鉤吻素子和鉤吻素己對(duì)輕度認(rèn)知功能障礙模型小鼠的影響

唐模歡，王千詡，張華海，劉兆穎*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

鉤吻又名大茶藥、大茶葉、斷腸草等，為馬錢科(Loganiacease)植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth,GEB)的全草，雖是世界著名的劇毒植物，但其藥理作用也不可忽視，在中國(guó)古代就有醫(yī)書記載著鉤吻的臨床應(yīng)用，在傳統(tǒng)用法上，鉤吻常被用于治療機(jī)械性疼痛、神經(jīng)疼痛、焦慮、失眠、呼吸道疾病和癌癥等[1-3]。研究表明鉤吻的粗提取物和生物堿成分具有抗腫瘤、抗痙攣、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等多種生物學(xué)功能[4-5]。

鉤吻其所含成分眾多，有環(huán)烯醚萜類、生物堿、淄體、香豆素等，其中生物堿成分是鉤吻的主要活性成分，大約就有120多種已經(jīng)被分離鑒定[6]。鉤吻生物堿單體成分中鉤吻素子是所能提取到的含量最高的單體成分[7]，其毒性相對(duì)較低的藥理研究，表明具有良好的潛在抗焦慮作用[8]。而鉤吻素己[9]是鉤吻單體生物堿成分中已知毒性最強(qiáng)的一種單體成分，半數(shù)致死量(LD50)為18 μg/kg[10]。鉤吻素己中毒后在消化道中迅速分布造成動(dòng)物胃部痙攣，但在鉤吻生物堿成分中，鉤吻素己對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制活性最好，同時(shí)也被證實(shí)可作為良好的慢性疼痛治療藥物[11-13]。

長(zhǎng)期的焦慮情緒可以成為輕度認(rèn)知功能障礙疾病的誘因[8]。正因?yàn)殂^吻素子對(duì)焦慮癥等具有一定的治療作用[1,14-15]。而目前尚未有鉤吻素己在輕度認(rèn)知功能障礙方面的研究，故選取鉤吻生物堿中最具有潛力開發(fā)成抗焦慮藥物的單體成分鉤吻素子和毒性最大的單體成分鉤吻素己，探究鉤吻生物堿對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙疾病是否具有保護(hù)作用，觀察這2種單體成分對(duì)小鼠的動(dòng)物行為變化，同時(shí)探討鉤吻素己對(duì)腦部海馬組織的損害作用，對(duì)鉤吻在神經(jīng)方向的藥理機(jī)制完善和突破有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠，24只，雄性，體重20 g±5 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 鉤吻素子、鉤吻素己，成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；氫溴酸東莨菪堿，美國(guó)AbMole有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)(SuperMaze)，上海欣軟信息科技有限公司產(chǎn)品；大小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)儀器(XR-XM101)，上海SuperMaze有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑的制備 將鉤吻素子和鉤吻素己粉末用9 g/L氯化鈉注射液分別配制成濃度為10 mg/kg、20 μg/kg的溶液。東莨菪堿在行為學(xué)試驗(yàn)開始前1 h配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，配制方法參考高莉的報(bào)道[14]，同樣用9 g/L氯化鈉注射液配制成濃度為3 mg/kg的溶液，制備后放置4℃冰箱冷凍保存，以待實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)腹腔給藥。

1.2.2 小鼠的分組與給藥 將24只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分4組，即對(duì)照組、鉤吻素子組、鉤吻素己組和模型組，每組6只。對(duì)每組小鼠進(jìn)行稱重記錄初始重量，對(duì)照組和模型組腹腔注射等容積生理鹽水，鉤吻給藥組每只小鼠按體重 0.1 mL/10 g腹腔注射鉤吻素子，10 mg/kg；鉤吻素己，20 μg/kg，連續(xù)給藥12 h，每天上午9:00開始給藥。每天給藥后觀察小鼠的活動(dòng)情況，是否有死亡。

1.2.3 輕度認(rèn)知障礙小鼠模型的建立 從鉤吻干預(yù)性給藥第8天開始至第12天，造模周期為5 d，每天鉤吻給藥結(jié)束后1 h，除對(duì)照組外各試驗(yàn)組均一次性腹腔注射東莨菪堿3 mg/kg，注射體積為0.2 mL/10 g，構(gòu)建輕度認(rèn)知障礙小鼠模型[16]。且每天造模結(jié)束后0.5 h開始進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)觀察各組小鼠行為學(xué)變化，水迷宮實(shí)驗(yàn)周期為5 d。

1.2.4 Morirs水迷宮試驗(yàn) Morirs水迷宮[17]試驗(yàn)檢測(cè)空間記憶能力：將Morris水迷宮水溫控制在22℃～24℃，分為4個(gè)象限。平臺(tái)直徑7 cm，高30 cm，隨機(jī)放置在一個(gè)象限的中央。水池中注水，高出平臺(tái)約1 cm。試驗(yàn)進(jìn)行5 d，前4 d進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶獲取的能力，記錄小鼠到達(dá)平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。第5天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，測(cè)小鼠對(duì)學(xué)習(xí)記憶的重現(xiàn)能力，記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)及所在象限停留路程。

1.2.5 組織取樣 當(dāng)水迷宮試驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，立即將小鼠處死，在冰盒上解剖小鼠，取小鼠腦部海馬組織，并置于-80℃保存。

1.2.6 病理組織學(xué)觀察 取鉤吻素己組小鼠海馬組織進(jìn)行HE染色，通過取材、脫水、包埋及切片程序制備好石蠟切片，觀察小鼠腦部海馬組織形態(tài)學(xué)是否有損傷。

2 結(jié)果

2.1 小鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)包含到達(dá)平臺(tái)花費(fèi)的時(shí)間；平臺(tái)所在象限停留時(shí)間；平臺(tái)所在象限運(yùn)動(dòng)路程。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，第1天對(duì)照組、模型組和鉤吻給藥組小鼠逃避潛伏期均沒有明顯差別；第3天后，與對(duì)照組相比模型組的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)增加而增加，鉤吻素己和鉤吻素子組隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，逃避潛伏期變化不明顯。第5天后，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，模型組與對(duì)照組相比逃避潛伏期變化高度顯著，隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，鉤吻素子組與模型組相比，逃避潛伏期明顯減少。經(jīng)單因素方差分析可知，第3天模型組逃避潛伏期較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，第5天模型組逃避潛伏期較對(duì)照組增加呈現(xiàn)高度顯著(P<0.01)，提示模型組造模成功。第5天鉤吻素子組逃避潛伏期較模型組顯著減少(P<0.05)，提示鉤吻素子組小鼠較模型組學(xué)習(xí)記憶能力好。

A.對(duì)照組；B.東莨菪堿組；C.鉤吻素子組；D.鉤吻素己組

空間探索結(jié)果如下，穿越平臺(tái)次數(shù)見圖2，對(duì)照組小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)最多，模型組顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，鉤吻素子和鉤吻素己組介于模型組和對(duì)照組之間，其中鉤吻素子組效果最好，與定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示鉤吻素子對(duì)學(xué)習(xí)記憶是有影響作用的。平臺(tái)所在象限停留路程百分比見圖3，模型組小鼠較對(duì)照組在平臺(tái)所在象限的路程顯著減少(P<0.05)，而鉤吻素子組較模型組所在平臺(tái)象限的路程又顯著減少(P<0.05)，提示鉤吻素子對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶有影響。

A.對(duì)照組；B.東莨菪堿組；C.鉤吻素子組；D.鉤吻素己組

A.對(duì)照組；B.東莨菪堿組；C.鉤吻素子組；D.鉤吻素己組

2.2 小鼠海馬組織病理學(xué)變化結(jié)果

鉤吻素己組和對(duì)照組小鼠海馬區(qū)進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖4。

從圖4可以看出，鉤吻素己組與對(duì)照組相比，海馬CA1和CA3 區(qū)細(xì)胞固化萎縮，整個(gè)細(xì)胞深染；CA3區(qū)的細(xì)胞數(shù)量變少，但細(xì)胞壞死的數(shù)量增多。提示鉤吻素己對(duì)東莨菪堿造成的輕度認(rèn)知記憶障礙是有不具備保護(hù)作用的。而小鼠的海馬齒狀回(DG)區(qū)的細(xì)胞變化不明顯。但相比對(duì)照組來說，鉤吻素己組隊(duì)海馬前額葉皮層(PC)的損傷明顯，2個(gè)組對(duì)比，鉤吻素己組PC區(qū)細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)壞死細(xì)胞增多。

3 討論

采用東莨菪堿構(gòu)建輕度認(rèn)知功能障礙小鼠模型是常見的記憶損傷模型，東莨菪堿能夠干擾小鼠的空間參考記憶和空間工作記憶，與水迷宮試驗(yàn)結(jié)合[18-19]，能有效探究鉤吻生物堿對(duì)認(rèn)知功能障礙的影響[20]。該模型的造模方法十分簡(jiǎn)便，腹腔注射東莨菪堿可以引起膽堿能系統(tǒng)功能障礙，亦可造成動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力下降，使其出現(xiàn)認(rèn)知記憶障礙等癥狀。本實(shí)驗(yàn)造模參考高莉?qū)|莨菪堿不同給藥劑量對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，來建立東莨菪堿輕度認(rèn)知功能障礙小鼠模型和確定給藥劑量[14]。結(jié)果顯示，在水迷宮試驗(yàn)的定位航行階段中，模型組小鼠較空白組，小鼠的逃避潛伏期出現(xiàn)顯著延長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。說明在探索鉤吻對(duì)小鼠認(rèn)知功能障礙的行為試驗(yàn)中造模是成功的。

鉤吻素子是鉤吻中含量最高的單體成分，并且具有很多藥理作用，如抗焦慮、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，但在學(xué)習(xí)記憶方面的機(jī)制還沒有完善的研究。而鉤吻素己是鉤吻毒性最強(qiáng)的生物堿成分，應(yīng)用到藥物治療上一直研究難點(diǎn)。很多研究表明，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的其中重要機(jī)制是由于大腦中膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的逐漸減少，引起乙酰膽堿的含量的逐漸降低，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的減退。鉤吻素子和鉤吻素己都能通過血腦屏障進(jìn)入大腦，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)合鉤吻的臨床使用經(jīng)驗(yàn)和藥理研究進(jìn)展，探討鉤吻素子和鉤吻素己兩種生物堿成分對(duì)小鼠大腦認(rèn)知功能的預(yù)防保護(hù)作用。本研究在水迷宮試驗(yàn)中，由圖1可知在鉤吻素子作用下，小鼠的逃避潛伏期較模型組顯著減少，這說明鉤吻素子在給藥一段時(shí)間后可以保護(hù)小鼠在認(rèn)知方面免受東莨菪堿損傷。而鉤吻素己在水迷宮試驗(yàn)中對(duì)小鼠輕度認(rèn)知功能的保護(hù)作用不明顯，通過對(duì)海馬組織的HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)在該給藥劑量下，鉤吻素己造成小鼠腦部海馬區(qū)的CA3和PC區(qū)的細(xì)胞數(shù)量變少，壞死增多。而海馬組織是與學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)的重要區(qū)域，海馬組織細(xì)胞神經(jīng)元受到損傷則會(huì)加重記憶功能下降，造成認(rèn)知功能障礙[22]。由此推測(cè)，由于小鼠組織海馬細(xì)胞被鉤吻素己的毒性影響，其不具有認(rèn)知功能保護(hù)作用。

認(rèn)知功能損傷是神經(jīng)類疾病如焦慮癥、抑郁癥、阿爾茲海默癥等常見的臨床表現(xiàn)，而其中的學(xué)習(xí)記憶力受損又是認(rèn)知功能障礙中較為常見的一種表現(xiàn)[18-19,23-24]。而鉤吻生物堿既然能表現(xiàn)出抗焦率、抗抑郁癥活性，理論上也能夠?qū)W(xué)習(xí)記憶受損具有保護(hù)作用，通過實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了本研究的推斷是合理的，鉤吻生物堿成分的鉤吻素子對(duì)小鼠東莨菪堿引起的認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用。

綜上結(jié)果，本研究從鉤吻傳統(tǒng)應(yīng)用中了解到鉤吻對(duì)焦慮、抑郁方面疾病具有治療效果，并通過一系列實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證鉤吻對(duì)認(rèn)知功能障礙的推測(cè)是合理的，初步證實(shí)鉤吻素子可以預(yù)防東莨菪堿引起的輕度認(rèn)知功能障礙，改善動(dòng)物的行為和學(xué)習(xí)記憶能力，表現(xiàn)出保護(hù)性神經(jīng)作用，為鉤吻素子在今后作為一種良好的認(rèn)知功能障礙保護(hù)性藥物提供參考。