Micro R NA-519d-3p對(duì)肝星狀細(xì)胞活化及凋亡的影響

武彥虎，丁向春，王 釗，馮薛煙，汪彭濤，海 龍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染疾病科，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

肝纖維化主要由慢性病毒性乙型或丙型肝炎、自身免疫性疾病、膽道疾病、酒精性脂肪性肝炎和越來(lái)越多的非酒精性脂肪性肝炎引起的一種肝內(nèi)慢性可逆性損傷修復(fù)反應(yīng)[1]。肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要效應(yīng)細(xì)胞，HSC的激活與增殖分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累，如果得不到有效治療，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝衰竭及各種終末期肝臟疾病[2]。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與靶基因miRNA序列3'末端非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，阻止其蛋白質(zhì)翻譯而起到轉(zhuǎn)錄后抑制作用[3]。miRNA在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究[4]表明，miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路，在HSC活化、肝纖維化相關(guān)細(xì)胞的調(diào)控以及肝纖維化發(fā)生發(fā)展中都起到了極其重要的作用。miR-519d-3p是一種新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miRNA，近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p在肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中的表達(dá)異常，本研究通過(guò)體外轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-519d-3p模擬物及其抑制劑轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞（人肝星狀細(xì)胞系），探討miR-519d-3p對(duì)HSC活化和凋亡的影響，為抗肝纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM培養(yǎng)基）（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶消化液（美國(guó)Gibco公司）；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒（凱基公司）；異丙醇、甲醇、乙醇、脫脂奶粉（BD公司）；PVDF膜（Milipore Corporation）；SYNERGY2型 酶 標(biāo) 儀（美國(guó)BioTek公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche公司）；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）；RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司）；SYBR染色法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）；引物（Sangon Biotech公司）；miR-519d-3p模擬物、抑制物及陰性對(duì)照序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX-2細(xì)胞從-150℃冰箱取出用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素）在10 cm2培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液，傳代，取3至6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-519d-3p模擬物（mimics）、miR-519d-3p模擬物對(duì)照物（mimics NC）、miR-519d-3p抑制物（inhibitor）、miR-519d-3p抑制物對(duì)照物（inhibitor NC）染LX-2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞作為對(duì)照組（con）。將LX-2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，將HSC-LX2以5×105細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)（96孔板每孔細(xì)胞數(shù)為2×103個(gè)），用不含雙抗10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔2 mL。次日，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度60%～80%后，開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑和miR-519d-3p合成說(shuō)明書(shū)操作：吸取8μL Lipofectamine RNAi MAX，8μL化學(xué)合成的miR-519d-3p，分別加入含150μL opti-MEM的1.5 mL eppendorf管中，然后將二者混合，室溫靜置5 min，分別加入6孔板對(duì)應(yīng)孔中，每孔250μL（96孔板每孔10μL），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，分析轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)LX-2細(xì)胞miR-519d-3p相對(duì)表達(dá)量及α-SMA I和Collagen ImRNA表達(dá)水平 將細(xì)胞按1.2.2方法處理，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取cDNA、SYBR熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行操作及分析。轉(zhuǎn)染及Real-time PCR所用序列如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算α-SMA及Collagen ImRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 轉(zhuǎn)染所用miRNAs及Real-time PCR所用序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)LX-2細(xì)胞α-SMA和CollagenⅠ的蛋白表達(dá) 按1.2.2方法將LX-2細(xì)胞種植在6孔板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)蛋白濃度，煮蛋白，以40μg/20μL對(duì)蛋白樣品進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h，封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜12 h，用TBST溶液洗滌一抗5 min，重復(fù)5次，二抗孵育1 h，用TBST溶液洗滌二抗5 min，重復(fù)5次，imaging system顯影。本實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-519d-3p對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響 按1.2.2方法將LX-2細(xì)胞種植在6孔板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000 r·min-1離心5 min）收集細(xì)胞，在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混勻；收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫避光反應(yīng)10 min；反應(yīng)后再加入450μL的Binding Buffer混勻；加入1μL Annexin V-PE混勻；室溫避光反應(yīng)10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后miR-519d-3p的表達(dá)

利用Real-time PCR檢測(cè)各組LX-2細(xì)胞中miR-519d-3p相對(duì)表達(dá)水平。miR-519d-3p mimics組的miR-519d-3p相對(duì)表達(dá)量高于con與mimics NC組（P均＜0.01）；miR-519d-3p inhibitor組的miR-519d-3p相對(duì)表達(dá)量低于con與inhibitor NC組（P均＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics與inhibitor的LX-2細(xì)胞中miR-519d-3p的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 miR-519d-3p對(duì)LX-2細(xì)胞活化的影響

Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中活化標(biāo)志物α-SMA和Collagen I mRNA表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-519d-3p能抑制α-SMA和Col lagen ImRNA表達(dá)，有抑制肝星狀細(xì)胞激活的作用（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，下調(diào)miR-519d-3p促進(jìn)α-SMA和Collagen ImRNA表達(dá)，有促進(jìn)肝星狀細(xì)胞激活的作用（P均＜0.01），見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中Collagen I mRNA表達(dá)水平比較

圖3 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中α-SMA mRNA表達(dá)水平比較

2.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白水平變化

結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-519d-3p可以抑制α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)，具有抑制肝星狀細(xì)胞激活的作用（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，下調(diào)miR-519d-3p促進(jìn)α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)，具有促進(jìn)肝星狀細(xì)胞激活的作用（P均＜0.01），見(jiàn)圖4。

2.4 miR-519d-3p對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響

miR-519d-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞48 h后，采用AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，miR-519d-3p mimics組可以促進(jìn)LX-2細(xì)胞的凋亡（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，miR-519d-3p inhibitor組可以抑制LX-2細(xì)胞的凋亡（P均＜0.01），見(jiàn)圖5。

3 討論

圖4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中活化標(biāo)志物CollagenⅠ和α-SMA蛋白表達(dá)水平情況

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-519d-3p對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響

miRNA是一種與肝纖維化發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的微小RNA。研究表明，越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在肝纖維化或者HSC活化過(guò)程中異常表達(dá)，如miR-134、miR-335、miR-126在肝纖維化的過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，具有抑制HSC的激活或者增殖作用；miR-10a、miR-34、miR-21在肝纖維化的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)HSC的激活或增殖作用。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，miR-519d-3p在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，在胰腺癌中，核糖體蛋白S15A（RPS15A）是一種各種人類(lèi)癌癥的新型致癌基因，RPS15A表達(dá)在胰腺癌細(xì)胞系中顯著上調(diào)，RPS15A被鑒定為miR-519d-3p的靶基因，過(guò)表達(dá)miR-519d-3p通過(guò)抑制RPS15A介導(dǎo)的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；在前列腺腫瘤中，miR-519d-3p在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-519d-3p通過(guò)降低DU-145前列腺癌細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（TRAF4）水平抑制其增殖[6]；在結(jié)直腸腫瘤中miR-519d-3p通過(guò)靶向營(yíng)養(yǎng)素相關(guān)蛋白（TROAP）在結(jié)直腸癌中抑制細(xì)胞增殖和遷移[7]；在宮頸癌中，miR-519d-3p靶向缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-2α）抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]；在乳腺腫瘤中，miR-519d-3p通過(guò)靶向LIM域激酶1抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)[9]。在滋養(yǎng)細(xì)胞中，miR-519d-3p通過(guò)靶向MMP-2抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲[10]；在胃癌中，MiR-519d-3p通過(guò)下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤6（bcl6）抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[11]。然而，miR-519d-3p對(duì)肝星狀胞的生物學(xué)功能及作用機(jī)制的研究還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。肝纖維化是各種終末期肝臟疾病必經(jīng)階段，其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積，最終導(dǎo)致肝纖維化；HSC是肝纖維發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源細(xì)胞，當(dāng)肝臟受到各種原因引起刺激時(shí)，HSC將由靜息狀態(tài)激活并大量增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加。另外，α-SMA和CollagenⅠ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，因此，檢測(cè)LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA和CollagenⅠ含量變化，可以間接反應(yīng)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)情況。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miR-519d-3p的模擬物和抑制劑來(lái)研究miRNA對(duì)HSC株LX-2活化和凋亡的影響。研究表明:miR-519d-3p mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后，Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics組α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染inhibitor組α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白水平表達(dá)增加。另一方面，將miR-519d-3p mimics轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而將miR-519d-3p inhibitor轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后，可以抑制細(xì)胞的凋亡。綜上所述，miR-519d-3p在HSC活化過(guò)程中具有抑制作用，可以促進(jìn)HSC的凋亡，抑制肝纖維化的進(jìn)展，為肝纖維化的治療指明了新的方向。