行輻照滅菌30 min 備用。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 復(fù)合淀粉水凝膠的流變學(xué)測(cè)試

本測(cè)試采用直徑為20 mm 的平行板，將水凝膠樣品的直徑和厚度調(diào)整為20 mm 和1 mm。流變學(xué)性能測(cè)試采用振蕩模式，在37℃、1%應(yīng)變下進(jìn)行頻率掃描測(cè)試，頻率范圍：0.1～100 Hz，測(cè)定力學(xué)數(shù)據(jù)并記錄。自愈合性能測(cè)試在37℃、1 Hz 頻率下，1%和500%交替應(yīng)變下進(jìn)行時(shí)間掃描測(cè)試，測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.3.2 復(fù)合淀粉水凝膠的注射性能

將復(fù)合淀粉水凝膠裝到帶有針頭（內(nèi)徑1.6 mm）的5mL注射器中，固定在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上，以10 mm/min 的恒定速度推注，直到以恒定的力值將水凝膠推出時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，記錄復(fù)合淀粉水凝膠在推注過(guò)程中的推注力隨時(shí)間變化曲線(xiàn)。

1.3.3 復(fù)合淀粉水凝膠的體外降解測(cè)試

采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）浸泡的方法測(cè)試復(fù)合淀粉水凝膠的體外生物降解性能。將烘至恒重的復(fù)合淀粉水凝膠樣品裝入15 mL 離心管，按照0.1 g/mL 濃度加入PBS 溶液，然后放置在37℃恒溫箱里浸泡，每2 d 換液，進(jìn)行10 d 的體外降解浸泡實(shí)驗(yàn)，測(cè)試浸泡不同時(shí)間后復(fù)合淀粉水凝膠樣品重量的變化，并計(jì)算其相對(duì)于原始水凝膠樣品重量損失的百分比，將其定義為水凝膠的降解率。

其中，W0是復(fù)合淀粉水凝膠初始重量，Wi是浸泡不同時(shí)間時(shí)所測(cè)得的復(fù)合淀粉水凝膠重量。

1.3.4 復(fù)合淀粉水凝膠的生物相容性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ECSU-2019000103），所需動(dòng)物從蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)。從幼年雄性Sprague Dawley 大鼠（月齡4 周）髖關(guān)節(jié)提取軟骨細(xì)胞。將復(fù)合淀粉水凝膠（14 CS Gel）、淀粉水凝膠（14 Gel）、硅酸鈣溶液（CS）、透明質(zhì)酸鈉（HA）以不含胎牛血清（FBS）的F-12 培養(yǎng)基、0.1 g/mL 濃度在37℃恒溫箱中浸提24 h，在各組材料的浸提液中加入10%FBS 和1%青鏈霉素，與細(xì)胞共培養(yǎng)1 d 和3 d，使用CCK-8 試劑對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定。即首先將孔板中的浸提培養(yǎng)液移除并用PBS 沖洗3 次，將CCK-8 原試劑與PBS 緩沖液按體積比1∶10 的比例配制成稀釋后的CCK-8 試劑，向96孔板每孔中加入110 L CCK-8 試劑，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育2 h。2 h 后，每孔取100 L 液體轉(zhuǎn)移至新96 孔板中，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)試其吸光率（OD）值，每組重復(fù)3 次，每次5 個(gè)復(fù)孔。然后根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率：

其中，A 是實(shí)驗(yàn)組吸光度，A0是對(duì)照組吸光度。

1.3.5 Live/Dead 染色觀(guān)察

選用24 孔板，將大鼠軟骨細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度種在24 孔板中，每孔加入2 mL 培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗3 次并加入不同材料的浸提液，放置到細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1 d和3 d，再向每孔加入現(xiàn)配的Live/Dead染劑（VPBS∶VA∶VB=2 000∶2∶1）250 L，避光培養(yǎng)20 min，棄去染色劑將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下拍照觀(guān)察。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR 實(shí)驗(yàn)

將軟骨細(xì)胞懸液按2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度種于6 孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后除去原培養(yǎng)基，分別加入F-12完全培養(yǎng)基、復(fù)合淀粉水凝膠（14 CS Gel）、淀粉水凝膠（14 Gel）、硅酸鈣溶液（CS）、透明質(zhì)酸鈉（HA）的浸提液。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 d 和3 d，吸出浸提液，用Trizol 裂解液裂解軟骨細(xì)胞，提取RNA，并做逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)軟骨相關(guān)基因SOX-9、Col-Ⅱ、Aggrecan（Agg）的表達(dá)；Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）為內(nèi)參。

1.3.7 大鼠膝關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將骨-軟骨缺損模型大鼠分為5 組，每組5 只，依次是：空白對(duì)照組（Control）、復(fù)合淀粉水凝膠組（14 CS Gel）、硅酸鈣溶液組（CS）、淀粉水凝膠組（14 Gel）和透明質(zhì)酸組（HA），其中對(duì)照組鉆孔后不放置任何材料，其他組用1 mL無(wú)菌注射器在造模部位注射0.1 mL 的上述材料。采用重量260～280 g、4 月齡的大鼠，術(shù)前禁食12 h、禁水4 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（0.5 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，大鼠重量260～280 g。待大鼠麻醉后行右下肢剃毛消毒處理并鋪洞巾，用無(wú)菌手術(shù)刀沿大鼠右膝髕骨內(nèi)側(cè)緣，做一約2cm的縱行切口，暴露膝髁間窩部位，用直徑2 mm 的手動(dòng)鉆頭做一直徑2 mm、深度2 mm 的骨-軟骨缺損，縫合韌帶與皮膚。待動(dòng)物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，保證大鼠自由活動(dòng)，提供足夠的水和飼料。

圖1 A.復(fù)合淀粉水凝膠G''值隨頻率的變化曲線(xiàn)；B.復(fù)合淀粉水凝膠的注射性測(cè)試結(jié)果；C.復(fù)合淀粉水凝膠的降解率隨時(shí)間變化曲線(xiàn)

在術(shù)后2、4 和6 周，分別用過(guò)量的麻醉劑處死大鼠（10%水合氯醛10 mL/kg）。取下大鼠右膝股骨，用10%福爾馬林固定標(biāo)本48 h，用10%的中性EDTA 液浸泡標(biāo)本以進(jìn)行脫鈣。EDTA 脫鈣液兩天更換1 次，當(dāng)針刺標(biāo)本無(wú)明顯阻力感時(shí)停止脫鈣，脫水、石蠟包埋后用石蠟切片機(jī)行5 mm厚度切片。行蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅O-快綠染色和Alcain blue 染色，并根據(jù)國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（International Cartilage Repair Society，ICRS）組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[8]。1.3.8 大鼠膝關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損修復(fù)后軟骨細(xì)胞數(shù)目比較

依據(jù)各組修復(fù)部位顯微鏡下的軟骨細(xì)胞的橢圓狀形態(tài)與數(shù)目，對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)并比較各組間的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Student's t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合淀粉水凝膠的流變學(xué)特征

復(fù)合淀粉水凝膠的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果如圖1A 所示?？梢钥闯觯陬l率測(cè)試范圍內(nèi)，復(fù)合淀粉水凝膠的儲(chǔ)能模量（G'）和耗能模量（G''）接近，兩者隨著角頻率的增加而增加。上述結(jié)果表明復(fù)合淀粉水凝膠具有介于固態(tài)和液態(tài)之間的流變學(xué)特征。

2.2 復(fù)合淀粉水凝膠的注射性能

復(fù)合淀粉水凝膠可以在15 N推注力下從22 G的注射器針頭中流出（見(jiàn)圖1B），該推注力遠(yuǎn)低于人手操作平均力值的上限50 N，表明復(fù)合淀粉水凝膠具有良好的注射性能。

2.3 復(fù)合淀粉水凝膠的體外降解性能

水凝膠損失重量的百分比如圖1C 所示。結(jié)果顯示，第1d時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠降解速度較快，質(zhì)量損失量達(dá)到17.9wt.%；之后復(fù)合淀粉水凝膠的降解速度減慢并呈現(xiàn)近似勻速降解行為，在第10 d 時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠降解38 wt.%。

2.4 細(xì)胞Live/Dead 染色結(jié)果

共培養(yǎng)1 d 后Live/Dead 染色結(jié)果如圖2A 所示。對(duì)照組可見(jiàn)紅色細(xì)胞（死細(xì)胞）數(shù)量最多，細(xì)胞外形呈梭型，其次為淀粉水凝膠組，其余三組紅色細(xì)胞（死細(xì)胞）數(shù)量很少，并且細(xì)胞形態(tài)正常、胞膜完整。復(fù)合淀粉水凝膠浸提液對(duì)軟骨細(xì)胞活性沒(méi)有明顯抑制作用。

2.5 CCK-8 測(cè)試結(jié)果

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果如圖2B 所示，復(fù)合淀粉水凝膠浸提液組的軟骨細(xì)胞在1 d 和3 d 的相對(duì)增殖率分別為110.44 %和91.98%。

2.6 RT-PCR 測(cè)試結(jié)果

Col-Ⅱ基因表達(dá)量如圖2C 所示。培養(yǎng)1 d 時(shí)，硅酸鈣溶液組Col-Ⅱ基因表達(dá)量最高，復(fù)合淀粉水凝膠組次之，和透明質(zhì)酸組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)3 d時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠的Col-Ⅱ基因表達(dá)相比較對(duì)照組增加15倍，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但較透明質(zhì)酸組低（P＜0.001）。軟骨細(xì)胞Agg 基因的檢測(cè)結(jié)果如圖2D 所示。第1 d 淀粉水凝膠組的促Agg 基因表達(dá)效果高于復(fù)合淀粉水凝膠組和透明質(zhì)酸組，而第3 d 時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠組的促Agg 基因表達(dá)效果有明顯的下降，只高于對(duì)照組并且兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），與對(duì)照組相比有2 倍的增加（P＜0.001）。SOX-9 基因表達(dá)量如圖2E 所示。復(fù)合淀粉水凝膠明顯促SOX-9 基因表達(dá)，在第1 d 和第3 d 時(shí)SOX-9 基因表達(dá)量繼續(xù)增加，和對(duì)照組間存在差異（P＜0.05），同時(shí)和透明質(zhì)酸組間也存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖2 A.軟骨細(xì)胞在不同材料浸提液培養(yǎng)1 d 時(shí)的Live/Dead 染色（紅色：死細(xì)胞；綠色：活細(xì)胞）；B.CCK-8 法測(cè)試不同材料的生物相容性；C.Col-II 基因的表達(dá)量；D.Agg 基因的表達(dá)量；E.SOX-9 基因的表達(dá)量

2.7 關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損修復(fù)組織大體肉眼觀(guān)察和組織學(xué)觀(guān)察

術(shù)后2 周時(shí)，缺損處形貌和組織學(xué)分析如圖3 所示。宏觀(guān)肉眼觀(guān)察可見(jiàn)各組骨-軟骨缺損依然明顯，未見(jiàn)明顯修復(fù)和愈合。復(fù)合淀粉水凝膠組表現(xiàn)出更多的新生組織長(zhǎng)出，組織學(xué)可見(jiàn)新生組織含有更多蛋白多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分，其修復(fù)效果要好于對(duì)照組、淀粉水凝膠組和硅酸鈣溶液組。

術(shù)后4 周時(shí)，空白對(duì)照組和硅酸鈣溶液組的新生組織較其他組少，空白對(duì)照組的軟骨表面可明顯觀(guān)察到環(huán)形缺損痕跡；硅酸鈣溶液組新生組織表面凹凸不平、不光滑、不連續(xù)，與正常軟骨交界處凹陷較深；透明質(zhì)酸組軟骨表面可見(jiàn)環(huán)形缺損痕跡，同時(shí)缺損周?chē)恼＼浌潜砻婵梢?jiàn)少許磨損；復(fù)合淀粉水凝膠組的修復(fù)效果要優(yōu)于空白對(duì)照組和其他組，缺損部位表面僅見(jiàn)到少許半環(huán)形缺損痕跡，并且缺損周?chē)P(guān)節(jié)面光滑連續(xù)，新生組織表面光滑（見(jiàn)圖4）。因此，4周時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠組的修復(fù)效果要優(yōu)于其他組。

圖3 A.術(shù)后2 周時(shí)大鼠骨-軟骨缺損的修復(fù)形貌；B.術(shù)后2 周時(shí)修復(fù)組織的HE 染色、番紅O-快綠染色和Alcain blue 染色

術(shù)后6 周的修復(fù)結(jié)果如圖5 所示?？瞻讓?duì)照組其新生組織表面略有凹陷，新生組織與周?chē)M織的結(jié)合不緊密，周?chē)嬖诶^發(fā)性軟骨損傷。硅酸鈣溶液組缺損部位新生組織表面不平，存在數(shù)個(gè)小的圓形缺損。淀粉水凝膠組缺損已經(jīng)填充但不完全，可觀(guān)察到環(huán)形造模痕跡。透明質(zhì)酸組缺損也已經(jīng)填充，但新生組織中心見(jiàn)到有環(huán)形淺凹陷和小裂隙存在。復(fù)合淀粉水凝膠組6 周時(shí)，缺損部位得到了進(jìn)一步的修復(fù)，缺損部位基本未見(jiàn)有凹陷，新生組織表面光滑。因此在6 周時(shí)，復(fù)合淀粉水凝膠組的修復(fù)效果要強(qiáng)于其他組，尤其6 周時(shí)間點(diǎn)的番紅O-快綠染色可見(jiàn)復(fù)合淀粉水凝膠組形成的蛋白多糖要多于其他組。同時(shí)可以看出，14 Gel 組的組織增生或者修復(fù)區(qū)域也非常明顯?？赡茉蛉缦拢孩袤w外結(jié)果顯示14 Gel可以促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞Agg 基因的表達(dá)量，本身可以加速缺損組織修復(fù)；②14 Gel 本身同樣具有介于固態(tài)和液態(tài)之間的流變學(xué)特征，可改善關(guān)節(jié)軟骨受力環(huán)境，減輕關(guān)節(jié)軟骨的磨損。

圖4 A.術(shù)后4 周時(shí)大鼠骨-軟骨缺損的修復(fù)形貌；B.術(shù)后4 周時(shí)修復(fù)組織的HE 染色、番紅O-快綠染色和Alcain blue 染色

圖5 A.術(shù)后6 周時(shí)大鼠軟骨缺損的修復(fù)形貌；B.術(shù)后6 周時(shí)修復(fù)組織的HE 染色、番紅O-快綠染色和Alcain blue 染色

2.8 根據(jù)ICRS 組織學(xué)評(píng)估量表進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分及分析

根據(jù)ICRS 組織學(xué)評(píng)估量表對(duì)2 周、4 周和6 周時(shí)大鼠軟骨缺損的組織學(xué)修復(fù)分值如圖6A-C 所示?？瞻讓?duì)照組（2周：4.00±2.12，4 周：11.00±0.94，6 周：12.50±0.85）；硅酸鈣溶液組（2 周：6.50±0.71，4 周：11.00±0.94，6 周：12.00±1.03）；透明質(zhì)酸組（2 周：4.50±2.12，4 周：13.00±0.83，6 周：13.50±0.75）；淀粉水凝膠組（2 周：5.00±2.83，4 周：12.50±1.04，6 周：12.50±0.90）；復(fù)合淀粉水凝膠組（2 周：5.00±1.41，4 周：13.50±0.62，6 周：14.50±0.52）。

2.9 關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)組織的軟骨細(xì)胞數(shù)目結(jié)果

2 周時(shí)，可以看出硅酸鈣溶液組的軟骨細(xì)胞數(shù)目要高于其他各組（P＜0.05）（見(jiàn)圖6D）。4 周時(shí)，各組的軟骨細(xì)胞數(shù)目較2 周有所增加，硅酸鈣溶液組的細(xì)胞數(shù)目要比其他組多，但與復(fù)合淀粉水凝膠組沒(méi)有差異（見(jiàn)圖6E）。6 周時(shí)，各組間的軟骨細(xì)胞數(shù)目較4 周未見(jiàn)明顯增加，并且各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖6F）。可以發(fā)現(xiàn)此時(shí)復(fù)合淀粉水凝膠組的軟骨細(xì)胞數(shù)目要高于其他組，但與其他組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 A-C.分別為2 周、4 周和6 周時(shí)大鼠軟骨缺損修復(fù)的ICRS 組織學(xué)評(píng)分結(jié)果；D-F.分別為2 周、4 周和6 周時(shí)大鼠軟骨缺損處的軟骨細(xì)胞數(shù)量

3 討論

水凝膠材料是目前研究較多的生物材料，水凝膠材料對(duì)低分子物質(zhì)具有很好的透過(guò)性，水凝膠的三維空間結(jié)構(gòu)可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供獲取營(yíng)養(yǎng)、氣體交換和廢物排泄的場(chǎng)所，也可以作為新的具有形態(tài)和功能的組織、器官的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。力學(xué)和化學(xué)微環(huán)境在關(guān)節(jié)骨-軟骨的修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射合適力學(xué)和化學(xué)性能水凝膠材料可以為關(guān)節(jié)骨-軟骨修復(fù)構(gòu)建合適的力學(xué)和化學(xué)微環(huán)境。

淀粉作為一種高分子多糖，在加熱條件下會(huì)出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，通過(guò)改性可使得淀粉凝膠的性質(zhì)介于固態(tài)和液態(tài)之間[10]。淀粉在加熱至預(yù)糊化的過(guò)程中加入不同的金屬鹽，則會(huì)對(duì)淀粉凝膠化與淀粉的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[11]。因此，可制備出具有平衡的固態(tài)和液態(tài)力學(xué)性能的淀粉基水凝膠改善關(guān)節(jié)力學(xué)微環(huán)境。硅參與新骨形成并影響新骨的早期礦化過(guò)程，硅通過(guò)促進(jìn)BMSCs 的增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原的合成[12-13]。含有淀粉的水凝膠已被用于軟骨和骨組織的修復(fù)。Sá-Lima 等[14]在殼聚糖-磷酸甘油酯（CGP）體系中加入淀粉來(lái)制備溫敏型水凝膠，發(fā)現(xiàn)淀粉的摻入在不改變?cè)瑿GP 特征下可以改善其彈性模量和降解性，并且可以影響軟骨分化和軟骨基質(zhì)的分泌。Faikrua 等[15]用殼聚糖/淀粉/ -甘油磷酸水凝膠作為T(mén)GF-1 的載體，發(fā)現(xiàn)該水凝膠體系可以持續(xù)14 天釋放生長(zhǎng)因子，并可在體外環(huán)境中保持軟骨細(xì)胞的表型和功能。Santos 等[16]將可降解的玉米淀粉和SPCL 制成3D 支架，可以同時(shí)培養(yǎng)兩種不同的細(xì)胞，構(gòu)建出了治療骨缺損重建需要的微脈管系統(tǒng)。

本文以生物相容性好、可生物降解的淀粉及硅酸鈣鹽為原料，合成一種新型復(fù)合淀粉水凝膠。改進(jìn)后的復(fù)合淀粉水凝膠不僅可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞Col-Ⅱ基因和Agg 基因的表達(dá)，也可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞SOX-9 的表達(dá)，但誘導(dǎo)Agg 基因表達(dá)的效果有所降低。Gao 等[17]發(fā)現(xiàn)硅離子通過(guò)激活Wnt 途徑促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分化，激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP 活性、調(diào)節(jié)某些蛋白質(zhì)（如OCN、RUNX2 和OPN）的表達(dá)。同時(shí)硅可顯著增強(qiáng)軟骨細(xì)胞SOX-9（轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)）的表達(dá)，并增加Aggrecan、Col-Ⅱ、N-cad 基因和Col-Ⅱ蛋白的表達(dá)[18]。和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，本研究也發(fā)現(xiàn)含硅復(fù)合淀粉水凝膠可以促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞Col-Ⅱ和SOX-9 基因的表達(dá)。

本研究體外結(jié)果表明復(fù)合淀粉水凝膠有望通過(guò)微創(chuàng)方式注射到大鼠軟骨缺損部位并黏附在骨-軟骨缺損表面，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接顯示復(fù)合淀粉水凝膠在膝關(guān)節(jié)注射一次可在長(zhǎng)達(dá)6 周時(shí)間內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能，顯示出促進(jìn)骨-軟骨缺損修復(fù)的效果。目前臨床中使用的透明質(zhì)酸作用的時(shí)效性很短且不具備軟骨修復(fù)能力。研究者嘗試將其他材料與透明質(zhì)酸聯(lián)合應(yīng)用于軟骨修復(fù)。例如，Wang 等[19]同時(shí)使用N-乙酰氨基葡萄糖-聚乳酸-羥基乙酸共聚物-透明質(zhì)酸修復(fù)兔骨-軟骨缺損，結(jié)果顯示該組合表現(xiàn)出較好的骨-軟骨整合，并且缺損部位再生的組織體積和小梁骨量更高。同時(shí)，基于透明質(zhì)酸類(lèi)潤(rùn)滑劑的治療需要頻繁進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射，在使用中易引起如關(guān)節(jié)腔積液、感染、關(guān)節(jié)痛及皮膚紅斑等不良反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合淀粉水凝膠在未來(lái)臨床使用中可以減少關(guān)節(jié)腔注射頻率和次數(shù)，進(jìn)而降低關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的副作用。

本研究制備出一種具有介于固態(tài)和液態(tài)之間的流變學(xué)特征的復(fù)合淀粉水凝膠，其在15 N 外力下可從22 G 針頭中穩(wěn)定推出，在PBS 溶液中浸泡10 d 后質(zhì)量損失率為38 wt.%。復(fù)合淀粉水凝膠浸提液對(duì)軟骨細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，并提高了其Ⅱ型膠原基因和SOX-9 基因的表達(dá)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示治療4 周和6 周后復(fù)合淀粉水凝膠組的組織學(xué)評(píng)分高于未治療組，組織學(xué)染色也顯示該水凝膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成。因此，復(fù)合淀粉水凝膠在骨-軟骨缺損修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。