水飛薊賓及其衍生物生物活性及作用機制的研究進展

張志鵬，孟艷秋*，王 趲

1.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 100142

2.沈陽化工大學(xué) 分析測試中心，遼寧 沈陽 100142

水飛薊賓屬于黃酮木脂素類化合物，從水飛薊Silybum marianum(L.)Gaertn.的種子中提取分離得到。水飛薊賓由2 種非對映異構(gòu)體水飛薊賓A（2R,3R,10R,11R）和水飛薊賓B（2R,3R,10S,11S）等比例混合組成[1]，具有多種生物活性，尤為突出的是保護肝臟和清除自由基的作用。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓對非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的療效已有臨床驗證。水飛薊賓治療前列腺癌已進入臨床試驗階段[2]。此外，水飛薊賓對糖尿病也具有一定的治療作用。本文主要對水飛薊賓及其衍生物的生物活性及作用機制的研究進展進行綜述。

1 護肝作用

1.1 水飛薊賓治療NASH

馬來西亞隆坡醫(yī)院開展了水飛薊賓治療NASH的臨床試驗，結(jié)果表明，試驗效果理想[3]，但沒有明確作用機制。

1.1.1 抗炎與抗氧化作用 水飛薊賓對NASH的治療作用依賴于抗氧化與抗炎作用相互協(xié)同。在雙酚A 誘導(dǎo)類固醇激素代謝導(dǎo)致的細胞增殖NASH 模型中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路被激活，導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激與炎癥損傷，水飛薊賓能夠抑制這一過程，并同時激活半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine proteinase-3，Caspase-3）促進增殖細胞凋亡[4]。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一條經(jīng)典的炎癥通路，水飛薊賓抑制O-N-乙酰葡糖胺糖基化（glycosylation ofON-acetylglucosamine，O-GlcNAcylation）可降低NFκB 及其下游的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的過度表達，減輕NASH 炎癥反應(yīng)，從而改善肝臟功能[5]。此外，在棕櫚酸酯誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中，較小劑量的水飛薊賓即可恢復(fù)由棕櫚酸酯引起的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平降低，從而激活2型去乙?；福╯irtuin type 2，SIRT2）通路并調(diào)控其下游蛋白，最終抑制IL-1β 炎性因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)[6]。水飛薊賓也可通過抑制聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（poly adenosine diphosphateribose polymerase，PARP）的激活，恢復(fù)NAD+水平，增加SIRT1 與腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的表達與活性對抗炎癥治療NASH[7]。

水飛薊賓對氧化應(yīng)激與炎癥的抑制作用極大程度地依賴于降低組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平實現(xiàn)。Ou 等[8]研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓通過激活核因子相關(guān)因子 2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路，可直接降低ROS 水平，減輕ROS 對肝臟的氧化損傷。另一方面，游離脂肪酸氧化可導(dǎo)致ROS 和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）增加，并導(dǎo)致炎癥通路被激活，水飛薊賓作為天然抗氧化劑能降低ROS 水平，進而抑制下游的NF-κB（p50/p65 亞型）與p65 下游的iNOS 表達與活性，從而對抗炎癥[9]。

1.1.2 調(diào)節(jié)脂代謝 水飛薊賓可在一定程度上抑制膽固醇代謝酶CYP27A1 活性和核轉(zhuǎn)錄因子法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptors γ，PPARγ）、肝臟X 受體（liver X receptor，LXR）表達，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase，G6PD）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、分化簇36（cluster of differentiation 36，CD36）水平，從而抑制脂肪酸生成，最終降低三酰甘油（triglyceride，TG）水平[10]。硬脂酰輔酶A 去飽和酶-1（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD-1）是一種將飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）的酶，水飛薊賓可顯著增強（甚至明顯高于對照組）SCD-1 的表達與活性，調(diào)節(jié)脂代謝，緩解NASH[9]。

在脂質(zhì)代謝方面，上調(diào)PPARα、PPARδ水平可促進脂質(zhì)分解，脂肪酸引起的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）過表達可被水飛薊賓逆轉(zhuǎn)，使得其下游的脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）被降低至正常水平，且負責(zé)調(diào)控脂肪代謝的肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A（recombinant carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）表達水平提高，這一機制也被認為是水飛薊賓減輕肝臟脂質(zhì)堆積與過氧化的主要途徑[7]。此外，在多種NASH 動物模型中，水飛薊賓能激活c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），調(diào)控其下游代謝，同時，下調(diào)PI3K-Akt 增加2-[N-(7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑-4-氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖[2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG]的攝取，在一定程度上改善脂質(zhì)/膽固醇在肝臟的堆積從而對抗NASH[11]。

1.1.3 改善線粒體功能 在NASH模型中可明顯觀察到線粒體形態(tài)與功能的改變，水飛薊賓可增加線粒體體積，改善線粒體嵴功能，增加細胞線粒體CPT-1 與微粒體CYP2E1 的表達，對抗脂肪酸誘導(dǎo)的線粒體損傷與脂肪酸依賴性脂質(zhì)過氧化（降低丙二醛水平）及DNA 氧化損傷[提高脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（apurinic-apyrimidinicendonuclease 1，APE1）和DNA 指導(dǎo)聚合酶（recombinant polymerase DNA directed gamma，Polg）的表達]，并增加過氧化氫酶活性，極大程度地恢復(fù)線粒體功能[12]。水飛薊賓通過作用線粒體功能蛋白極長鏈?；o酶A脫氫酶（very long-chain acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD）及解偶聯(lián)蛋白 2（uncouplingprotein 2，UCP2），抑制環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性，同時，上調(diào)脂代謝調(diào)控因子miR-122 表達水平，進而增加了水通道蛋白 9（aquaporin protein-9 polypeptide，AQP9）的表達與甘油通透性，從而增強細胞內(nèi)外的脂質(zhì)交流緩解細胞脂質(zhì)負擔(dān)，且有報道提示，AQP9 可能是水飛薊賓治療NASH 的新型靶標[13]。

上述研究表明，在NASH 疾病發(fā)展過程中，水飛薊賓主要通過ROS 和PPARα、δ、γ 抑制炎癥反應(yīng)與脂代謝紊亂，緩解甚至逆轉(zhuǎn)NASH 病程發(fā)展（圖1），為臨床上應(yīng)用水飛薊賓治療NASH 提供理論基礎(chǔ)。

圖1 水飛薊賓治療NASH 的機制Fig.1 Mechanism of silybin in treatment of NASH

1.2 水飛薊賓治療肝炎

水飛薊賓臨床上目前被用于解救蘑菇中毒與治療急慢性肝病[14]。近年來，對水飛薊賓護肝作用有了更深入的研究。在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝炎模型中，水飛薊賓可抑制NF-κB 通路，使血清TNFα、IL-6 水平降低，并可逆轉(zhuǎn)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的丙二醛水平升高，但對肝臟還原型谷胱甘肽無明顯影響，這表明水飛薊賓的治療肝炎作用主要通過抗炎而不是抗氧化過程。

1.3 水飛薊賓抗肝纖維化

肝炎可能繼續(xù)發(fā)展形成肝纖維化，導(dǎo)致肝臟進一步損傷。在大鼠肝纖維化模型中，水飛薊賓100 mg/kg可顯著下調(diào)肝組織中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清堿性磷酸酶水平，激活超氧化物歧化酶與過氧化氫酶活性、逆轉(zhuǎn)三磷酸腺苷酶活性下降與羥脯氨酸和膠原蛋白水平的升高，提示水飛薊賓具有保肝與抗纖維化的作用[15]。血小板活化因子是一種廣泛的炎性因子，可引起肝硬化及纖維化，溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶（lysophosphatidylcholine，LPCAT）在血小板活化因子重構(gòu)過程中扮演重要角色，水飛薊賓可激活肝硬化大鼠LPCAT1與LPCAT2的活性與表達，緩解血小板活化因子對肝臟的損傷從而抑制肝纖維化[16]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9（matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9）作為一種參與膠原降解的主要蛋白酶，在NASH 肝炎向肝纖維化發(fā)展過程中同樣具有關(guān)鍵作用，在游離脂肪酸誘導(dǎo)的NASH 肝癌Huh7 細胞中，水飛薊賓可上調(diào)MMP-2/9 的表達并恢復(fù)其生物活性[17]。這2 項研究提示LPCAT 或MMP-2/9 可能是水飛薊賓治療肝纖維化的重要靶點。

1.4 水飛薊賓衍生物的抗氧化作用

2,3-脫氫水飛薊賓（2,3-dehydrosilybin，DHS）是水飛薊賓抗氧化衍生物中最具代表性的化合物之一。在2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，PDDH）法抗氧化實驗中，DHS 對自由基的清除能力是水飛薊賓的25 倍[18]，根據(jù)密度泛函原理，DHS 結(jié)構(gòu)中擴大的電子共軛體系使其成為更好的電子供體對抗自由基[19]。在四氯化碳誘導(dǎo)異型組蛋白（DNA 損傷標志物）水平升高的大鼠肝細胞損傷模型中，DHS 可通過部分降低ROS 水平與活性抑制脂質(zhì)過氧化對DNA 造成的損傷，并且降低血清中TNF-a、IL-6、γ 干擾素、一氧化氮（nitric oxide，NO）和iNOS 的表達水平，提示DHS作為較水飛薊賓更強的抗氧化劑同樣可通過減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)對抗肝損傷[20]。

水飛薊賓衍生物1～7、10、11（圖2）可能作為更好的抗氧化劑對抗肝臟或其他組織的氧化應(yīng)激損傷[21-26]。Gazák 等[27]在采用PDDH 法對水飛薊賓中羥基抗氧化作用時發(fā)現(xiàn)，C-20-OH 是抗氧化、清除自由基的必須基團，C-7-OH 的存在會降低水飛薊賓的抗氧化能力。其他研究顯示，對C-20-OH 進行修飾，如衍生物2、3、5，在大鼠肝臟勻漿脂質(zhì)過氧化實驗中均表現(xiàn)出較水飛薊賓更好的抗氧化活性，這可能是由于抗氧化測定方式不同造成的系統(tǒng)差異。

圖2 水飛薊賓衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of silybin derivatives

2 抗腫瘤作用

2.1 水飛薊賓抗腫瘤作用機制

水飛薊賓的抗腫瘤機制復(fù)雜（表1），其中通過增加腫瘤細胞ROS 水平，使癌細胞發(fā)生快速氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞死亡是水飛薊賓最主要的抗腫瘤機制。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓誘導(dǎo)ROS 水平的升高與細胞內(nèi)鈣離子蓄積有關(guān)，大量鈣離子可能影響線粒體功能導(dǎo)致ROS 的過量釋放，因為細胞外鈣離子螯合劑可阻斷水飛薊賓誘導(dǎo)的ROS 水平增加[37]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓增加胰腺癌細胞線粒體中細胞色素C 水平，進而誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生，致使細胞發(fā)生快速氧化應(yīng)激死亡[38]。Zheng 等[39]在乳腺癌MCF-7 細胞中發(fā)現(xiàn)大劑量（200～300 μmol/L）水飛薊賓誘導(dǎo)的細胞死亡過程存在2 種相互沖突的機制：一方面水飛薊賓可通過下調(diào)雌激素受體α 表達增強細胞自噬凋亡；另一方面水飛薊賓誘導(dǎo)的ROS 上調(diào)可對抗自噬過程。早在2012年，Yu 等[40]在人表皮樣癌A431細胞中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓200～500 μmol/L 作用24 h/48 h可降低細胞ROS 水平，在誘導(dǎo)細胞死亡過程中發(fā)面水飛薊賓充當了抗氧化劑角色通過降低線粒體現(xiàn)，線粒體膜電位下降導(dǎo)致線粒體功能障礙，一方呼吸作用與增加谷胱甘肽的表達降低了ROS 水平；另一方面水飛薊賓增加了細胞內(nèi)NO 水平，誘導(dǎo)細胞自噬與凋亡。這些研究表明，水飛薊賓在抗腫瘤過程中對ROS 的影響具有“雙刃劍”的作用，這一現(xiàn)象的發(fā)生可能具有細胞差異性，但是否存在劑量差異性還未得到證實。

表1 水飛薊賓在不同癌細胞中的分子靶點/通路Table 1 Molecular targets/pathways of silybin in different cancer cells

2.2 水飛薊賓衍生物的抗腫瘤作用

近年來，水飛薊賓衍生物的抗腫瘤作用也受到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)多種水飛薊賓衍生物（8、9、12～15，圖2），表現(xiàn)出較水飛薊賓更強的抗腫瘤活性，見表2。

表2 水飛薊賓衍生物對不同腫瘤細胞株的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of silybin derivatives on different cancer cells

關(guān)于水飛薊賓衍生物抗腫瘤活性提高的原因，認為可能與衍生物結(jié)構(gòu)中引入了烷基等脂溶性基團導(dǎo)致化合物脂溶性增加有關(guān)。遺憾的是國內(nèi)外對衍生物抗腫瘤機制的研究還未展開。

3 治療糖尿病

3.1 降低血糖

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一種腸道L 細胞分泌的腸促胰素，激動GLP-1 受體（GLP-1 receptor，GLP-1R），具有降低血糖、保護胰島β 細胞等作用，但內(nèi)源性GLP-1 或人工合成類肽半衰期極短。水飛薊賓能增加十二指腸GLP-1R 數(shù)量的表達，降低肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，從而有效降低血糖[44]。此外，水飛薊賓與DHS 均可通過直接與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporters，GLUT）相互作用抑制細胞對葡萄糖攝取，該作用為水飛薊賓或DHS 的葡萄糖饑餓療法抗腫瘤提供了理論基礎(chǔ)，并提示水飛薊賓及DHS 可能作用于腸道GLUT 抑制葡萄糖吸收治療糖尿病[45]。

3.2 保護靶器官

水飛薊賓可保護雌激素受體，增強雌激素受體的表達與激活，并通過促進細胞自噬與抑制凋亡途徑保護胰島細胞免受TNF-α 與IL-1β 所致的細胞損傷[46]，還可保護胰腺β 細胞免受由胰淀素與β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 和RNS 對細胞造成的損傷[47]，同時促進SIRT-1 表達，生理性恢復(fù)自噬，逆轉(zhuǎn)高血糖，修復(fù)受損胰腺β 細胞[48]，因此水飛薊賓在胰腺保護過程中，可能具有積極作用。此外，水飛薊賓通過上調(diào)胰島素誘導(dǎo)基因1（insulin induced gene，Insig-1），進而抑制SREBP-1c 的表達，調(diào)控下游一系列信號通路，可改善胰島β 細胞功能障礙，阻斷細胞凋亡恢復(fù)細胞活力，促進胰島素分泌并抑制脂質(zhì)合成[49]。由鏈脲佐菌素介導(dǎo)的糖尿病大鼠DNA損傷情況在水飛薊賓治療組中被明顯改善，這得益于水飛薊賓優(yōu)良的抗氧化活性尤其是對羥基自由基的高反應(yīng)性，這能保護DNA 免受ROS 損傷，一定程度上解釋了水飛薊賓恢復(fù)胰島素分泌的機制[50]。

3.3 治療糖尿病并發(fā)癥

高糖環(huán)境對血管內(nèi)皮細胞的損傷是糖尿病的主要并發(fā)癥，不對稱二甲基精氨酸是NOS 的內(nèi)源性抑制劑，水飛薊賓通過降低血管內(nèi)不對稱二甲基精氨酸水平，顯著改善糖尿病小鼠內(nèi)皮功能障礙[51]。此外，單獨使用水飛薊賓即可恢復(fù)還原型谷胱甘肽與抗氧化酶活性，保護血管內(nèi)皮細胞免受氧化應(yīng)激損傷[52]。另一方面，糖尿病可引起腎臟慢性病變甚至纖維化，水飛薊賓通過激活A(yù)kt 信號通路，降低糖原合成酶激酶-3β、細胞凋亡因子與Caspase-3 水平，保護腎臟免受高糖誘導(dǎo)的損傷，而在腎纖維化過程中，水飛薊賓降低了以I型膠原、纖維連接蛋白及α 平滑肌肌動蛋白為代表的纖維化標志物，并下調(diào)NF-κB 表達水平抑制糖尿病腎病及纖維化[53-54]。

4 結(jié)語與展望

水飛薊賓對多種疾病表現(xiàn)出良好的治療效果，由于其抗炎、抗纖維化與穩(wěn)定細胞膜作用機制的清晰，水飛薊賓臨床治療適應(yīng)癥可能進一步擴大。在抗腫瘤方面，水飛薊賓天然的低毒性優(yōu)勢，具有極大的發(fā)展?jié)摿?，但對其作用機制有待進一步研究。水飛薊賓的抗糖尿病活性也是目前的研究熱點之一。對水飛薊賓研究的難點是如何高效的分離水飛薊賓非對映異構(gòu)體，這對于研究水飛薊賓A、B 的生物活性及確定異構(gòu)體中有效的分子構(gòu)象至關(guān)重要。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突