石雞十二指腸嗜銀細(xì)胞的分布及形態(tài)觀察

劉雪君，劉筱蕾，葉亞瓊，戈婷婷，趙海全，張 暉,2*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，江西南昌 330045)

石雞(Alectorischukar)別稱美國鷓鴣，屬雞形目(Galliformes)，雉科(Phasianidae)，石雞屬(Alectoris)，廣泛分布于亞歐大陸，其野生數(shù)量的多少在一定程度上反映該地區(qū)的生態(tài)環(huán)境狀況。此外，石雞屬中型雉類，體格較大，且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美適口，具有高蛋白、高熱量、低脂肪、低膽固醇等特性[1]，其蛋也比雞蛋口感味道更佳，營養(yǎng)價(jià)值更高，并具有一定的觀賞和狩獵價(jià)值，經(jīng)濟(jì)價(jià)值大，養(yǎng)殖效益高。因此，人工繁育和養(yǎng)殖的商品用石雞越來越多，市場越來越大，是較常見的特種經(jīng)濟(jì)動物。此前亦有關(guān)于石雞的研究[2-4]，這些研究多為人工繁育、養(yǎng)殖技術(shù)和疾病防控方面的研究，對于石雞組織學(xué)，尤其是其消化器官組織化學(xué)方面的研究甚少[5-6]。本試驗(yàn)通過石蠟組織切片和Grimelius銀染法，對石雞十二指腸管壁內(nèi)嗜銀細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及其分布情況進(jìn)行觀察和分析，旨在了解石雞消化器官十二指腸的結(jié)構(gòu)，豐富禽類比較組織學(xué)內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 人工養(yǎng)殖70日齡商品用健康雄性石雞2只，平均體重362.3 g。2019年6月購于佛山市花園肉菜市場。采用三管齊斷法快速處死，盡量減少動物痛苦。迅速解剖，取十二指腸，切割小段，生理鹽水快速清洗內(nèi)容物后置于4℃預(yù)冷的固定液中。固定液：100 mL福爾馬林+900 mL磷酸緩沖液(PBS)。

1.1.2 主要試劑 硝酸銀、乙酸鈉、對苯二酚、亞硫酸鈉、乙酸、乙醇為天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 日本尼康YS100光學(xué)顯微鏡；重慶奧特SMARTe-320數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)；上海亞榮SZ-93A自動雙重純水蒸餾器；浙江益迪YD-1508石蠟切片機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)石蠟切片 石蠟切片流程參考先前的文獻(xiàn)[7]。十二指腸組織固定24 h后，自來水沖洗，上行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片5 μm厚。撈片于載玻片上，晾干備用。

1.2.2 Grimelius嗜銀染色

1.2.2.1 試劑配制 銀染液：1 g/L的硝酸銀水溶液，0.1 g硝酸銀溶于100 mL乙酸鈉緩沖液中(乙酸鈉溶液：95 mL甲液+5 mL乙液。甲液：1.64 g無水乙酸鈉+100 mL雙蒸水；乙液：1.2 mL乙酸+100 mL雙蒸水，pH 5～6)。60℃預(yù)熱 0.5 h。 還原液：對苯二酚1.0 g，無水亞硫酸鈉5.0 g，雙蒸水100 mL。45℃預(yù)熱 0.5 h。

1.2.2.2 染色流程 十二指腸石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟至蒸餾水，放入60℃預(yù)熱的硝酸銀緩沖液反應(yīng)3 h。蒸餾水速洗后放入57℃且預(yù)熱1 h 的還原液30 min。蒸餾水洗后，依次放入95%乙醇、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后用顯微鏡拍照。Grimelius嗜銀染色試劑配制和試驗(yàn)流程參考先前的文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果

2.1 嗜銀細(xì)胞在十二指腸絨毛中的分布

經(jīng)Grimelius銀染法染色后，嗜銀細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黑色，細(xì)胞核不著色，背景為棕色，對比鮮明(圖1，2)。在十二指腸壁內(nèi)，嗜銀細(xì)胞主要分布于黏膜層，且主要出現(xiàn)于絨毛及腸腺(圖1，2)，在黏膜下層、肌層和外膜未見到陽性細(xì)胞。小腸絨毛中的嗜銀細(xì)胞主要分布于固有層(圖1)，偶見分布于腸吸收上皮的基底部。嗜銀細(xì)胞多呈長條狀(圖1A，B)或紡錐形(圖1C，D)。嗜銀細(xì)胞胞體靠近中央乳糜管(圖1C，D)，或通過其胞質(zhì)突起伸向中央乳糜管(圖1A，B)，嗜銀細(xì)胞多呈封閉型。少有嗜銀細(xì)胞靠近吸收上皮游離面或有突起伸向腸腔，開放型嗜銀細(xì)胞稀少。

A.十二指腸絨毛吸收上皮基底部封閉型嗜銀細(xì)胞；B.十二指腸絨毛固有層封閉型嗜銀細(xì)胞；C，D.十二指腸絨毛固有層封閉型嗜銀細(xì)胞.，靠近中央乳糜管。黑色箭頭示十二指腸絨毛中典型的嗜銀細(xì)胞。

2.2 嗜銀細(xì)胞在十二指腸小腸腺中的分布

嗜銀細(xì)胞多位于十二指腸小腸腺處(圖2)，主要位于腸腺上皮細(xì)胞基底部或腺上皮細(xì)胞之間(圖2B，C，D，E，F(xiàn))。少數(shù)嗜銀細(xì)胞位于小腸腺之間的結(jié)締組織(圖2A，C)。嗜銀細(xì)胞形狀完整，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)深染，胞核陰性，細(xì)胞多呈紡錘形、錐體形或近圓形，并分別可見2個(gè)或1個(gè)胞質(zhì)突起伸向小腸腺管腔，呈開放型，但未見胞質(zhì)突起直接達(dá)到管腔(圖2C，E，F(xiàn))。多數(shù)嗜銀細(xì)胞位于腸腺上皮細(xì)胞基底部或上皮細(xì)胞之間，呈封閉型。

A.小腸腺間結(jié)締組織內(nèi)封閉型嗜銀細(xì)胞；B，D.小腸腺上皮細(xì)胞基底部封閉型嗜銀細(xì)胞；C.小腸腺上皮細(xì)胞基底部開放型嗜銀細(xì)胞； E，F(xiàn).靠近小腸腺腔，有突起伸向管腔的開放型嗜銀細(xì)胞。黑色箭頭示十二指腸小腸腺中典型的嗜銀細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

石雞十二指腸小腸腺處嗜銀細(xì)胞，平均每個(gè)400視野可見(14.3±2.6)個(gè)嗜銀細(xì)胞，密度為3.1個(gè)/mm2，其中封閉型嗜銀細(xì)胞平均每400視野有(11.0±2.1)個(gè)，開放型嗜銀細(xì)胞平均每400視野有(3.3±0.5)個(gè)；絨毛處嗜銀細(xì)胞，平均每個(gè)400視野內(nèi)可見(2.7±2.8)個(gè)嗜銀細(xì)胞，分布密度為0.6個(gè)/mm2，其中封閉型嗜銀細(xì)胞平均每400視野有(2.3±1.2)個(gè)，開放型嗜銀細(xì)胞平均每400視野有(0.3±0.3)個(gè)。十二指腸總嗜銀細(xì)胞平均每個(gè)400視野內(nèi)可見(8.5±2.8)個(gè)嗜銀細(xì)胞，分布密度為1.9個(gè)/mm2。小腸腺處嗜銀細(xì)胞的分布密度大于絨毛處的分布密度(圖3)。

圖3 石雞十二指腸腸腺及絨毛中嗜銀細(xì)胞的分布

3 討論

嗜銀細(xì)胞是一類廣泛分布于消化管壁內(nèi)的內(nèi)分泌細(xì)胞，其位置分散，數(shù)量龐大。先前也有嗜銀細(xì)胞在鳥類消化器官中的研究。王春蕾等人[9]在麻雀中的研究表明，整個(gè)消化道中，十二指腸嗜銀細(xì)胞達(dá)到每個(gè)視野內(nèi)1.5個(gè)嗜銀細(xì)胞，但不如腺胃密集。嗜銀細(xì)胞主要呈錐體形，大多數(shù)分布于上皮細(xì)胞基部，兼有內(nèi)分泌和外分泌的功能。郭紅瑞等人[10]在中國黃羽鵪鶉中的研究表明，十二指腸嗜銀細(xì)胞可達(dá)每個(gè)視野內(nèi)(6.95 ±3.05)個(gè)，主要分布在腸黏膜的固有層，少數(shù)分布在腸腺上皮，在腸黏膜上皮細(xì)胞之間分布很少。形態(tài)大多為錐形，少數(shù)呈梭形，其突起指向腸腺腔和沿腸絨毛方向，有內(nèi)分泌、外分泌和旁分泌功能。余鵬程等人[11]在珠頸斑鳩的研究表明，珠頸斑鳩十二指腸嗜銀細(xì)胞分布較上述兩種鳥類略多，平均每個(gè)視野內(nèi)(7.5±1.2)個(gè)細(xì)胞。俞詩源等人[12]在灰背隼小腸中的研究結(jié)果表明，十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度達(dá)平均每個(gè)視野(7.88±0.57)個(gè)。于保剛等人[13]研究錫嘴雀消化道嗜銀細(xì)胞表明，每個(gè)視野(0.55±0.68)個(gè)嗜銀細(xì)胞，嗜銀細(xì)胞數(shù)量明顯偏少。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，石雞十二指腸嗜銀細(xì)胞主要分布在小腸腺，少數(shù)分布在腸絨毛。石雞十二指腸嗜銀細(xì)胞的分布位置與麻雀相同，但與鵪鶉不同。石雞十二指腸內(nèi)嗜銀細(xì)胞分布數(shù)量為平均每個(gè)400視野內(nèi)(8.5±2.8)個(gè)細(xì)胞，分布密度與鵪鶉、斑鳩和灰背隼十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度相差不大，但明顯高于麻雀。

十二指腸是鳥類重要的消化器官和內(nèi)分泌器官，其管壁中含有大量的內(nèi)分泌細(xì)胞，總稱為嗜銀細(xì)胞。嗜銀細(xì)胞內(nèi)含有胺或能使氨前體進(jìn)行脫羧反應(yīng)變?yōu)榛钚园?，進(jìn)而調(diào)節(jié)消化道運(yùn)動、消化腺分泌與黏膜層上皮生長[14-16]。嗜銀細(xì)胞還能分泌胃泌素、腦-腸肽、5-HT等激素，用于刺激腸胃黏液分泌、平滑肌收縮和血管擴(kuò)張，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸蠕動和消化功能；此外這些激素還有調(diào)節(jié)攝食活動、進(jìn)食后血糖水平和代謝的作用[17]。本試驗(yàn)證實(shí)石雞十二指腸管壁內(nèi)含有大量嗜銀細(xì)胞，提示其對石雞的食物消化、營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育可能起著重要作用。

先前的研究表明[18]，動物消化器官組織結(jié)構(gòu)與食性相關(guān)。石雞是雜食性動物，但更偏向于植食性，主要以草本植物和灌木的嫩芽、嫩葉、漿果、種子和昆蟲為食[19]。先前有研究表明，肉食性鳥類十二指腸中嗜銀細(xì)胞通常分布較多，雜食性或植食性鳥類十二指腸中嗜銀細(xì)胞一般分布較少[7-11]。但也有例外，如林霞等人[20]在家鴿腸道嗜銀細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，植食性的家鴿十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度為平均每個(gè)視野(9.73±5.42)個(gè)嗜銀細(xì)胞，比上述肉食性的灰背隼更多，這可能與家鴿適應(yīng)長途飛行、進(jìn)食多、耗能大的生活習(xí)性有關(guān)。而呂曉慧等人[21]研究發(fā)現(xiàn)黃雀十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度為(1.40±0.55)個(gè)嗜銀細(xì)胞每個(gè)視野。與本研究比較，石雞同為雜食性且以食用植物為主，其十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度明顯高于黃雀，可能的一個(gè)原因是石雞體格更大，耗能更多，進(jìn)食量大，對消化吸收的要求更高，所以參與消化吸收的十二指腸嗜銀細(xì)胞數(shù)目也就更多。

嗜銀細(xì)胞主要是內(nèi)分泌細(xì)胞，少數(shù)具有外分泌功能。Nillson O等[22]認(rèn)為內(nèi)分泌細(xì)胞可能以外分泌方式將生物活性物質(zhì)排到腸腔。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在石雞，多數(shù)十二指腸壁內(nèi)的封閉型嗜銀細(xì)胞靠近絨毛中央乳糜管，或位于腺上皮細(xì)胞基底部，提示其能夠?qū)⒎置谖锱诺街醒肴槊庸芑蛏掀ぜ?xì)胞基底部外的血管，具有內(nèi)分泌功能。此外，十二指腸小腸腺處的嗜銀細(xì)胞有突起伸向小腸腺管腔，而小腸腺管腔與十二指腸腸腔相通，這提示嗜銀細(xì)胞可通過小腸腺管腔將分泌物間接排到腸腔，具有外分泌功能。