生長分化因子8在哺乳動物中的功能研究進展

王蕊彬，任雪華，雷安民

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西省干細胞工程技術中心，陜西楊陵，712100)

生長分化因子8 (growth differentiation factor 8,GDF8)又稱肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)，是轉化生長因子-β(transformation Growth Factor-β,TGF-β)超家族成員之一。GDF8最初是在“mighty mouse”模型產生后開始受到關注的，這是一個靶向GDF8基因的淘汰敲除模型[1]。此后，大多數研究集中于GDF8在肌肉未分化和調控骨骼肌生長發(fā)育方面的功能。自從在人體卵泡液(follicular fluid,FF)和子宮中首次檢測到GDF8以來[2]，GDF8在生殖系統(tǒng)中的功能作用引起了人們的關注。同時GDF8作為家畜育種的靶向基因，其在生殖系統(tǒng)的作用也日趨受到關注[3]。卵泡在其連續(xù)的發(fā)育過程中需要卵母細胞和顆粒細胞、顆粒細胞和膜細胞之間的雙向交流，在這些交流中涉及許多TGF-β超家族的細胞外信號分子[4]。

因此，TGF-β通路被認為是卵母細胞成熟的關鍵調控通路之一，眾所周知的卵母細胞分泌因子(oocyte secretory factors,OSFs)，如生長分化因子9 (growth differentiation factor 9,GDF9)和骨形成蛋白15 (bone morphogenetic protein 15,BMP15)是卵丘細胞(cumulus cells,CCs)中調控關鍵信號通路的蛋白，許多研究已經闡明了卵母細胞- CCs調控環(huán)在卵子發(fā)生過程中的生理機制。但是GDF8作為壁顆粒細胞分泌因子之一，其在卵母細胞成熟和卵泡發(fā)育過程中的生理功能尚不清楚是，因此需要對GDF8的功能作用進行評估。此外，TGF-β超家族分子廣泛存在于從線蟲到哺乳類動物之中，通過調節(jié)細胞增殖、分化、黏附、移行及凋亡，誘導軟骨形成、分化，在生物整體及各種器官的發(fā)育、損傷后修復中起著重要作用，同時也參與多種病理過程[5]。GDF8作為 TGF-β 超家族的重要一員，在胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著舉足輕重的作用，最近的研究還發(fā)現 GDF8可作為改善乳腺癌全身治療的靶點，并且對其他器官無細胞毒性[6]，這些研究都表明了GDF8有很大的潛在應用價值和研究意義。本文將從GDF8基因的結構特征，在卵母細胞中的作用機制，信號通路以及在不同哺乳動物中的研究進展等幾方面進行闡述。

1 GDF8基因的發(fā)現及其結構特征

GDF8最初是在肌肉骨骼系統(tǒng)中發(fā)現的，是TGF-β超家族的成員之一[7]。TGF-β超家族可分為3個亞類，即TGF-βs、骨形成蛋白(BMPs)和激活素(activins)/抑制素(inhibin)。生長分化因子8和11(分別為GDF8/myostatin和GDF11/BMP11)是激活素/抑制素亞類的兩個密切相關成員，在其成熟的C端信號域和N端前域分別具有90%和52%的序列同源性[8]。

所有TGF-β超家族成員都是由1個信號肽、1個引導其二聚的前體和1個成熟結構域組成的大的前體蛋白合成的[9]。與TGF-β家族其他成員相似,MSTN先合成52 ku的前體蛋白質,由信號肽、編碼前肽(26 ku)的N-末端區(qū)和編碼成熟肽(12.5 ku)的C-末端區(qū)3部分組成,在N-末端區(qū)和C-末端區(qū)之間有一個保守的蛋白酶水解位點RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)[10]。MSTN的前體蛋白質需經二次蛋白酶水解活化,去除信號肽,去除信號肽后，二聚體前蛋白被類糠蛋白酶切割，二聚體成熟蛋白分泌。其特點是第4個半胱氨酸殘基被絲氨酸取代，第4個半胱氨酸是參與亞單位間二硫鍵形成的唯一半胱氨酸，存在于除GDF9和BMP15外的所有TGF-β超家族成員中[11]

切割前體蛋白質產生N-端前肽和C-端多肽,C-端多肽通過二硫鍵相連形成具有生物學活性的二聚體發(fā)揮其功能,構成MSTN成熟蛋白分泌至血液循環(huán),并與N-端前肽以非共價鍵形式形成 LAP(lantency-associated peptide)。隨后的研究表明,MSTN前肽不僅在C-末端折疊成正確的半胱氨酸結構中起著重要的作用,而且GDF-8前肽可以作為GDF-8生物活性的抑制劑[12]。在LAP,前肽維持C-末端二聚體成為無活性的、惰性的狀態(tài)。除了前肽,體外試驗表明,follistatin、FLRG、GASP-1也能夠與C-末端二聚體結合,抑制它的活性[13]。

此外，在GDF8蛋白的N-末端有非親水性氨基酸序列，作為分泌信號，在C-末端有保守的蛋白酶水解位點RSRR，一般有9個半胱氨酸位于C-末端形成“半胱氨酸節(jié)點”，其C-末端以二硫鍵形成具有生物學活性的二聚體發(fā)揮其功能[14]。MSTN基因在進化過程中非常保守,決定蛋白生物活性的 C末端區(qū)域在小鼠 、大鼠 、人 、豬 、雞 、火雞之間完全相同,表明這個基因的功能在脊椎動物中也高度保守[10]。小鼠MSTN基因cDNA序列中只有1個開放閱讀框架(opening reading frame,ORF),編碼376個氨基酸。GDF-8前肽C-末端區(qū)域對其功能的穩(wěn)定性具有重要的作用,抑制性區(qū)域位于第42-115位氨基酸之間[1]。

2 GDF8在卵母細胞中作用機制

卵母細胞體外成熟(IVM)成功的一個重要指標是卵母細胞的核成熟,這是通過減數分裂完成到中期(MII)來評估的,具有明顯擠壓極體的卵母細胞被認為是成熟的MII卵母細胞。在Song K和他的同事的研究中[15]，他們將MSTNP(MSTN抑制劑)組與對照組和空白組相比，發(fā)現在減數分裂的MII期卵母細胞數量明顯減少，說明MSTN可能在IVM期促進細胞核成熟中發(fā)揮重要作用[16]。

此外，卵巢產生的類固醇激素對于維持正常的卵巢功能有重要意義。眾所周知，卵泡由卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞組成。從排卵前的前腔卵泡(0.1 mm～0.2 mm)向有腔卵泡(0.2 mm～0.4 mm)的轉變過程需要顆粒細胞和膜細胞的快速生長以及卵泡腔的增大。在形成有腔卵泡之后，卵泡才會對促性腺激素產生反應。而顆粒和膜細胞是促性腺激素的活動場所，也是產生類固醇激素的場所。卵泡膜細胞對黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)作出反應，并在排卵前的有腔卵泡中產生雄激素和孕激素。顆粒細胞對卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)產生反應并產生雌激素。排卵前有腔卵泡內的顆粒細胞也會對黃體生成素作出反應并產生黃體酮，從而促進顆粒細胞的生長和分化以及卵母細胞的成熟來促進優(yōu)勢卵泡的發(fā)育。

早在Li Q等人的研究中就發(fā)現，TGF-β超家族成員的信號轉導是卵巢類固醇形成的必要條件，主要通過SMAD2/3通路參與調節(jié)卵母細胞產生的信號，這些信號對于協(xié)調排卵過程有重要意義[17]。為了探究GDF8和性激素的關系，Chang HM等人[18]用GDF8處理了體外培養(yǎng)的人顆粒黃體素細胞(human granulosa-lutein cells，hGL)，發(fā)現GDF8處理后細胞色素P450芳香化酶(aromatase)、FSH受體和雌二醇的水平均升高，而類固醇生成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)受體和孕酮的水平卻在GDF8處理后降低。

此外，促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)能夠刺激芳香酶/雌二醇的產生，LH誘導StAR/孕酮的產生。此外，Chang HM等人還發(fā)現，GDF8預處理24 h可增強FSH對芳香酶/雌二醇誘導的作用，同時GDF8可抑制LH對StAR/孕酮刺激的作用。Chang HM等人的研究結論也在Lin TT和他的同事研究中得到證實,Chang HM等人發(fā)現，GDF8的表達與竇性卵泡的生長呈正相關，同時GDF8可以促進雌二醇的產生，并增強顆粒細胞(GCs)對FSH的反應性[19]。

3 GDF8在卵母細胞中的信號通路

由轉化生長因子β(TGF-β)超家族傳遞的信號在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和再生、免疫反應、腫瘤抑制和轉移等方面有廣泛的作用，這些因素也控制著許多干細胞群的行為。TGF-β分泌因子，根據細胞類型、環(huán)境、配體表達和劑量，它們可以發(fā)揮多效性，有時是相反的細胞效應，包括增殖、分化、遷移和死亡。除了3個TGF-βs (TGF-β 1-3)外，該超家族還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)、生長分化因子(GDFs)、抗苗勒氏管激素(AMH)、激活素和Nodal。在后生動物的進化過程中，許多TGF-β家族成員及其下游通路成分都是保守的[20]。

在卵巢中，卵母細胞和GCs之間的雙向通信包括營養(yǎng)物質和信號的交換，信號之間通過自分泌和旁分泌的復雜調控網絡影響體細胞和卵母細胞的生長和分化。卵母細胞也能通過誘導CCs產生積極的調節(jié)因子來影響其自身的發(fā)育能力，而這些調節(jié)因子又反作用于卵母細胞。例如，去核卵母細胞或外源性重組GDF9或BMP15產生的因子能夠增加卵丘-卵母細胞復合物體外成熟(IVM)和體外受精(IVF)后囊胚形成率[11]。

TGF-β超家族成員傳遞信號主要通過膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸受體。后者通過磷酸化Sma-和Mad相關蛋白(SMAD)轉錄因子進一步調節(jié)下游基因表達。到目前為止，五個不同類型Ⅱ受體(BMPR2,ACVR2A,ACVR2B,TβR2和AMHR2)和7個Ⅰ型受體(也稱為激活素受體ALKs1-7)已在哺乳動物中發(fā)現[21]。所有這些受體都具有一個非常相似的結構，包括一個胞外結構域(N端)、一個跨膜結構域和一個具有Ser/Thr激酶活性的胞內結構域(C端)。TGF-β超家族成員的每個配體都能與Ⅱ型和Ⅰ型受體不同組合的胞外結構域(N端)結合并觸發(fā)下游信號復合物。

在GDF8信號傳導過程中，GDF8先被Ⅱ型受體ActRIIA/B識別，然后與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ型受體)ALK4/5[22]形成復合物。受體復合物的激活導致了細胞質傳感器受體調控的SMAD 2/3 (R-SMAD)的磷酸化。磷酸化R-SMAD2/3二聚體活化SMAD4 (co-SMAD)形成三元復合物，一同轉移到細胞核內[23]，與細胞核內特定的轉錄輔助因子共同調節(jié)靶基因轉錄[21]。

雖然活性Smad2和Smad3信號通路在顆粒細胞和腫瘤中的作用尚未確定，但大量小鼠突變體表明，在顆粒細胞中，Smad2和Smad3信號通路促進細胞增殖和腫瘤生長。例如，卵泡體細胞中激活素的缺失或smad2和smad3的缺失導致不育，但不會導致腫瘤的形成[20]。

另有研究報道，TGF- β可通過非SMAD信號通路激活ERK、JNK、p38 MAPK等MAPK激酶[24],而p38 MAPK在細胞凋亡、分化、存活、增殖、發(fā)育、炎癥和應激反應中都有著重要的作用。在豬的相關研究中，磷酸化的p38 MAPK在MI-MII轉化過程中調控卵母細胞減數分裂的恢復，在成熟過程中調控CCs的擴展。p38 MAPK激活的增加導致了壁顆粒細胞和CCs中表皮生長因子(EGF)樣通路的激活[25]。在卵母細胞成熟末期，如Cox-2、孕激素受體(PGR)、副調節(jié)蛋白(EREG)和雙調節(jié)蛋白(AREG)等EGF樣肽的刺激可能啟動卵丘細胞的擴張和排卵過程。還有研究表明p38 MAPK活性是小鼠胚胎植入前發(fā)育所必需的[2]。該研究在小鼠著床前發(fā)育過程中發(fā)現了PRAK、p38 MAPK、MK2和hsp25的mRNA表達和蛋白定位。還證明了激活的p38 a/h MAPK信號在8-16細胞階段到囊胚階段的發(fā)育過程中是必需的，p38 MAPK是著床前發(fā)育過程中絲狀肌動蛋白的調節(jié)因子[26]。

也有研究表明，BMP亞家族成員GDF8通過激活SMAD3和ERK信號通路降低類固醇生成急性調節(jié)蛋白(StAR)的表達[27](在人類GCs中，卵母細胞衍生的BMP15通過下調StAR的表達來減少黃體酮的產生)。

GDF8和GDF11是兩種具有相似結構和功能的密切相關的生長因子[32]，也是通過SMAD2/3蛋白以類似的方式發(fā)出信號。一般來說，生物反應的特異性主要由Ⅰ型受體決定，Ⅰ型受體以特定的SMAD蛋白為靶點，啟動特定的下游信號級聯(lián)[28]。盡管它們高度相似，但GDF11是SMAD2/3更強的激活因子，他能夠通過Ⅰ型激活樣受體激酶受體ALK4/5/7比GDF8更有效地發(fā)出信號，而活性的增強是由于Ⅰ型受體利用的差異。大量研究表明[8]，GDF8和GDF11均利用了Ⅰ型受體ALK4和ALK5，此外，GDF11還可以通過ALK7發(fā)出信號[29]，但GDF8是否也利用這種受體尚不清楚。

越來越多的證據表明，GDF8和GDF11兩個配體可能在功能上是不同的，相比之下，GDF11似乎作用更廣泛，然而，由于GDF11小鼠的胚胎致死率高，因此對GDF11在成年小鼠中的確切作用仍難以確定。此外，GDF8和GDF11的信號通路都受到細胞外蛋白拮抗劑的調控，包括FS、FSTL3、GASP1和GASP2[8]。

4 GDF8在常見家畜中的研究進展

GDF8的表達是近年來的研究熱點。在人和牛中，GDF8在顆粒細胞和卵泡液中均有表達[28,30]，GDF8在雞胚胎發(fā)生過程中廣泛表達于雞胚的各種組織，包括睪丸和卵巢[31]。然而GDF8對卵母細胞在家畜體外的成熟(IVM)和受精(IVF)作用研究較少。

表1 常見動物GDF8敲除的研究報道以及表型

4.1 豬

近年的一項研究確定了GDF8在豬卵母細胞體外成熟(IVM)中的作用。GDF8的表達與卵泡成熟呈正相關，卵泡越大，GDF8的表達量越高，這些都可能表明GDF8在卵母細胞成熟和卵泡形成過程中具有潛在的作用[2]。Yoon J D等[3]在IVM培養(yǎng)基中添加不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)的GDF8來研究GDF8對IVM的影響，該研究首次證明GDF8可以作為旁分泌因子調節(jié)豬卵母細胞IVM過程中p38MAPK磷酸化和細胞內ROS水平的變化，激活的p38 MAPK信號改變了卵母細胞成熟和與卵丘擴張相關的基因轉錄:如卵母細胞中的基因 Nrf2 and Bcl-2；卵丘細胞中的基因PCNA,Nrf2,Has2,Ptx3,and TNFAIP6。他們還得出結論，體外受精期間使用GDF8可以提高成熟卵母細胞的質量，并恢復由于與卵泡環(huán)境分離所缺失的細胞內信號。該研究在IVM過程中補充100 ng/mL GDF8，導致GDF8拮抗劑FST mRNA表達水平的升高[2]，因此推測，不適當水平的GDF8補充劑所引起的過度信號會通過這些相互作用產生異常代謝，從而導致CCs中凋亡細胞信號的表達。

Yoon J D等[3]首次證實了GDF8存在于豬輸卵管液中。GDF8對豬著床前胚胎的體外發(fā)育有顯著影響。此外，在體外受精過程中，GDF8的補充調節(jié)了特定基因的轉錄模式和細胞系分化蛋白的水平，如實驗組SOX2和CDX2明顯增多。胚泡由內細胞團(inner cell mass,ICM)和滋養(yǎng)層( trophoderm，TE)組成，ICM產生整個胚體，TE分化為胎盤，CDX2表達在豬TE細胞中被特異性檢測到。SOX2在豬胚泡中表達，它是一種多能性外胚層(EPI)標記。因此，該研究表明GDF8在IVC中的這些變化增強了IVF和PA后的胚胎著床前發(fā)育水平。

目前，僅有研究表明[37]GDF8基因雙敲除豬存在后肢無力和跛行等缺陷，GDF8對豬生殖性能的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究。這些基因如何編輯豬的繁殖性能？是否適宜用于大規(guī)模的的種用擴繁仍有待進一步研究。

4.2 牛

在牛的研究中，已經證明GDF8通過顆粒細胞表達，并可在小腔卵泡中檢測到。此外，El-Magd M A等[16]通過監(jiān)測成熟、IVF效率和卵裂率，探討GDF8抑制劑MSTNP顯微注射對水牛卵母細胞體外受精(IVF)及其潛在的發(fā)育能力的影響。發(fā)現GDF8能夠顯著降低細胞內活性氧(ROS)水平，而細胞內低ROS水平有助于細胞質的成熟和發(fā)育。因此，建議在IVM培養(yǎng)基中適當添加GDF8，以促進卵母細胞成熟，提高后續(xù)發(fā)育能力。雖然活性氧(ROS)的產生是細胞代謝的正常過程，這也已被認為是造成細胞損傷的主要原因。此外，ROS在卵母細胞體外成熟(IVM)中的作用及其對胚胎發(fā)育的影響仍存在爭議。有人認為ROS可能參與了卵母細胞的減數分裂阻滯，并且已經被認為是胚胎發(fā)育停滯和細胞死亡的主要原因[8]。

Luo J等[38]結合 ZFN 和 SCNT 獲得雙等位基因敲除牛，這些克隆牛在1月齡時就出現了肌肉肥大的雙肌臀表型。此外，該基因在牛上的研究主要集中于GDF8單核苷酸多態(tài)性，以及這些多態(tài)性與雙肌肉表型的相關性，從而進一步改進育種計劃。

5 GDF8在人卵巢中的研究

來自臨床的研究數據顯示GDF8可能參與人類某些生殖疾病過程，如子宮肌瘤、子癇前期和多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)[5]。比如GDF8的過度表達可能與PCOS的各種表型相關的排卵功能障礙、卵泡生長停滯和代謝紊亂有關。這些均表明GDF8可能在調節(jié)卵巢卵泡功能和發(fā)育中發(fā)揮功能作用[19]。

Chang H M等[28]首次證明GDF8在人顆粒細胞和卵泡液中表達，16個卵泡液樣品中含有平均濃度為3 ng/ml的GDF8蛋白。GDF8通過ACVR2A/ACVR2B-ALK5介導的SMAD2/3依賴性信號轉導下調了人顆粒細胞PTX3的表達從而調節(jié)卵巢功能。

事實上，PTX3在卵丘細胞中的表達水平已被證明與相應卵母細胞的質量和受精率呈正相關，患多囊卵巢綜合征的女性血清GDF8濃度高于無多囊卵巢綜合征的女性。因此，這些數據都表明GDF8下調PTX3的表達，抑制卵丘的擴張，從而導致PCOS患者排卵功能障礙。在正常生理條件下，GDF8可能被認為是顆粒細胞分泌的卵丘擴張抑制因子[28]，能夠在排卵前維持卵丘減數分裂停止。

此外，GDF8可以通過上調FSH受體(FSHR)表達來增強GC對FSH的響應性，下調LHR表達來抑制GC對LH的響應性。除了GDF8在調節(jié)類固醇產生方面的作用外，一項體外研究表明GDF8抑制人類GC增殖。這種負調控作用是由另一種生長因子，結締組織生長因子(CTGF)介導的，提示GDF8和CTGF可能參與了對人類卵泡發(fā)育過程中高度增殖和非增殖事件的調控[39]。

Lysyl氧化酶(LOX)是卵泡和卵母細胞成熟所必需的細胞外基質最終組裝和轉化的關鍵酶。在大鼠卵巢中，LOX表達水平與卵母細胞質量呈正相關。在許多器官中，CTGF是細胞外基質相關組織重構的主要介質。CTGF和LOX均在人GCs中表達，CTGF介導GDF8誘導的LOX活性增加和LOX蛋白表達。有趣的是，GDF8誘導人GCs CTGF表達上調是通過ALK5介導SMAD2/3-SMAD4信號通路發(fā)生的。這一發(fā)現與之前的研究不一致，在小鼠C2C12成肌細胞中，GDF8信號主要依賴于ALK4，而非ALK5，表明I型受體介導的GDF8下游信號具有細胞特異性[40]。其中，GDF8在成肌細胞中通過ALK4作用，而ALK5在非成肌細胞中介導GDF8誘導的細胞作用。在卵泡微環(huán)境中，局部產生的GDF8促進芳香化酶/雌二醇和FSHR的表達，抑制StAR /孕酮和LHR的表達并下調PTX3的表達。 此外，GDF8誘導CTGF的表達，這有助于抑制GC增殖和增加LOX活性[39]。

6 展望

以往關于GDF8的研究主要集中在其對肌肉的負調控作用上，從而篩選出具有優(yōu)良性狀的品種，更好的進行育種?，F在的研究不僅集中在卵母細胞成熟調控上，還有許多GDF8與GDF11的對比研究，現在的研究也有關于GDF11和GDF8在衰老中的潛在代謝作用，發(fā)現給予外源性rGDF11，而不是rGDF8，可以減少飲食誘導的體重增加，改善代謝穩(wěn)態(tài)。由于GDF8和GDF11的同源性很高，GDF11與GDF8有90%的氨基酸序列同源性，因此也有研究運用靶向方法區(qū)分和測定小鼠血清中GDF8和GDF11的絕對水平，采用一種基于LC-MS/MS平行反應監(jiān)測結合免疫沉淀的檢測方法，能可靠地鑒別GDF11和GDF8，并測定其在小鼠血清中的內源性水平。結果發(fā)現，雌性小鼠的GDF11和GDF8循環(huán)水平均隨年齡增長而顯著下降。人們期待有更多的研究來解釋GDF11和GDF8在卵母細成熟調控機制上的差異。

此外，目前的研究缺乏GDF8對COCs中一些重要的IVM相關基因如GDF9、BMP15的表達的影響。GDF9和BMP15是在卵母細胞成熟過程中表達的重要的卵母細胞分泌因子。需要進一步的研究來確定GDF8、GDF9和BMP15實際的分子機制，以及它們在IVM和隨后的發(fā)育階段如何協(xié)作。

GDF8在人的研究方面主要集中與GDF8與多囊卵巢綜合征的關系，有研究表明，卵泡液中高水平的GDF-8與多囊卵巢綜合征體外受精患者的低妊娠率有關，在人的研究中證明了PCOS患者卵泡液中GDF-8的異常表達會導致P4的異常表達，從而導致不良妊娠結局。

因此，全面地了解TGF-β超家族中卵母細胞分泌因子在哺乳動物卵巢中的生理作用，將為卵巢病理學研究提供重要的見解，并為研究生育調節(jié)提供新的方法，無論其目標是開發(fā)替代性的對抗性形式、診斷和治療人類不育，還是在人類輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)，體外受精胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)中開發(fā)出更安全可靠的方案都有很重要的意義[39]。另一方面，對卵巢內卵泡因子調節(jié)機制的研究也有助于開發(fā)新的方法來監(jiān)測和控制卵巢功能，為提高家畜、瀕危物種和人類的生育能力提供新的線索。