雞毒支原體與滑液囊支原體雙重PCR檢測方法的建立與應用

朱小甫，吳旭錦*，李怡婷，孫 凱

(1.咸陽職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西咸陽 712000；2.旬邑縣動物疫病預防控制中心，陜西旬邑 711300；3.西咸新區(qū)凱歌牧業(yè)有限公司，陜西咸陽 712000)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)主要引起雞慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)，以流鼻涕、咳嗽、結膜炎和氣囊炎為特征[1-2]?；耗抑гw(Mycoplasmasynovialum,MS)可侵害雞關節(jié)滑液囊膜及腱鞘，引起滲出性滑膜炎、腱鞘炎及附關節(jié)和腳墊腫脹，此外還會造成生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)蛋下降，并且與呼吸道疾病有關[3-4]。MG和MS既可水平傳播也能垂直傳播，在雞群中凈化難度較大。自2017年以來，雞群支原體感染呈急劇上升趨勢，造成臨床上呼吸道問題以及產(chǎn)蛋下降和關節(jié)腫脹引起的癱瘓等問題層出不窮，嚴重影響了雞群正常生產(chǎn)，養(yǎng)殖場經(jīng)濟損失較大[5-7]。

由于支原體實驗室培養(yǎng)難度大、生長緩慢、分離鑒定耗時過長，甚至多數(shù)情況下難以分離成功，給支原體病確診造成很大困擾[8]。此外，支原體診斷常用血清學方法，但由于血清學方法敏感性較低、存在非特異性反應干擾等缺點，診斷的準確性不足。因此，為了對MG和MS準確診斷，需要開發(fā)更為準確特異的診斷方法。秦璐璐等[9]根據(jù)MG特異性序列fMG-2設計1對引物，建立了檢測雞毒支原體的PCR方法，對MG的最小檢出量為3 pg/μL，用建立的PCR方法對臨床采集的樣品進行檢測，同時對相應的樣品進行細菌分離，結果PCR的陽性檢出率為20.5%，細菌分離培養(yǎng)的陽性率為0.9%，表明PCR的敏感性高于細菌分離鑒定。丁美娟等[10]依據(jù)MS 16S rRNA序列設計引物，建立了檢測MS的PCR方法，該方法特異性好，能檢出MS的最低DNA量為1 pg/μL，對雞腫脹跗關節(jié)腔內(nèi)容物臨床樣品檢測，PCR檢出率為21.1%，顯著高于病原分離方法的9.2%。本研究擬針對MG和MS兩種病原建立雙重PCR方法，在一個反應體系中一次檢測這兩種病原，為臨床快速檢測區(qū)分MG和MS感染提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與喉頭棉拭子 2018年至2019年間采集陜西地區(qū)養(yǎng)雞場疑似MG感染的待檢組織病料(喉頭、氣管和肺)63份，疑似MS感染的腫脹關節(jié)樣品12份，喉頭棉拭子樣品260份。組織病料研磨離心后取上清液，關節(jié)樣品取關節(jié)液和刮取關節(jié)滑膜，喉頭棉拭子加適量生理鹽水浸泡后反復擠壓，取液體備用。

1.1.2 參考病毒與細菌 H9禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、Ⅰ群禽腺病毒4型、副雞嗜血桿菌和雞大腸埃希氏菌為咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室分離保存。

1.1.3 主要試劑 DNAiso regent、RNAiso plus、rTaq酶和dNTP等購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T easy載體克隆試劑盒購自Promega公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒均為生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品；DH5ɑ大腸埃希氏菌為咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室保存。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(2720型)，美國ABI公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(5424R)，德國艾本德公司產(chǎn)品；超微量紫外-可見光分光光度計(NanoDrop one)，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius)，英國SYNGENE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank中公開的MG基因序列L35043和MS 16S rRNA基因序列NR_044811，設計了4對引物，MG-F/MG-R和MS-F/MS-R引物用于構建陽性質(zhì)粒，MG-JF/MG-JR和MS-JF/MS-JR引物用于MG和MS核酸檢測，引物信息見表1。

表1 引物基本信息

1.2.2 組織病料中DNA的提取 吸取處理好的組織病料上清液100 μL置于1.5 mL無菌無酶離心管，加700 μL DNAiso regent裂解液，振蕩混勻后靜置10 min，室溫12 000 r/min離心1 min，將700 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入700 μL冰冷的無水乙醇，室溫靜置10 min，12000 r/min離心10 min，棄去液體，加入1 mL 70%無水乙醇洗滌一次，棄去液體后瞬時離心，用移液器吸取殘余液體棄去，自然干燥后用40 μL 超純水反復吹打溶解，即得DNA溶液。

1.2.3 MG和MS基因克隆 MG和MS兩個病原質(zhì)粒構建基因片段和擴增PCR反應體系一致，超純水17.0 μL，DNA溶液2.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，MG-F/MG-R引物各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR程序為：95℃預變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 40s，72℃ 1 min，共循環(huán)35次；72℃延伸5 min。MS擴增只更換引物為MS-F/MS-R。反應完畢電泳成像觀察。

1.2.4 MG和MS陽性質(zhì)粒的構建 PCR產(chǎn)物電泳后在紫外分析儀中切下目的條帶，將膠塊放入1.5 mL EP管中，每管加入Binding buffer 700 μL，55℃水浴10 min至膠塊充分融化，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2 min，8 000 r/min離心1 min，棄去收集管中廢液，在吸附柱中加入 500 μL 洗液，8 000 r/min離心30 s，棄去廢液，重復洗滌一次，棄去廢液后將吸附柱10 000 r/min空離心15 s，在吸附柱膜中央加入20 μL 55℃水浴預熱的Elution buffer，將吸附柱放入潔凈1.5 mL EP管中，室溫放置2 min，10 000 r/min離心2 min，離心管中液體即為回收的16S rRNA基因DNA片段。將回收的DNA片段與pGEM-T Easy載體連接，4℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐陽性LB培養(yǎng)基篩選，挑取單個菌落，37℃、200 r/min搖動培養(yǎng)，PCR鑒定陽性的菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序正確的質(zhì)粒分別命名為pGEM-T-MG和pGEM-T-MS。

1.2.5 MG和MS雙重檢測方法的建立 分別以MG和MS陽性質(zhì)粒做為模板，改變擴增體系和反應條件，確定單一PCR檢測方案。PCR反應體系，質(zhì)粒1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，MG-JF/MG-JR引物各0.5 μL，梯度增加rTaqDNA聚合酶用量(0.25 μL～1.0 μL)，用超純水補足25.0 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃ 30 s，退火溫度由52℃～58℃按1℃遞增，時間30 s，72℃延伸40 s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。MS擴增只更換引物為MS-JF/MS-JR。確定了MG和MS單一檢測的體系與條件后，組合2對引物，進行雙重PCR反應。反應體系中調(diào)整兩對引物比例，探索最佳反應體系。

1.2.6 MG和MS雙重檢測方法靈敏性試驗 用超微量紫外分光光度計測定陽性質(zhì)粒pGEM-T-MG和pGEM-T-MS的濃度，根據(jù)質(zhì)粒計算公式換算為質(zhì)?？截悢?shù)，混合后按10倍梯度稀釋質(zhì)粒溶液，用建立的方法進行PCR反應，測定方法的檢測極限。

1.2.7 MG和MS雙重檢測方法特異性試驗 用RNAiso plus試劑提取H9禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；提?、袢呵菹俨《?型、副雞嗜血桿菌和雞大腸埃希氏菌等DNA模板，用建立的方法檢測，驗證方法的特異性。

1.2.8 MG和MS雙重檢測方法臨床應用 用建立的檢測方法對收集的63份組織樣品、12份關節(jié)樣品和260份喉頭棉拭子樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 MG和MS基因擴增結果

通過PCR方法，從MG和MS陽性病料中成功擴增出了預期1 232 bp和805 bp的目的條帶(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性病料中MG基因片段擴增；2.陽性病料中MS基因片段擴增M.DNA Marker DL 2 000; 1.MG gene product of positive tissue; 2.MS gene product of positive tissue

2.2 MG和MS基因重組陽性質(zhì)粒的構建結果

回收PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后挑取單個菌落，菌液PCR為陽性后提取質(zhì)粒，EcoR Ⅰ酶切鑒定為陽性(圖2)，測序后NCBI Blast比對證實序列無誤，提示MG和MS基因重組陽性質(zhì)粒pGEM-T-MG和pGEM-T-MS構建成功。

M.DNA標準DL 2 000；1.pGEM-T-MS重組陽性質(zhì)粒酶切；2.pGEM-T-MG重組陽性質(zhì)粒酶切M.DNA Marker DL 2 000; 1.Enzyme digestion of recombinant plasmids pGEM-T-MS; 2.Enzyme digestion of recombinant plasmids pGEM-T-MG

2.3 MG和MS雙重PCR檢測方法的建立

通過單一質(zhì)粒、雙質(zhì)粒為模板的擴增體系和反應條件的探索，確定最佳PCR反應體系：超純水16.4 μL，質(zhì)粒 1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，MG-JF/MG-JR各0.8 μL，MS-JF/MS-JR各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL；最優(yōu)反應程序：95℃預變性3 min；94℃ 30 s、57℃退火40 s、72℃延伸45 s，共循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。

2.4 MG和MS雙重PCR檢測方法靈敏性試驗

用微量紫外-可見光分光光度計測定pGEM-T-MG和pGEM-T-MS質(zhì)粒濃度，用質(zhì)粒拷貝數(shù)計算公式換算并梯度稀釋質(zhì)粒，以1.0×106拷貝/μL～1.0×10-1拷貝/μL共8個濃度梯度為模板進行PCR擴增，由電泳結果(圖3)可知，建立的PCR方法檢測的極限為10拷貝/μL質(zhì)粒，該方法有很高的靈敏度。

M.DNA標準DL 2 000；1～8.質(zhì)粒濃度依次為1.0×106拷貝/μL～1.0×10-1拷貝/μL

2.5 MG和MS雙重檢測方法特異性試驗

用建立的雙重PCR方法擴增H9禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒cDNA，Ⅰ群禽腺病毒4型、副雞嗜血桿菌和雞大腸埃希氏菌DNA模板，同時用pGEM-T-MG和pGEM-T-MS質(zhì)粒作為對照。結果從pGEM-T-MG和pGEM-T-MS質(zhì)粒擴增出了810 bp和246 bp的目的條帶，從兩種質(zhì)?；旌衔镏袛U增出810 bp和246 bp兩個特異性條帶，其他5種病原均為陰性。提示所建立的方法特異性良好(圖4)。

M.DNA標準DL 2 000；1.pGEM-T-MG；2.pGEM-T-MS；3.H9；4.NDV；5.IBV；6.FAdV-4；7.副雞嗜血桿菌；8.雞大腸埃希氏菌；9.pGEM-T-MG+ pGEM-T-MS

2.6 MG和MS雙重檢測方法臨床檢測

應用該方法對63份組織樣品、12份關節(jié)樣品和260份喉頭棉拭子樣品進行檢測(圖5)，統(tǒng)計結果見表2。

表2 檢測結果統(tǒng)計

由表2可知，在組織和喉頭棉拭子樣品中均檢測出MG單陽性結果，總陽性率為7.8%(26/335)，關節(jié)樣品未檢出MG。MS單陽性結果在組織、關節(jié)和喉頭棉拭子樣品中均有檢出，總陽性率為31.3%(105/335)，尤其是關節(jié)樣品中陽性率高達58.3%(7/12)。MG和MS雙陽性率為17.0%(57/335)，提示二者混合感染現(xiàn)象比較普遍。總體看，兩種支原體感染率為56.1%(188/335)，表明雞群中MG和MS感染率很高。

3 討論

為了準確測定建立的檢測MG和MS雙重PCR方法的靈敏性，本研究從病料樣品中擴增了MG和MS基因片段，構建了兩種病原的陽性質(zhì)粒作為參照。通過MG和MS單擴增探索反應體系和條件后進行混合雙重PCR擴增，確定了最佳反應體系與條件。靈敏性檢測證實，建立的雙重PCR方法檢測的極限為10拷貝/μL質(zhì)粒，其靈敏度與單一PCR檢測相當[11-12]，比謝志勤等[13]建立的多重PCR方法靈敏度高，完全滿足臨床檢測對靈敏度的需要。特異性試驗表明，該方法僅對MG和MS核酸模板有擴增，檢測常見的雞群病原H9禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、Ⅰ群禽腺病毒4型、副雞嗜血桿菌和雞大腸埃希氏菌不發(fā)生交叉反應。在引物設計上充分考慮到圖像判讀問題，MG和MS擴增產(chǎn)物分別為810 bp和246 bp，條帶長度差異較大，清晰無雜帶干擾，結果判定直觀準確。

應用該方法對陜西地區(qū)養(yǎng)雞場2018年和2019年間335份樣品進行檢測，MG單陽性率為7.8%，MS單陽性率為31.3%，MG和MS雙陽性率為17.0%，兩種支原體總的感染率為56.1%，雞群中MG和MS感染率很高，MS比MG感染率更高，和馬爽等[14]對11個省份2010年至2015年間雞滑液囊支原體流行病學調(diào)查的平均發(fā)病率13.92%相比，MS陽性率上升不少，提示養(yǎng)雞場要高度重視支原體感染問題造成的經(jīng)濟損失。從樣品種類來看，喉頭棉拭子適用于MG和MS檢測，其具有來源簡單、采樣方便、便于處理檢測的優(yōu)點，可以推廣使用。臨床檢測進一步驗證了該方法的實用性良好，可用于MG和MS感染的快速診斷檢測。