奶牛犢牛腹瀉源大腸埃希氏菌耐藥情況及LEE相關(guān)基因的檢測

高?；?，王建東，高小斐，王培柱，吳學青，厲 龍，康曉冬

(1.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002；2.陜西省榆林市定邊縣樊學鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，陜西定邊 718699；3.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏吳忠 751100；4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)動物疾病預防控制中心，寧夏平羅 753200)

犢牛腹瀉是犢牛飼養(yǎng)中常見的、危害性較大的一種傳染性疾病,由致病性大腸埃希氏菌引起的占90%[1]，尤其使得7日齡以內(nèi)犢牛出現(xiàn)腹瀉，其發(fā)病率較高[1]、病死率很高[2]。 臨床上主要表現(xiàn)為動物消化機能損傷,出現(xiàn)腹瀉、發(fā)熱、脫水、消瘦，急性病例可突然死亡。在大群飼養(yǎng)環(huán)境中,犢牛腹瀉發(fā)病可達90%～100%，病死率高達30%以上[1]。大腸埃希氏菌是獸醫(yī)臨床上最常見的病原之一[3]，也是人和動物的腸道組織中探索較為清楚的細菌之一[4]。大腸埃希氏菌是一種條件性致病菌，受到環(huán)境、應(yīng)激、自身免疫力等影響會引起發(fā)病，患病機體還可能繼發(fā)感染其他病原，呈地域性流行。大腸埃希氏菌的血清型眾多，給大腸埃希氏菌病的預防帶來困難，目前仍沒有有效的疫苗可用于大腸埃希氏菌病的預防[5]，使用廣譜抗菌藥物為主要的治療手段，抗菌藥物在各個養(yǎng)殖場的普遍和大量使用使得大腸埃希氏菌耐藥性問題越發(fā)嚴重，包括禽、豬、牛、羊等源性菌[6-9]。大腸埃希氏菌的致病性越來越強，耐藥性和多重耐藥性也就越來越強，二者之間存在密切的聯(lián)系[10-11]，同時，細菌的毒力與其毒力島有著密切聯(lián)系。腸細胞脫落位點 (locus of enterocyte effacement, LEE) 毒力島。主要對動物的腸黏膜細胞產(chǎn)生黏附-抹去損傷，ler基因為LEE毒力島中心調(diào)節(jié)基因，eaeA基因編碼外膜蛋白緊密素[6]。因此，本試驗采集寧夏地區(qū)奶牛場1～2月齡腹瀉犢牛肛門拭子，開展腹瀉源性大腸埃希氏菌的耐藥性及LEE毒力島攜帶檢測，以期為預防及治療犢牛腹瀉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 于2018年1月至2019年9月采集寧夏地區(qū)5市16個規(guī)?；膛龈篂a犢牛(1～2月齡)肛門拭子157份，裝于滅菌離心管收集，標記時間，年齡，場別，4 h內(nèi)送回實驗室增菌培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)(20170704)，北京陸橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(20170704)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)(20170831)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；16S rRNA、eaeA、ler基因擴增引物，上海生物工程技術(shù)有限公司合成；藥敏試紙片，杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏陰性細菌鑒定卡、VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，法國梅里埃公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA標準DL600、2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 潔凈工作臺(SW-CJ-1FD),蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品；全自動細菌鑒定系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)，法國生物梅里埃股份有限公司產(chǎn)品； PCR儀(T-100)、電泳槽(Sub-Cell?GT Cell)、凝膠成像儀(Gel DocTMXR+)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希氏菌的分離 無菌采集的肛門拭子放入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管，37℃培養(yǎng)16 h～24 h，增菌培養(yǎng)物接種于EMB、MAC，37℃培養(yǎng)16 h～24 h，疑似菌鏡檢純化。

1.2.2 大腸埃希氏菌菌種鑒定 鏡檢為桿菌，純化培養(yǎng)物用電子比濁儀測定菌液濃度并調(diào)整為0.5個麥氏單位，全自動微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)進行菌種鑒定。

1.2.3 細菌16S rRNA鑒定 參考16S rRNA通用引物序列[12]，引物序列見表1。PCR擴增反應(yīng)體系為50 μL，上游、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足。擴增條件為：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 min，29個循環(huán)；72℃ 10 min。陽性產(chǎn)物測序，測得序列進行Blast比對。

1.2.4 藥敏試驗 選擇19種藥敏紙片，采用K-B法,根據(jù)臨床實驗室標準化委員會 (CLSI) 標準判定結(jié)果。

1.2.5 LEE相關(guān)基因PCR檢測 參考文獻設(shè)計ler[13]、eaeA[14]的特異性引物，具體見表1。eaeA、ler基因的PCR條件為：50 μL體系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O補全。eaeA基因的PCR條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，66.1℃ 30 s，72℃ 1 min，29個循環(huán)；72℃ 10 min；ler基因的PCR條件為94℃ 10 min；94℃ 40 s，57℃ 30 s，72℃ 30s，29個循環(huán)，72℃ 10 min。

表1 16S rRNA和LEE基因檢測引物序列及大小

2 結(jié)果

2.1 疑似菌的分離鑒定

共采集157份奶牛犢牛腹瀉樣本，分離得到62株疑似大腸埃希氏菌，革蘭氏染色可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌。純化培養(yǎng)后，VITEK 2 Compact進行生化鑒定，根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果，初步確定均為大腸埃希氏菌。

M.DNA標準DL 600; 1.陰性對照; 2～9.部分分離株16S rRNA PCR產(chǎn)物

2.2 大腸埃希氏菌的16S rRNA擴增

提取2.1鑒定為E.coli的基因組DNA，擴增16S rRNA基因，目的條帶為370 bp(圖2)，部分陽性產(chǎn)物送測序，Blast比對確定為大腸埃希氏菌。

M.DNA標準DL 600;1.陰性對照;2～13.部分分離株eaeA基因PCR產(chǎn)物

2.3 藥敏試驗結(jié)果

62株分離株對阿米卡星較為敏感，耐藥率為11.29%，對四環(huán)素耐藥率為100%耐藥，對阿莫西林、氟苯尼考、哌拉西林、氨芐西林、頭孢唑啉、復方新諾明、恩諾沙星、頭孢拉定、頭孢氨芐的耐藥率均大于90.00%，對頭孢曲松的耐藥率為87.10%，對鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率大于70%，對紅霉素、氧氟沙星的耐藥率分別為69.35%和58.06% 。具體見表1，按照藥物敏感程度依次排列。

表2 62株分離株藥敏試驗結(jié)果

2.4 LEE相關(guān)基因擴增結(jié)果

LEE毒力島基因ler和eaeAPCR產(chǎn)物大小與預期相符，攜帶eaeA基因的檢出率為11.29%(7/62)，攜帶ler基因檢出率為79.03%(49/62)，共檢出攜帶ler和eaeA兩種基因大腸埃希氏菌2株，檢出率為3.23%(2/62)。

M.DNA標準DL 600;1～10.部分分離株ler基因PCR產(chǎn)物

3 討論

大腸埃希氏菌病是由致病性大腸埃希氏菌引起的以新生和幼齡動物為主要感染者的腸道疾病，由某些血清型大腸埃希氏菌引起[15]，在嚴重情況下可導致死亡[16]。臨床上常見的動物性細菌疾病的病原菌多為大腸埃希氏菌，產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(ETEC)都是人獸共患的病原，牛是該病原的儲存庫[17]，細菌毒力影響動物感染的嚴重程度和范圍[18]。牛源大腸埃希氏菌及菌株耐藥性可以通過食物鏈、接觸傳播等途徑傳染傳遞給人類，造成身體損害。毒力島是成簇排列的毒力相關(guān)基因，是為20 kb～100 kb大小的染色體DNA片段，致病性大腸埃希氏菌中都存在毒力島，可能是一個或多個。LEE可以在其編碼的蛋白質(zhì)的分泌作用下發(fā)生種與種之間的變異[19]。

3.1 大腸埃希氏菌耐藥嚴重

寧夏地區(qū)牛源大腸埃希氏菌的耐藥情況越來越嚴重，這與飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)治療手段等密切相關(guān)。王理想等研究發(fā)現(xiàn)犢牛腹瀉大腸埃希氏菌對對恩諾沙星、頭孢噻吩不敏感，對慶大霉素、左氧氟沙星、卡那霉素高度敏感[20]。李慧等研究發(fā)現(xiàn)，石河子某牛場29 株犢牛腹瀉大腸埃希氏菌對阿奇霉素最敏感,對頭孢他啶、恩諾沙星、卡那霉素等的耐藥率均大于58.62%,而對青霉素、鏈霉素等表現(xiàn)出耐藥性[21]。韓和祥發(fā)現(xiàn)，肉牛場致犢牛腹瀉的50株致病性大腸埃希氏菌對多黏菌素、強力霉素、磺胺間甲氧嘧啶耐藥嚴重，對頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率較低[22]。吳同壘等發(fā)現(xiàn)，秦皇島地區(qū)的12株犢牛腹瀉大腸埃希氏菌，對林可霉素100%耐藥，對慶大霉素和阿米卡星的耐藥率均為83.3%;對氧氟沙星和諾氟沙星最敏感[23]。本研究顯示分離株對阿米卡星較為敏感，耐藥率為11.29%，對四環(huán)素耐藥率為100%耐藥，對其他藥物的耐藥率均大于58.00%，大多數(shù)處于90%以上。大腸埃希氏菌對抗菌藥物的耐藥機制十分復雜[24]，耐藥基因和整合子介導的機制是其中兩種[25]。耐藥的大腸埃希氏菌引起的疾病給牧場防治帶來壓力，除了濫用、無序地使用抗生素外，養(yǎng)殖生產(chǎn)中還把抗菌藥作為飼料添加劑來預防疾病,造成抗生素的殘留和大腸埃希氏菌耐藥性增強[26]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶/頭孢菌素酶(ESBLs/Ampc )大腸埃希氏菌是動物傳染病的潛在傳染源[27]，很多β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[28]，不同地區(qū)抗生素耐藥性有一定差異。我區(qū)治療相關(guān)疾病，可以首選阿米卡星。

3.2 LEE相關(guān)基因的檢測

LEE引起的病變?yōu)轲じ胶兔撀?，編碼的主要基因有eaeA、ler、espAB和SepA-I，LEE是外源基因，是為了適應(yīng)環(huán)境進化而來的，它借助于插入序列、整合酶、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒復制起始區(qū)等可移動性元件進入菌體[13]，使菌體產(chǎn)生毒力。大腸埃希氏菌通過細菌外膜蛋白緊密黏附素等局灶性黏附于小腸上皮細胞表面，引起病變。在腸桿菌科細菌中，LEE毒力島與致病性密切相關(guān)，常見于腸出血性大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌[13,19]。本研究中的62株分離菌，eaeA基因的檢出率為11.29%(7/62)，ler基因檢出率為79.03%(49/62)，ler和eaeA兩種基因共同檢出率為3.23%(2/62)，可能所檢測的大腸埃希氏菌中一部分為非致病性大腸埃希氏菌，也可能攜帶其他毒力島的相關(guān)基因，還需要進一步探索。LEE相關(guān)基因廣泛存在于各市區(qū)各奶牛場，可能是某些奶牛場犢牛腹瀉大腸埃希氏菌病的原因之一。寧夏地區(qū)人源LEE相關(guān)ler、eaeA基因的檢出率均為1.80% (3/167) ，低于研究中的檢出率，說明寧夏地區(qū)1～2月齡犢牛是LEE大腸埃希氏菌的潛在宿主。