貓冠狀病毒熒光RT-RAA檢測方法的建立

張安潔,張 慧,殷文婷,肖望成,王 玥,魏 榮,代飛燕*,李曉成*

(1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)為有囊膜單股正鏈RNA病毒[1]，根據(jù)致病性，F(xiàn)CoV分為貓傳染性胃腸炎病毒(Feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)兩種生物型[2]。FECV多為慢性感染，主要引起貓輕微的腹瀉，治療后即可康復[3]；FIPV可引致貓傳染性腹膜炎(FIP)，病理變化為貓腹腔內出現(xiàn)纖維性漿膜積液和各組織肉芽腫性炎癥，少數(shù)貓會出現(xiàn)神經癥狀[4-6]，多為急性感染。FIP病程短，致死率高，危害嚴重，在世界范圍內存在[7-9]。

目前，國外已研發(fā)多種FCoV PCR檢測方法，如套式PCR、熒光RT-PCR等，但這些方法檢測周期長，操作復雜，儀器昂貴。重組酶介導等溫核酸擴增(recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification，RAA)是一種新型的核酸快速檢測方法，能在37 ℃～42 ℃下進行等溫擴增，10 min～20 min內檢測到目標核酸且靈敏度較高[10-11]，該方法已被應用于細菌、病毒、寄生蟲等多個領域的檢測[12]。本研究建立了FCoV熒光RT-RAA檢測方法，并對方法的特異性、敏感性等進行了驗證，在國內外尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產品；熒光RAA法檢測試劑盒、熒光RT-RAA法檢測試劑盒儀，奇天基因生物技術有限公司產品。

1.1.2 主要儀器 恒溫振蕩混勻儀(RAA-B6100)、核酸擴增熒光檢測儀(RAA-F1620)，奇天基因生物技術有限公司產品。

1.1.3 臨床樣品 疑似FCoV感染臨床樣品貓腹水、全血及糞便共計30份。通過生化、血常規(guī)、試紙條檢測確診為貓皰疹病毒(Feline herpesvirus，F(xiàn)HV)、貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)及貓細小病毒(Feline parvovirus,FPV)感染的陽性全血樣品，所有樣品均采自昆明瑪斯康特寵物醫(yī)院、紅河瑪斯康特醫(yī)院和昆明它它寵物醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設計與合成 7b基因位于FCoV基因組近3′端，在FCoV毒株中相對保守[13-15]。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫查找FCoV 7b基因序列，比對后選擇保守區(qū)域設計引物和探針，利用Oligo軟件設計5條引物和1條探針，均由華大基因公司合成，序列見表1。

表1 RAA的引物和探針

1.2.2 構建檢測標準品 依據(jù)參考毒株FIPV-79-1146(GenBank:DQ010921.1)的7b基因序列，合成片段克隆至PUC質粒構建標準品PUC-FIPV-7b，片段由華大基因公司合成。

1.2.3 病毒DNA/RNA提取及濃度測定 將臨床采集感染FHV、FCV、FPV的陽性樣品及疑似有FIP臨床癥狀的貓腹水、全血、糞便樣品，采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組，超微量核酸蛋白測定儀測定核酸濃度。

1.2.4 熒光RT-RAA/RAA反應體系 按照熒光RAA法檢測試劑盒說明書，取熒光基礎反應單元，分別向熒光基礎反應單元內加入25 μL緩沖液Ⅵ、15.7 μL ddH2O、2.1 μL上游引物(10 μmol/L)、2.1 μL 下游引物(10 μmol/L)、0.6 μL探針(10 μmol/L)及2 μL模板，將上述反應體系混勻，再向反應單元的管蓋上加入2.5 μL乙酸鎂，立即蓋緊管蓋，將反應單元放入RAA-B6100恒溫振蕩混勻儀進行充分混勻，混勻結束后將其置于RAA-F1620核酸擴增熒光檢測儀中，39 ℃反應20 min，實時觀察檢測結果。

1.2.5 引物、探針的篩選及條件優(yōu)化 將設計的5條引物和1條探針(表1)上、下游引物隨機配對，以濃度為4.7 ng/μL的PUC-FIPV-7b質粒標準品為模板，根據(jù)1.2.4中的反應體系進行配置，選擇起峰最早、斜率最大的1對引物進行反應條件的優(yōu)化；將反應條件分別設為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃下反應20 min，進行熒光RAA反應，檢測熒光強度，確定最佳溫度。

1.2.6 敏感性及特異性試驗 將構建的質粒標準品進行10倍比稀釋，濃度為1.97×100ng/μL～1.97×10-9ng/μL，以稀釋好的標準品為陽性模板，以超純水為陰性對照，進行熒光RAA敏感性擴增；以臨床采集的FHV、FCV、FPV陽性樣品及PUC-FIPV-7b質粒標準品為模板進行特異性試驗。

1.2.7 臨床樣品檢測 疑似FCoV感染臨床樣品腹水、全血及糞便樣品共30份，其中腹水16份，全血10份，糞便4份進行熒光RT-RAA檢測，同時進行FCoV套式PCR檢測[16]，擴增目的條帶為177 bp，送華大基因測序并用NCBI進行Blast分析。采用100%×((a+d)/n)計算兩種方法的總符合度。

2 結果

2.1 引物、探針及反應條件確認

用PUC-FIPV-7b質粒標準品為模板，將R1/F1、R1/F2、R2/F1、R2/F2、R3/F1、R3/F2這6對引物分別與探針P結合，以ddH2O為陰性對照(圖1)，結果表明，R3/F2與探針在反應2 min后開始起峰，相對其他5對引物R3/F2起峰最早，斜率最大，因此選擇R3/F2進行后續(xù)試驗。通過不同溫度的比對發(fā)現(xiàn)，當溫度在39 ℃時檢測標準品的起峰最早，且斜率最大。因此，確定最佳反應溫度為39 ℃，后續(xù)試驗反應條件確定為39 ℃反應20 min。

圖1 熒光RAA引物篩選

2.2 熒光RAA敏感性試驗

將PUC-FIPV-7b質粒標準品進行10倍比稀釋，其濃度為1.97×100ng/μL～1.97×10-9ng/μL，結果顯示(圖2)，當濃度低于1.97×10-5ng/μL時其擴增曲線與時間軸夾角小于20°，說明熒光RAA最低檢出限為1.97×10-5ng/μL，即1.97×101fg/μL。

圖2 熒光RT-RAA的敏感性試驗

2.3 熒光RT-RAA特異性試驗

以臨床采集的FHV、FCV、FPV的陽性樣品及PUC-FCoV-7b質粒為模板，ddH2O為陰性對照進行特異性試驗(圖3)，結果除PUC-FCoV-7b標準質粒在2 min內起峰，其他樣品均無擴增曲線。

圖3 熒光RT-RAA的特異性試驗

2.4 臨床樣品檢測

疑似FCoV感染臨床樣品分別進行熒光RT-RAA與套式PCR，熒光RT-RAA在檢測的30份樣品中，16份腹水有10份檢出陽性，10份全血有4份檢出陽性，4份糞便全為陽性；套式PCR檢測的30份樣品中，16份腹水有12份檢出陽性，10份全血有4份檢出陽性，4份糞便全為陽性，陽性樣品經測序比對結果均為FCoV。兩種方法的符合率為93.33%。

2.5 S基因測序與FCoV分型

20份FCoV陽性樣品中，11份樣品成功擴增并測序得到部分S基因序列，經遺傳進化分析顯示均為FCoV Ⅰ型(圖4)，樣品為S1-S14，其余均為已知基因型參考毒株。

圖4 FCoV部分S基因序列遺傳進化樹

3 討論

FCoV在貓聚集區(qū)如養(yǎng)殖業(yè)和動物庇護所中廣泛流行[17-18]。在英國，約40%的家貓顯示FCoV血清陽性[19]。在亞洲一些國家和地區(qū)，F(xiàn)CoV感染率可達到25%[20-22]。FcoV感染的診斷對疾病的控制具有重要意義，建立一種快速、可靠的診斷方法非常重要。目前國內沒有快速診斷FcoV感染的方法及診斷試劑，對該病的診斷多是通過動物的臨床癥狀及其他可能傳染病的排除。

重組酶介導等溫核酸擴增(RAA)是一種新型的核酸快速檢測方法，該方法的優(yōu)勢在于耗時短，等溫擴增，結果讀取多樣化。除了常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測外，還可通過熒光和側流層析試紙條方式讀取結果。該技術已被開發(fā)用于檢測多種疾病病原，如炭疽桿菌、布魯氏菌、裂谷熱病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒和馬爾堡病毒等[12,23-24]。根據(jù)病毒細胞適應性等特性，F(xiàn)CoV分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種基因型，F(xiàn)ECV和FIPV均存在兩種基因型。本研究對28株FCoV基因組比對分析，涵蓋所有基因型和生物型，選擇相對保守的7b基因設計引物，建立熒光RT-RAA方法，20 min即可完成檢測，與貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細小病毒均無交叉反應，對病毒核酸的最低檢測限為1.97×101fg/μL。以Addie D D[16]建立的FCoV套式PCR檢測方法為目的基因測序金標準，對30份臨床FCoV感染疑似樣品進行檢測，兩種方法的符合率為93.33%，但本方法檢測時效大大提高，結果證實本方法可用于臨床快速診斷，具有良好的應用前景。