布魯氏菌的胞內(nèi)生存機制研究進展

馬忠臣，胡瑞瑞，李芮芮，王 震，努爾賽力克·努素甫，王 勇*，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，新疆石河子 832000；3.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；4.伊犁哈薩克自治州新源縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆伊犁州 835800)

布魯氏菌屬(Brucella)的病原菌屬于α-變形菌(Alphaproteobacteria)的α-2子群，其包含動物、植物病原體或共生菌體等多種細菌，這些細菌與真核宿主之間經(jīng)歷了長期的共同進化，很多生物學(xué)特性已經(jīng)發(fā)生了改變[1]。目前，布魯氏菌屬的成員越來越多，幾乎可以感染所有的哺乳動物，其中包括牛(Brucellaabortus)，羊(B.melitensis)，豬(B.suis)，綿羊(B.ovis)，駱駝、麋鹿、野牛(B.abortus)，犬(B.canis)，嚙齒動物(B.neotomae和B.microti)，猴子(B.papionis)和海豹、海豚、鯨魚等海洋哺乳動物(B.pinnipedialis和B.ceti)以及兩棲動物(B.inopinata)[2]。布魯氏菌在宿主體內(nèi)進化形成了一系列機制滿足其胞內(nèi)長期寄生與繁殖，藏匿于布氏小體(BCV)躲避早期宿主免疫殺傷是其胞內(nèi)生存重要的一步，但其詳細生存機制還需進一步研究。本文詳細介紹了布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)過程和相關(guān)分子機制，包括從eBCV到rBCV，再到aBCV的整個過程中布魯氏菌通過偽裝逃避、調(diào)節(jié)宿主分泌等滿足其自身生存，這對布魯氏菌胞內(nèi)生存機制的研究具有重要意義。

1 布魯氏菌病

布魯氏菌(Brucella)感染會引起宿主的布魯氏菌病(Brucellosis)，在動物中表現(xiàn)為流產(chǎn)、不育和跛行，人類可以通過吸入氣溶膠化的細菌、攝取、接觸被污染的組織或其衍生物而感染。山羊種(B.melitensis)，豬種布魯氏菌(B.suis)和牛種布魯氏菌(B.abortus)對人具有高致病性，此外，犬種布魯氏菌(B.canis)和嚙齒動物種布魯氏菌(B.neotomae)也會對人造成感染[3]。人感染布魯氏菌后會在急性期出現(xiàn)非特異性的類流感癥狀，如不及時采取抗生素治療，將會導(dǎo)致慢性感染，并最終引起反復(fù)發(fā)燒、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和心內(nèi)膜炎等全身衰弱性疾病。布魯氏菌感染在動物和人細胞水平上具有相同的病理和生理性特征，通過細胞內(nèi)循環(huán)來確保其存活、增殖和寄生(包括巨噬細胞和樹突狀細胞)[4]。流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus)最初在感染動物的胎盤中被發(fā)現(xiàn)，在上皮細胞和吞噬細胞感染模型中表現(xiàn)出了強的增殖能力，在研究布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)增殖的特性方面發(fā)揮了重要作用。

2 VirB Ⅳ型分泌系統(tǒng)

VirB Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)的表達是布魯氏菌毒力發(fā)揮的標(biāo)志，布魯氏菌T4SS是通過與植物病原農(nóng)桿菌的VirB T4SS同源鑒定而得來，研究發(fā)現(xiàn)，慢性布魯氏菌病的鼠模型以及牛、山羊和豬布魯氏菌的細胞模型中布魯氏菌復(fù)制必需T4SS的表達[5]。大量研究表明，VirB操縱子內(nèi)多種基因的缺失或插入會抑制布魯氏菌eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV，進而抑制布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制，也無法在小鼠中建立布魯氏菌慢性感染模型[6]，表明T4SS在rBCV生成和布魯氏菌胞內(nèi)增殖中具有重要作用。在許多胞內(nèi)寄生菌中，T4SS可以分泌傳遞效應(yīng)蛋白或核蛋白復(fù)合物，從而其發(fā)揮毒力作用，類比于那些使細菌發(fā)揮毒力的蛋白[7]?？茖W(xué)家推測布魯氏菌的VirB T4SS同樣可以將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運到宿主細胞中，跨過eBCV膜調(diào)節(jié)特定的細胞功能并介導(dǎo)rBCV的生成。后來，一系列分泌到宿主細胞中發(fā)揮作用的布魯氏菌T4SS依賴性效應(yīng)蛋白的發(fā)現(xiàn)證明了這一假設(shè)[8]，為了解布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)的潛在分子機制開辟了蹊徑。

3 布魯氏菌胞內(nèi)循環(huán)過程

布魯氏菌一旦入侵吞噬或非吞噬細胞，就會藏匿于膜結(jié)合隔室內(nèi)，該隔室被稱為布魯氏菌小體，簡稱布氏小體(Brucella-containing vacuole,BCV)(圖1)，布氏小體是基于原始吞噬體的概念，指細菌特異的膜結(jié)合小泡。早期通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，起初的BCV通常會沿內(nèi)吞途徑行進，依次獲取早期和后期的內(nèi)體膜標(biāo)記物，后被酸化，pH達到4.5[9]，這類似于完整的吞噬體成熟過程。基于布氏小體在感染細胞周期(感染后0至8 h)中具有內(nèi)體性質(zhì)，故將其稱為內(nèi)體BCV(eBCV)(圖1)[10]。

eBCV與內(nèi)吞區(qū)室相互作用后，小泡逐漸喪失內(nèi)體標(biāo)記物(感染后8至12 h)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)結(jié)構(gòu)持續(xù)相互作用，并最終獲得與ER膜相關(guān)的標(biāo)記物，如鈣網(wǎng)蛋白、鈣結(jié)合蛋白和Sec61β蛋白[11]，這表明該過程伴隨著eBCV膜的反轉(zhuǎn)和ER衍生膜的積聚。另外，這些含菌小泡還擁有了ER的結(jié)構(gòu)和功能特征[11]，這進一步表明eBCV已轉(zhuǎn)化為ER衍生的細胞器。這些結(jié)構(gòu)和功能的改變提供了促進布魯氏菌生長和復(fù)制的胞內(nèi)環(huán)境，有利于布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制。這些含菌小泡被稱為復(fù)制性BCV(rBCV)(圖1)[10]。

圖1 布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)的循環(huán)模型[2]

觀察rBCV的原始超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些小泡是單個存在的，在巨噬細胞或HeLa細胞中很少與ER相連[11]，而有研究則在滋養(yǎng)層細胞ER腔內(nèi)觀察到該結(jié)構(gòu)，故rBCV在宿主細胞中的確切定位尚不清晰。近年，Sedzicki J等[12]利用電子成像技術(shù)重建rBCV的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)rBCV與ER相連，并且可能也與ER和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運囊泡相互作用，表明了rBCV與宿主分泌途徑的緊密相互作用。布魯氏菌的增殖與其rBCV階段(感染后12 h至48 h)緊密相關(guān)，該階段會引起宿主細胞ER迅速重組形成rBCV網(wǎng)[11]。在布魯氏菌大量繁殖后，預(yù)示著布魯氏菌胞內(nèi)循環(huán)的另一個階段開始，新月狀膜結(jié)構(gòu)逐漸包圍吞噬rBCV，形成類似自噬體的有膜空泡，這些空泡具有后期溶酶體的特征[10]。這些重組的rBCV，稱為自噬BCV(aBCV)(圖1)，其在感染后48至72 h形成，引發(fā)布魯氏菌從感染細胞中釋放并侵染新的細胞，aBCV的形成加速了布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)的過程[10]。

布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)由eBCV到rBCV再到aBCV三個階段的連續(xù)循環(huán)具有功能和空間結(jié)構(gòu)的多樣性，它們是布魯氏菌持續(xù)感染的必要條件。20多年來，人們對布魯氏菌在這些階段中潛在的分子機制做了大量的的研究，試圖闡明其如何利用相應(yīng)的細胞途徑來完成其細胞內(nèi)循環(huán)。

3.1 eBCV階段

被吞噬細胞吞噬或侵入非吞噬細胞后，布魯氏菌最初位于吞噬體中，并迅速獲取早期內(nèi)體標(biāo)志物，包括控制早期內(nèi)體成熟的小GTPase Rab5和早期內(nèi)體抗原EEA-1[11]。由于這些標(biāo)記物的獲取途徑與典型的吞噬體相似，因此早期BCV可能會經(jīng)歷一段成熟的過程。與此相一致，BCV隨后獲得晚期內(nèi)體標(biāo)志物，例如溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1和LAMP2、CD63、以及控制晚期內(nèi)吞體與溶酶體融合的小GTPase Rab7[9]，這也表明了布魯氏菌感染后1 h內(nèi)BCV的成熟過程。重要的是，BCV也會被迅速酸化，pH達到4.5～5.0[9]，這進一步說明了BCV成為吞噬溶酶體的成熟過程。 然而，通過免疫染色法檢測布魯氏菌感染早期溶酶體內(nèi)容物向BCV轉(zhuǎn)運來證明BCV與溶酶體的融合卻未能觀察到組織蛋白酶D(cathepsin D)的集聚[9]。因此，研究者提出了這樣的猜想，盡管BCV已經(jīng)成熟，但仍會避免與末端溶酶體融合，從而防止布魯氏菌被免疫殺傷確保其胞內(nèi)存活。

幾項針對eBCV內(nèi)布魯氏菌生存能力的研究表明，由于eBCV內(nèi)存在殺菌環(huán)境，大部分(原代骨髓巨噬細胞中高達90%)進入宿主細胞的布魯氏菌被殺死[9]。Starr T等[9]使用活細胞成像技術(shù)熒光標(biāo)記溶酶體檢測可溶性溶酶體抗原，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞中的eBCV雖與末端溶酶體融合，但程度有限，表明eBCV逐漸成熟為類吞噬溶酶體的膜泡結(jié)構(gòu)。體外細胞模型中觀察到eBCV成熟同樣抑制了布魯氏菌的生存增殖能力，這有悖于人們對布魯氏菌細胞內(nèi)存活的常規(guī)認識。因此有人猜測，eBCV經(jīng)歷完整的溶酶體成熟過程不利于布魯氏菌的胞內(nèi)存活，但也不代表其完全被殺死，其中一小部分未沿著內(nèi)吞途徑成熟的BCV產(chǎn)生rBCV來完成菌體增殖和細胞內(nèi)存活。但是，相關(guān)研究表現(xiàn)結(jié)果與這種猜想并不太一致。首先，含有LAMP1 的eBCV與ER相互作用后獲得ER標(biāo)記物，暗示eBCV經(jīng)歷了向rBCV的轉(zhuǎn)化[11]。其次，eBCV酸化至末端溶酶體的pH值是rBCV的生成和布魯氏菌復(fù)制所必需，因為抑制溶酶體酸化會阻止eBCV向rBCV的轉(zhuǎn)化和布魯氏菌的增殖[9,13]。第三，抑制Rab7的活性可抑制eBCV與溶酶體的融合，阻礙eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV和布魯氏菌菌增殖的過程[9]，表明布魯氏菌后期需要功能性的內(nèi)吞和溶酶體融合途徑完成其細胞內(nèi)循環(huán)。第四，eBCV酸化對于誘導(dǎo)VirB T4SS表達至關(guān)重要[9]，eBCV成熟后T4SS迅速表達分泌，并在感染后4 h達到高峰[14]。綜上所述，eBCV階段是布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)的必要步驟，該階段提供了誘導(dǎo)VirB T4SS表達和最終eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV所必需的條件，如溶酶體pH。

eBCV除了誘導(dǎo)布魯氏菌T4SS的表達外，還可以促進復(fù)制性rBCV生成之前的布魯氏菌的生長。 Deghelt T M等[15]建立的熒光顯微鏡方法觀測到eBCV內(nèi)含有LAMP1的布魯氏菌在感染后8 h(即eBCV到rBCV的轉(zhuǎn)化階段)染色體開始復(fù)制，而G1阻滯期在菌體感染后6 h已經(jīng)開始。是由eBCV的內(nèi)體條件還是由轉(zhuǎn)化為rBCV期間的菌小泡內(nèi)變化促發(fā)了這種宿主細胞的周期性變化仍值得研究。以上這些發(fā)現(xiàn)表明布魯氏菌對BCV內(nèi)環(huán)境異常敏感，并且在eBCV階段就已經(jīng)開始生長，進一步強調(diào)了內(nèi)體階段在布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)中的重要性。

3.2 rBCV階段

3.2.1 ER在rBCV生成過程中的作用 rBCV的生成是布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)的重要標(biāo)志，其將原始的內(nèi)體含菌小泡轉(zhuǎn)化為可促進菌體增殖的ER來源的特殊細胞器。最初通過觀察rBCV的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，rBCV與ER融合并附有核糖體，后通過免疫熒光顯微鏡觀察、葡萄糖-6磷酸酶活性的膜內(nèi)檢測進一步證實了其膜上含有ER相關(guān)蛋白。葡萄糖-6磷酸酶是一種ER腔內(nèi)酶，對ER空泡毒素溶血素(ER-vacuolating toxin aerolysin)敏感[11]。BCV與晚期內(nèi)吞和溶酶體區(qū)室相互作用可能發(fā)生于ER出口位點(ERES)，ERES是ER子室，通過形成COPⅡ外載物囊泡(COPⅡ-coated cargo vesicles)而引發(fā)分泌轉(zhuǎn)運，其功能的發(fā)揮對rBCV生成很重要[16]。在eBCV到rBCV轉(zhuǎn)化過程中，依賴于T4SS與ERES COPⅡ外載物囊泡的持續(xù)相互作用(圖2)，并且抑制調(diào)控COPⅡ外套組裝以及ERES的形成和功能的小GTPase Sar1的表達，從而抑制了rBCV的生成和布魯氏菌增殖[16]。與這些結(jié)果相一致，另有研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌感染后通過未知機制上調(diào)了Sar1和COPⅡ組分Sec23和Sec24D的表達量[17]，表明布魯氏菌通過上調(diào)Sar1和COPⅡ介導(dǎo)的分泌囊泡的運動促進rBCV生成。因此，布魯氏菌可能通過增強分泌小泡的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)ERES功能，從而促進rBCV的生成，而分泌小泡的產(chǎn)生可能與eBCV融合，將其轉(zhuǎn)化為具有ER融合特性的小泡(圖2)，布魯氏菌可能因此繞開典型的內(nèi)體-高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過程而直接進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

3.2.2 UPR在布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)中的作用 另一種ER介導(dǎo)的與布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)密切相關(guān)的功能是未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded-protein response,UPR)。當(dāng)ER內(nèi)的錯誤折疊蛋白積聚觸發(fā)ER應(yīng)激時，ER上的UPR受體激活I(lǐng)RE1α、PERK、ATF6信號通路，并導(dǎo)致ER功能重組，增強ER的折疊能力，從而抑制蛋白質(zhì)合成以及引發(fā)自噬，以緩解ER應(yīng)激[18]。盡管對UPR過程還存在一定的分歧，但共識是布魯氏菌感染至少通過IRE1α途徑在巨噬細胞或HeLa細胞中誘導(dǎo)UPR[17,19]。此外，研究表明，IRE1α是布魯氏菌復(fù)制所必需的，?；撬崛パ跄懰釋Φ鞍踪|(zhì)錯誤折疊的治療作用會抑制山羊種布魯氏菌的復(fù)制[19]，這說明UPR有利于布魯氏菌的細胞內(nèi)循環(huán)。但是，這種應(yīng)激反應(yīng)是否以及如何促進rBCV生成和布魯氏菌的復(fù)制尚不清楚。Taguchi Y等[170]通過展示ERES定位蛋白Yip1A激活I(lǐng)RE1α的過程，揭示了UPR誘導(dǎo)、ERES和rBCV生成之間的聯(lián)系，Yip1A蛋白以依賴自噬相關(guān)蛋白Atg9和WIPI1的方式調(diào)控rBCV生成所必需的大型囊泡的形成。因此，這些發(fā)現(xiàn)說明布魯氏菌可能通過IRE1α途徑的激活而主動引起UPR從而促進激活級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致自噬特性的囊泡在ERES的形成，最終引起rBCV的生成(圖2)。

圖2 rBCV的VirB T4SS依賴性生物發(fā)生模型[2]

3.2.3 自噬是否參與了rBCV的生物發(fā)生 自噬(autophagy)是一種基于膜的過程，通常將細胞內(nèi)容物(胞漿內(nèi)容物、受損的細胞器、微生物等)捕獲到稱為自噬小體的雙膜囊泡中，并將其降解至溶酶體。雖然它具有先天性的免疫抗菌作用，但對某些病原體來說該過程可能是有益的?；贗RE1α和Yip1A在rBCV生成和布魯氏菌增殖中的作用，在ERES處形成的自噬小體可能提供ER衍生的膜，從而有助于eBCV到rBCV的轉(zhuǎn)化。然而，是否正常的自噬級聯(lián)反應(yīng)參與rBCV生物發(fā)生仍存在爭議。雖然最初提出自噬過程參與了HeLa細胞中rBCV的生成，BCVs中觀察到多膜結(jié)構(gòu)和溶酶體復(fù)合物單丹酰尸胺(monodansylcadaverine)的聚集[20]，但自噬結(jié)構(gòu)在巨噬細胞eBCVs中并未見到[11]。另外，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3也不在eBCV上積聚，這有悖于典型的自噬過程。此外，通過小干擾RNA(siRNA)抑制自噬因子(ULK1、beclin1、Atg5、Atg7、ATG16L和LC3B)參與的自噬體成核和延伸步驟，不能阻止rBCV的生成和布魯氏菌的復(fù)制[9]。因此，沒有實質(zhì)性證據(jù)證明自噬級聯(lián)反應(yīng)在rBCV生成中的作用。不過，自噬體成核蛋白WIPI1和自噬蛋白Atg9在rBCV生成中的作用已被證實[17]，暗示在rBCV生成過程中應(yīng)用了特定的自噬相關(guān)機制，這表明ERES和Atg9介導(dǎo)的膜傳遞過程和自噬體的形成過程介導(dǎo)了rBCV的生成。如要闡明自噬相關(guān)過程如何真正的促進rBCV生成，還需要更深一步的研究。

3.2.4 宿主細胞分泌途徑在rBCV生成中的作用 由于rBCV具有ER性質(zhì)，因此布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)中宿主細胞分泌途徑必然起著至關(guān)重要的作用。除ER外，ER-高爾基體中間區(qū)、高爾基體和反式高爾基體網(wǎng)(trans-Golgi network)是否對布魯氏菌有重要作用，還是一個值得探究的問題。研究表明，其他胞內(nèi)病原體可以充分利用這些細胞器室的功能，例如嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)通過阻逆依賴于Arf1和Rab1的分泌途徑來獲取ER衍生膜[21]，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)重定向高爾基體脂質(zhì)分泌途徑以獲取鞘脂(sphingolipids)[22]。通過藥物抑制宿主細胞分泌途徑發(fā)現(xiàn)，小GTP酶的顯性等位基因失活或siRNA沉默抑制ER-高爾基體分泌途徑，進而抑制rBCV的生成和布魯氏菌增殖[23]。另外，使用布雷菲德菌素A(brefeldin A)或siRNA抑制Arf1分泌途徑，rBCV的生成減弱至與Sar1基因缺失時相同的水平。ER-高爾基體之間轉(zhuǎn)運囊泡所分泌的小GTPases Rab1a和Rab2的缺失阻礙了巨噬細胞中流產(chǎn)布魯氏菌的復(fù)制[23]，這均表明在eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV的過程中，這些細胞器室之間復(fù)雜的囊泡分泌可能促進布魯氏菌的增殖。同樣，與布魯氏菌利用宿主細胞分泌途徑相一致，宿主細胞感染布魯氏菌后分泌轉(zhuǎn)運途徑以依賴T4SS的方式發(fā)生改變[24]，這表明布魯氏菌通過分泌效應(yīng)子來主動調(diào)節(jié)宿主分泌功能以促進其細胞內(nèi)循環(huán)。

3.2.5 rBCV生成過程中的布魯氏菌效應(yīng)蛋白 近年發(fā)現(xiàn)了15種VirB T4SS效應(yīng)子(表1)，其中一些可以從分子水平開始解讀rBCV生成機制和布魯氏菌增殖過程。VceC處于VirB T4SS核心位置，結(jié)合ER伴侶蛋白Grp78/BiP并誘導(dǎo)UPR，引發(fā)炎癥反應(yīng)[25]，但尚不清楚它是否在rBCV生成中發(fā)揮作用。TcpB/BtpA/ Btp1，一種含有TIR(Toll/interleukin-1 (IL-1) receptor)域的效應(yīng)子，可下調(diào)促炎癥反應(yīng)因子的表達[26-27]，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，一旦布魯氏菌形成rBCVs，也會誘導(dǎo)UPR并促進菌體增殖[19]，但它可能不參與rBCV的生成過程。與之不同的是，SepA可能參與rBCV的生成過程，因為布魯氏菌ΔsepA缺失突變體仍保留在eBCV中，無法生成rBCV[8]，但其作用方式仍然未知。

表1 布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白[2,28]

T4SS效應(yīng)蛋白BspA、BspB和BspF會抑制宿主蛋白分泌并促進布魯氏菌增殖[23,24]，這與布魯氏菌特異性靶向宿主細胞多種分泌途徑的假說相一致，可能是rBCV生成所必需的。雖然尚不清楚BspA和BspF的作用方式，但BspB的作用方式已被闡明[5]。BspB是rBCV生成和巨噬細胞中布魯氏菌增殖所必需的[23]。該效應(yīng)蛋白被布魯氏菌分泌到宿主細胞中并轉(zhuǎn)移至高爾基體，在這里它與保守寡聚高爾基復(fù)合體(conserved oligomeric Golgi,COG)[23]相互作用，COG是一種CATCHR家族多亞基復(fù)合體，作為高爾基體上分泌性Rab GTPases、高爾基系繩(Golgi tethers)和SNARE膜的相互作用中心，可沿著分泌途徑調(diào)節(jié)高爾基體和反向囊泡分泌性轉(zhuǎn)運[34]。COG的功能對于rBCV的生成和布魯氏菌復(fù)制很重要[23]，這暗示了布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)與高爾基體功能具有相關(guān)性。BspB-COG的相互作用改變了COG功能，并導(dǎo)致依賴于COG的高爾基體反向囊泡重定向至BCV，從而使BCV獲得了高爾基體來源的膜[23]，表明布魯氏菌在rBCV生成過程中可能從分泌物中吸收ER來源的膜(圖2)，但這一機制還有待確定。有趣的是，通過衰減Rab2的表達抑制高爾基體到ER的逆向轉(zhuǎn)運過程可減弱ΔbspB缺失突變體引起的布魯氏菌復(fù)制缺陷[23]，這表明BspB可能會影響宿主細胞逆向的分泌性轉(zhuǎn)運，從而將COG依賴性的高爾基體囊泡重定向到BCV。更有趣的是，T4SS效應(yīng)子RicA可控制rBCV的生成過程，其可結(jié)合Rab2的GDP結(jié)合域[30]，但其作用方式尚不清楚，因為它沒有表現(xiàn)出任何GEF(鳥嘌呤核苷酸交換因子)活性，這表明布魯氏菌分泌的幾種效應(yīng)蛋白可以協(xié)同作用來調(diào)節(jié)Rab2依賴性的囊泡分泌轉(zhuǎn)運并促進rBCV的生成。

總之，通過研究靶向宿主分泌途徑的VirB T4SS效應(yīng)蛋白揭示了布魯氏菌與宿主細胞內(nèi)區(qū)室相互作用的一些機制，研究其效應(yīng)蛋白的特性及破壞宿主細胞分泌途徑的機制是全面了解布魯氏菌的關(guān)鍵。

3.3 aBCV階段

已知在ER結(jié)合的rBCV中增殖是布魯氏菌致病過程的關(guān)鍵步驟，但數(shù)十年來，布魯氏菌如何在增殖階段后完成其細胞內(nèi)循環(huán)仍是未知的。許多病原體致宿主細胞死亡后被釋放，而布魯氏菌卻會維持其細胞內(nèi)生存環(huán)境，阻止宿主細胞的死亡。Starr等[10]觀察到在rBCVs增殖階段，即感染48 h之后，布魯氏菌藏匿位置由ER來源的細胞器轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂型砥趦?nèi)體和溶酶體特性的大囊泡，該過程伴隨著LAMP1的積累和酸化。觀察其超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些囊泡源自新月形膜結(jié)構(gòu)融合吞噬體形成的rBCV，被多個膜所包圍，缺乏典型的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3[10]。這些囊泡被稱為aBCV，其形成需要宿主細胞自噬成核功能，而不需要延伸復(fù)合物，因為beclin1、ULK1和Atg14L的缺失或沉默抑制了aBCV的形成，而自噬蛋白Atg5、Atg7、Atg4或Atg16L的缺失或沉默卻沒有[10]。因此，aBCV的形成應(yīng)該需要自噬相關(guān)分子機制，這可能代表了另一種自噬過程或表明布魯氏菌正在積極利用自噬途徑的離散功能來產(chǎn)生aBCV。

重要的是，aBCV的形成與布魯氏菌的釋放緊密相關(guān)，因為aBCV形成階段會產(chǎn)生新細胞的感染，而抑制aBCV的形成時則感染減少[10]。布魯氏菌是以自由狀態(tài)還是包含在結(jié)合膜的小泡中釋放仍然有待確定，但最初感染的細胞釋放布魯氏菌表明其釋放是一種非溶血性的胞外過程(圖1)?；赼BCV的自噬特性，有人提出一個科學(xué)假說，認為布魯氏菌的aBCV依賴性釋放過程是其利用宿主細胞自噬途徑的分泌功能將aBCV中的布魯氏菌傳遞到細胞外環(huán)境。

在細胞內(nèi)循環(huán)的最終階段，布魯氏菌可能通過VirB T4SS來調(diào)控aBCV的形成。rBCV的形成依賴于布魯氏菌T4SS的表達，要證明這一說法具有一定的難度，因為無法用反向遺傳學(xué)和構(gòu)建VirB T4SS缺失突變體等常用方法的形式進行驗證。Smith EP[35]通過控制啟動子表達使 VirB11 ATPase短暫地在細胞內(nèi)分泌，從而使T4SS增能，進而使布魯氏菌生成rBCV和增殖，然后在宿主細胞內(nèi)對布魯氏菌T4SS進行滅活，結(jié)果顯示，在aBCV形成和布魯氏菌釋放過程中需要VirB系統(tǒng)功能的表達，這表明T4SS效應(yīng)子可能調(diào)控布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)過程的最后階段。未來對于T4SS具體的特性研究可能會闡明aBCV形成和布魯氏菌釋放的分子機制。

4 展望

布魯氏菌與真核宿主緊密相關(guān)，其與宿主哺乳動物的長期共進化已將其復(fù)雜的細胞內(nèi)循環(huán)過程表現(xiàn)為對內(nèi)吞、分泌和自噬途徑中細胞器室的連續(xù)利用。布魯氏菌使用一系列T4SS效應(yīng)子和其他毒力因子來調(diào)節(jié)這些區(qū)室的功能，將其原始吞噬體裝配成ER相關(guān)的細胞器，隨后依賴宿主細胞自噬功能以完成自身的細胞內(nèi)循環(huán)，從而確保其胞內(nèi)存活、增殖和釋放。盡管已經(jīng)確定了十幾種布魯氏菌T4SS效應(yīng)子，但它們的作用方式以及對布魯氏菌細胞內(nèi)循環(huán)的作用還不甚明了。對于這些分泌蛋白功能特性的后續(xù)研究將會解決布魯氏菌在胞內(nèi)生存、致病過程以及調(diào)控宿主細胞功能等多方面問題。