七清敗毒散質(zhì)量標準研究

郭遠治，邊小利，陳胡羚，王虹雅，李引乾*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100；2.略陽縣六畜興旺養(yǎng)殖有限責任公司，陜西略陽 724300；3.府谷縣動物疫病預防控制中心，陜西府谷 719400 )

七清敗毒散是由生石膏、金銀花、魚腥草、板藍根、忍冬藤、貫眾、甘草等中藥制成的一種中藥復方散劑，具有清熱解毒，清溫涼血，敗毒燥濕等功效。主要用于治療畜禽類溫毒、濕毒、疫癘等病毒性傳染疾病。隨著我國畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)的集中規(guī)?；螽a(chǎn)品中獸藥殘留問題成為了人們關(guān)注的焦點。而中獸藥因其天然性、多能性、毒副作用低、不易產(chǎn)生有害物質(zhì)殘留和耐藥性等優(yōu)點被獸醫(yī)臨床廣泛應用[1-3]。中獸藥散劑又因其制作簡便、價格低廉、使用方便等優(yōu)勢而備受青睞[4-5]。

目前，獸藥領(lǐng)域有許多中獸藥散劑的研究。Huang X等[6]研究證明以傳統(tǒng)中獸藥為基礎(chǔ)的中藥散劑能通過藥物治療保留胎盤來提高荷斯坦奶牛的生育能力；Yu B等[7]對“石苦秦”散劑從急性和亞慢性毒性及安全性藥理學等方面進行了研究。

本研究主要采用紫外分光光度法測定七清敗毒散中主藥金銀花的主要成分綠原酸的含量[8-9]，并用薄層色譜法對散劑中的主藥板藍根進行鑒別[10]。從性狀、含量測定及鑒別等多方面研究了七清敗毒散的質(zhì)量標準，為指導該散劑的生產(chǎn)、檢驗及儲存具有重要意義[11]。保證該制劑能發(fā)揮有效療效的同時，更要保證該制劑的安全性、穩(wěn)定性，減輕畜禽患病以提高畜禽產(chǎn)品安全性及質(zhì)量，有利于我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 七清敗毒散(1 000 g/袋，批號：20180602)、七清敗毒散金銀花陰性對照品、七清敗毒散板藍根陰性對照品，內(nèi)蒙古潤龍生物科技有限公司產(chǎn)品；綠原酸對照品(批號：110753-201814)、精氨酸對照品(批號：110872-201806)，天津市富宇精細化工有限公司產(chǎn)品；GF254薄層專用硅膠(批號：181012)，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計(SPECORD 50)，德國耶拿(Jena)分析儀器股份公司產(chǎn)品；電子分析天平(BS-210S)，德國賽多利斯(Sartorius)股份公司產(chǎn)品；漩渦振蕩器(QL-901)，其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(KQ5200)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 板藍根薄層色譜鑒別 取七清敗毒散樣品10 g，加稀乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至黏稠狀，加入乙醇50 mL，攪拌，超聲處理30 min，靜置，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作為供試品溶液。另取精氨酸對照品，加稀乙醇制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

薄層色譜法(藥典附錄ⅥB)試驗：吸取供試品溶液10 μL和對照品溶液2 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(自然干燥)，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上應顯相同顏色的斑點。結(jié)果3批供試品的色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，斑點不清晰，分離不徹底。參考鹽酸精氨酸的國家質(zhì)量標準，將展開劑改為乙醇-濃氨溶液(70∶30)。吸取供試品溶液10 μL和對照品溶液2 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(自然干燥)，展開，取出，熱風吹干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；另取不含板藍根的陰性對照藥品10 g，同法試驗。

1.2.2 綠原酸含量測定

1.2.2.1 吸收波長的選擇

(1)對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品6.60 mg置于10 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液溶解定容至刻度作為總儲備液。取總儲備液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容制得儲備液。分別精密量取儲備液2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL于25 mL容量瓶用50%的甲醇溶液定容，即為標準對照品溶液。

(2)光譜掃描：取標準品溶液適量，在200 nm～500 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描。

1.2.2.2 線性關(guān)系考察 取上述不同濃度的標準對照品溶液，搖勻后在322 nm處測定吸光度。

1.2.2.3回收率和精密度試驗 取已知含量的供試品，精密稱定，再加入一定量的綠原酸對照品，按供試液的制備方法同法制備，制成相當于綠原酸濃度分別為11.25 μg/mL、14.03 μg/mL、16.00 μg/mL的樣品。按照添量法在322 nm處測定吸光度，計算回收率。

將同樣3個濃度的樣品，在1天內(nèi)3次重復測定，求出批內(nèi)變異系數(shù)，并于1周內(nèi)隔天測定3次，求出批間變異系數(shù)。

1.2.2.4 含量測定 取本品于研缽中研細，精密稱取2.0 g，置25 mL容量瓶中，加50%的甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，冷至室溫，50%的甲醇溶液加至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液10 mL，用50%的甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，即為供試液，同一批次共制備8份供試品溶液，在322 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 板藍根薄層色譜鑒定

七清敗毒散中對板藍根的薄層色譜鑒定結(jié)果如圖1。

1、3.精氨酸對照；2.陰性對照；4.樣品1、3.Arginine contrast; 2.Negative contrast; 4.Sample

根據(jù)圖1得出結(jié)果，供試樣品的色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點；在陰性對照色譜中，在相應位置上沒有斑點，說明陰性無干擾。

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 光譜掃描結(jié)果 綠原酸對照品在200 nm～500 nm波長之間的掃描圖譜如圖2。

圖2 綠原酸掃描圖譜

綠原酸在322 nm處的有最大吸光度0.222 3，確定其最大吸收波長為322 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察 以不同濃度的標準對照液吸光度(A)為縱坐標，以濃度(C)(μg/mL)為橫坐標，繪制綠原酸標準曲線，如圖3。

圖3 綠原酸標準曲線

得直線回歸方程：A=0.037 3×C-0.009 9(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，綠原酸在13.2～66.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(圖3)。

2.2.3 回收率和精密度試驗 回收率試驗結(jié)果見表1，精密度試驗結(jié)果見表2。

綠原酸的平均回收率為98.77%，回收率范圍在70%～110%之間，日間和日內(nèi)平均精密度分別為0.356%和0.096%，均小于5%。顯示該方法可靠，無需進行濃度校正。

2.2.4 含量測定 含量測定結(jié)果見表3。

表3 七清敗毒散綠原酸含量測定結(jié)果

有上表可知，該批次七清敗毒散的綠原酸的平均含量為1.763 μg/mg。

3 討論

3.1 板藍根的薄層鑒定

參照《獸藥典》(二部)中藥質(zhì)量標準制備供試液[12]，板藍根取本品粉末10 g，加稀乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作為供試品溶液。結(jié)果顯示供試品溶液黏度過高，無法點樣。根據(jù)精氨酸在乙醇中的微溶性，將提取方法修改如下：取本品粉末10 g，加稀乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至黏稠狀，加入乙醇50 mL，攪拌，超聲處理30 min，靜置，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇1 mL，使其溶解，作為供試品溶液。參照藥典附錄ⅥB進行薄層色譜分析試驗：吸取供試品溶液10 μL和對照品溶液2 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(自然干燥)，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品的色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，斑點不清晰，分離不徹底。因此，本研究參考鹽酸精氨酸的國家質(zhì)量標準，將展開劑改為乙醇-濃氨溶液(70∶30)。

3.2 綠原酸含量的測定

綠原酸為酚酸類成分，具有良好的水溶性。但由于綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和鍵及多元酚，綠原酸水溶液易發(fā)生水解和氧化反應，雖然在制備供試溶液時使用的是 50%甲醇溶液，但也應該將樣品溶液貯存在避光低溫的環(huán)境中，試驗過程中應盡量避光操作，最好選擇棕色的容器。李紅英[8]等對比了高效液相色譜法和紫外分光光度法對金銀花中綠原酸質(zhì)量分數(shù)分析的結(jié)果，得出紫外分光光度法測定金銀花中綠原酸含量的方法簡便、易操作，且測定結(jié)果較準確，適用性強。因此，本研究選用紫外分光光度法，研究結(jié)果也表明該方法可用于七清敗毒散的質(zhì)量控制。