屠宰場(chǎng)分離大腸埃希氏菌O157:H7藥敏試驗(yàn)及耐藥基因分析

鐘巧賢，袁淑英，梁秋燕，袁明貴，彭新宇，徐志宏，2，向 蓉,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，廣東肇慶 5262382)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是人和動(dòng)物腸道中最重要和最常見的微生物之一，屬于人獸共患條件致病菌[1-2]。目前國際公認(rèn)的分類主要有6個(gè)種類，其中腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)是能引起人和動(dòng)物出血性腹瀉和腸炎的一類大腸埃希氏菌，O157:H7血清型是其代表菌株。大腸埃希氏菌O157：H7 是目前世界公認(rèn)的引起食源性疾病的重要致病菌和人獸共患病病原微生物，主要通過食物及飲食、肉及肉制品傳播[3-5]。患病或帶菌動(dòng)物往往是動(dòng)物來源食品污染的根源。豬是大腸埃希氏菌的重要宿主，在養(yǎng)殖過程中經(jīng)常會(huì)面臨細(xì)菌導(dǎo)致的感染。因此，大量抗菌藥物在養(yǎng)殖臨床使用，導(dǎo)致耐藥菌的逐步形成。在屠宰過程中，豬胴體可能會(huì)被腸道中的耐藥大腸埃希氏菌污染，耐藥菌株通過感染生豬、污染豬肉再進(jìn)一步通過食物鏈將其耐藥性傳播至人類，造成嚴(yán)重的食品安全和公共衛(wèi)生問題[6]。因此，對(duì)屠宰場(chǎng)內(nèi)大腸埃希氏菌O157：H7耐藥性動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)也是一項(xiàng)極其重要的工作。本研究擬調(diào)查2018年-2019年從廣東省內(nèi)生豬屠宰場(chǎng)分離的19株大腸埃希氏菌O157:H7耐藥情況，以期了解對(duì)其敏感的藥物，為有效控制大腸埃希氏菌O157:H7的感染提供科學(xué)依據(jù)，保障公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2018年-2019年從廣東省內(nèi)生豬屠宰場(chǎng)屠宰過程中的豬肉、肝臟和脾臟等856份樣本中分離鑒定的19株大腸埃希氏菌O157:H7和標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所獸藥研究室保存。

1.1.2 主要試劑和藥物 營養(yǎng)肉湯、MH肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000、GeneRed核酸染料、瓊脂糖、甘油，均為廣州順鋒生物科技有限公司產(chǎn)品。

青霉素，北京鼎國昌盛生物科技有限公司產(chǎn)品；阿莫西林，大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；紅霉素，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；氨芐西林、硫酸卡那霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、多黏菌素B硫酸鹽、硫酸慶大霉素、頭孢氨芐、頭孢哌酮、鏈霉素、氯霉素、利福平等13種抗菌類藥物，均為廣州順鋒生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 單道可調(diào)量程移液器(Research plus 0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL )，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HWS-158L)，廣州市深華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式全溫振蕩器(THZ-C-1)，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler X50S)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(PowerPacTM Basic)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(ZF-258)，上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning/Costar 3599)，廣州順鋒生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 以大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，MH肉湯作為培養(yǎng)基，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中采用微量肉湯稀釋法對(duì)19株大腸埃希氏菌O157:H7進(jìn)行16種獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，所有操作和標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照2015 版CLSI 標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.2 DNA模板提取 水煮法提取細(xì)菌DNA模板，振蕩過夜培養(yǎng)的菌液3 mL經(jīng)10 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，沉淀重懸于無菌蒸餾水后煮沸10 min，迅速轉(zhuǎn)冰浴5 min，再經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清即為模板DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 參考文獻(xiàn)[7-12]針對(duì)大腸埃希氏菌的β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDM-1、blaTEM，多黏菌素mcr-1 基因，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetM，氯霉素類抗藥基因floR，氨基糖苷類耐藥基因aac(3)-Ⅱa、aph(3’)-Ⅶ、rmtB等10種耐藥基因合成引物，引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 耐藥基因引物序列

1.2.4 PCR反應(yīng)程序 預(yù)變性：95℃，5 min；變性：95℃ ，40 s；退火條件分別為：60℃(blaNDM-1)，40 s；59.8℃(mcr-1)，40 s；56℃(blaTEM)，40 s；54℃(rmtB)，30 s；62℃(tetA)，30 s；62℃(tetB)，30 s；55℃(tetM)，1 min；68.5℃(floR)，1 min；54.5℃(aac(3)-Ⅱa)，30 s；56.5℃(aph(3′)-Ⅶ)，30 s；延伸條件:72℃，2 min；30個(gè)循環(huán)?？傃由鞐l件：72℃，5 min。

1.2.5 耐藥基因檢測(cè) 利用PCR對(duì)19株菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。取5 μL PCR產(chǎn)物，用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。切膠回收目的條帶后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選出疑似陽性菌落提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

19株大腸埃希氏菌O157:H7藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株對(duì)16種抗菌藥物存在耐藥差異。其中，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、青霉素、氯霉素和恩諾沙星耐藥率最高，全部達(dá)到100%，其次對(duì)多黏菌素B(84.21%)、頭孢氨芐(78.95%)、紅霉素(78.95%)都在80%左右，耐藥率最低的是頭孢哌酮(5.26%)，其他也均在31.58%～73.68%之間(表2)。所有菌株都呈現(xiàn)不同程度的多重耐藥，耐7種受試藥物的菌株有1株，耐8種的有4株，耐9種的有1株，耐11、12種的各有3株，耐13種的有1株，耐14種、15種的各有3株(見圖1)。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬源大腸埃希氏菌O157:H7對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥性，耐藥及多重耐藥情況嚴(yán)重。

表2 19株大腸埃希氏菌O157:H7耐藥性情況

圖1 19株大腸埃希氏菌O157:H7多重耐藥情況

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

以提取的19株大腸埃希氏菌O157:H7的DNA為模板，采用PCR檢測(cè)10種耐藥基因。結(jié)果顯示，mcr-1、tetM、floR、rmtB4種耐藥基因未檢出，其他6種耐藥基因PCR均擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的條帶；其中檢出率最高的是tetA耐藥基因，檢出率為89.47%，檢出率較低的是blaNDM-1耐藥基因，檢出率為5.26%，其余耐藥基因檢出率分別在31.58%～73.68%之間，表明屠宰場(chǎng)分離的大腸埃希氏菌O157:H7攜帶不同的耐藥基因，詳見表3。

表3 19株大腸埃希氏菌O157:H7分離株耐藥基因的檢測(cè)

2.3 耐藥表型和耐藥基因的分布

19株大腸埃希氏菌O157:H7的耐藥譜和耐藥基因分布見表4。除了頭孢哌酮之外，β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率和β-內(nèi)酰胺酶的檢出率均為最高，說明本次屠宰場(chǎng)分離的大腸埃希氏菌O157:H7對(duì)β-內(nèi)酰胺類中的青霉素類和第一代頭孢類藥物耐藥嚴(yán)重，而產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致耐藥的重要原因，頭孢哌酮屬于第三代頭孢類抗生素，目前對(duì)大腸埃希菌還有較好的抗菌效果，所以本次試驗(yàn)結(jié)果頭孢哌酮的敏感率最高。四環(huán)素類耐藥基因檢出率也很高，但菌株對(duì)本次試驗(yàn)受試藥物多西環(huán)素的耐藥率在50%以下，可能與受試四環(huán)素類藥物較少有關(guān)。氨基糖苷類藥物耐藥率及氨基糖苷類鈍化酶檢出率也相應(yīng)較高。氟苯尼考耐藥率68.42%，但未檢出floR基因，可能存在其它耐藥機(jī)制，如靶位結(jié)構(gòu)改變或細(xì)胞膜的通透性改變等。多黏菌素B耐藥率84.21%，但mcr-1基因也未檢出，耐藥可能由產(chǎn)莢膜多糖或外排泵系統(tǒng)等其它機(jī)制引起。由表可知，同一株菌中耐藥表型和耐藥基因有一定的關(guān)系也存在不一致性，這也體現(xiàn)了耐藥機(jī)制的復(fù)雜性。

表4 耐藥譜和耐藥基因分布情況

3 討論

本研究選擇β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、磺胺類、多肽類和利福霉素類等9大類16種抗菌藥物進(jìn)行耐藥分析，這幾類抗菌藥物在臨床均常見使用。大腸埃希氏菌O157:H7對(duì)阿莫西林、氨芐西林、青霉素、氯霉素和恩諾沙星的耐藥率最高，均為100%，其次為多黏菌素B、頭孢氨芐、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、卡那霉素、鏈霉素、利福平，都在50%以上，耐藥率較低的是多西環(huán)素(42.11%)和慶大霉素(31.58%)，個(gè)別菌對(duì)頭孢哌酮耐藥(5.26%)，這3類藥物可為臨床治療提供參考。所有菌株都呈現(xiàn)出多重耐藥，耐藥數(shù)最多的1株對(duì)16種受試藥物中15種不敏感。薛力剛等[13]從仔豬糞便中分離的大腸埃希氏菌O157:H7對(duì)16 種藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株對(duì)磷霉素和丁胺卡那霉素的敏感性高；其次是頭孢噻肟、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、呋喃妥因；對(duì)紅霉素、青霉素G、氨芐西林、利福平的耐藥性高，與本研究結(jié)果有相似性。李軍等[14]發(fā)現(xiàn)廣西豬源大腸埃希氏菌O157:H7只對(duì)氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢西丁和頭孢噻肟敏感；對(duì)羅紅霉素、多黏菌素B、利福平、林可霉素、阿莫西林、氨芐西林和頭孢噻吩的耐藥率為100%；對(duì)壯觀霉素、鏈霉素、頭孢拉定等藥物的耐藥率在20%～60%之間，調(diào)查菌株均為多重耐藥，耐藥最多的1株對(duì)27種受試藥物中的23種不敏感。不同時(shí)間、不同地區(qū)的大腸埃希氏菌O157:H7呈現(xiàn)出不同的耐藥特點(diǎn)，這也能反應(yīng)出不同地方獸醫(yī)臨床用藥的特點(diǎn)，但多重耐藥嚴(yán)重已是普遍現(xiàn)象。

tetA和tetB基因編碼外排機(jī)制是來源于人類和動(dòng)物大腸埃希氏菌中最常見的四環(huán)素耐藥決定因素，有些分離株以tetA基因?yàn)橹鲗?dǎo)地位，而另一些研究發(fā)現(xiàn)tetB基因占主導(dǎo)地位[15-16]。本研究中19株細(xì)菌有17株攜帶tetA基因，而其中6株菌同時(shí)攜帶tetB基因，說明tetA基因是本次分離細(xì)菌中四環(huán)素耐藥的主導(dǎo)基因。blaTEM型是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株最常見的基因型，可通過染色體介導(dǎo)也可通過質(zhì)粒介導(dǎo)，90%青霉素抗性大腸埃希氏菌都具有blaTEM基因型[15]。本次研究中blaTEM基因攜帶率僅次tetA，有14株細(xì)菌檢出，而青霉素耐藥也達(dá)到100%。氨基糖苷類鈍化酶基因檢出率也較高，李軍等[14]調(diào)查廣西豬源大腸埃希氏菌O157:H7時(shí)也發(fā)現(xiàn)普遍攜帶氨基糖苷類鈍化酶基因，說明氨基糖苷類耐藥基因也是普遍存在。耐藥基因是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥表型的重要機(jī)制，但耐藥表型和耐藥基因型之間沒有完全的一致性。所以本研究中耐藥表型和耐藥基因之間也存在著復(fù)雜的關(guān)系。

微生物與食品的衛(wèi)生質(zhì)量有著密切的聯(lián)系，在食品的生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中都有造成污染的可能。大腸埃希氏菌O157:H7作為食源性致病微生物污染食品后，可能大量繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)，或產(chǎn)生毒素，從而導(dǎo)致食源性疾患，危及人體健康[17-18]。屠宰場(chǎng)是肉制品加工的源頭環(huán)節(jié)，也是微生物污染的重要環(huán)節(jié)，對(duì)公共衛(wèi)生影響十分重要。本次研究的大腸埃希氏菌O157:H7均從屠宰場(chǎng)屠宰過程中的豬肉、肝臟和脾臟中分離出來，結(jié)果說明屠宰場(chǎng)污染的大腸埃希氏菌O157:H7耐藥性嚴(yán)重，也體現(xiàn)豬業(yè)養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的濫用情況。鑒于本研究結(jié)果，亟需加強(qiáng)大腸埃希氏菌O157:H7的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有效遏制其耐藥性發(fā)展，保障豬肉及豬肉制品的安全，進(jìn)而保障消費(fèi)者健康。