受體相互作用蛋白的功能及在硬骨魚類中的研究進(jìn)展

李凱晴 李瑩 王藝?yán)?鄒鵬飛

（1.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，廈門 361102；2.河口生態(tài)安全與環(huán)境健康福建省高校重點實驗室 廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院，漳州 363105；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021）

魚類是世界上最古老的脊椎動物，幾乎分布于所有的水生環(huán)境，而其中硬骨魚類數(shù)目占魚類總數(shù)的90%以上，約為脊椎動物數(shù)目的1/2［1］。與哺乳動物類似，硬骨魚類具有先天免疫系統(tǒng)（innate immunity）和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（adaptive immunity）［2］。先天免疫是硬骨魚類抵抗外界病原體入侵的第一道防線，主要通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別入侵的病原微生物而啟動，而適應(yīng)性免疫是生物對特定病原體產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答［3］。

一般認(rèn)為，動物發(fā)育過程中主要有3種細(xì)胞死亡方式：細(xì)胞凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）和細(xì)胞壞死（necrosis）。細(xì)胞凋亡是一種受死亡信號調(diào)節(jié)并伴隨天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活的細(xì)胞程序性死亡，不會引發(fā)周圍組織的炎癥反應(yīng)［4］；自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或受到損傷的情況下，由溶酶體介導(dǎo)的機(jī)體清除降解受損的或衰老的細(xì)胞器以及機(jī)體不再需要的生物大分子的過程［5］；而細(xì)胞壞死是指不受基因調(diào)控的意外的細(xì)胞死亡方式，這一死亡方式會伴隨炎癥反應(yīng)［6］。近年來，又發(fā)現(xiàn)一種有規(guī)律的細(xì)胞死亡方式——程序性壞死（necroptosis），它既受多種基因調(diào)控又呈現(xiàn)細(xì)胞壞死的一些特征，最終引發(fā)炎癥反應(yīng)［7］。程序性壞死是細(xì)胞在凋亡無法正常啟動時執(zhí)行的死亡方式［8］，與細(xì)胞凋亡不同，程序性壞死沒有caspase的活化，它會使受損細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）， 如一些先天免疫調(diào)節(jié)因子：白介素-1（interleukin-1，IL-1）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）、ATP和線粒體DNA等，最終激活吞噬細(xì)胞識別清除受損細(xì)胞。

受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）又叫受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK），作為細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的重要接頭蛋白，不僅在炎癥反應(yīng)和先天免疫中起著重要作用，在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程中也起著關(guān)鍵作用［9-10］。RIP家族是一類具有蘇氨酸/絲氨酸激酶活性的蛋白，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了包含RIP1-7共7個成員，都具有相對保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）。RIP家族成員由于其特定的結(jié)構(gòu)域而參與包括細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)在內(nèi)的不同生物過程，或可接受細(xì)胞表面受體傳遞的胞外刺激，或可參與模式識別受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。本文主要綜述了RIP家族成員在細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)、先天免疫等不同生物過程中的作用以及在硬骨魚類中研究的最新進(jìn)展，旨為深入解析硬骨魚類乃至哺乳動物的抗病免疫反應(yīng)提供一些思路。

1 RIP1和RIP3

1.1 RIP1和RIP3的分子結(jié)構(gòu)和功能

RIP1是RIP激酶家族的第一個成員，于1995年被發(fā)現(xiàn)并鑒定為具有C末端死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）的新型蛋白激酶，可以與Fas受體的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，因此被稱為“受體相互作用蛋白”［12］，RIP3則是第三個被鑒定出的RIP家族成員。RIP1和RIP3在結(jié)構(gòu)上相似，N端均為激酶結(jié)構(gòu)域，可催化自身磷酸化；中間域也均包含RIP同源相互作用基序（receptor-interacting-protein homotypic interaction motif，RHIM），可介導(dǎo)與其他含RHIM的蛋白相互作用，如β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白（TIR domain-containing adaptor-inducing IFNβ，TRIF）和DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI）［13-15］，以及參與下游核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）的活化［16］；RIP1 的 C 端為死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD），參與介導(dǎo)同型蛋白之間的相互作用，如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNF-receptor 1，TNFR1）、死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白（TNF-receptor-associated death domain，TRADD）［17］，而 RIP3不具有 DD 結(jié)構(gòu)域（圖1）。RIP1和RIP3廣泛表達(dá)于胚胎和成體組織中，RIP1敲除嚴(yán)重抑制了成熟T細(xì)胞在抗原受體誘導(dǎo)下的增殖反應(yīng)［18］，RIP1缺失會使成纖維細(xì)胞對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感，RIP1基因敲除小鼠出生3 d后無法存活［19］，而RIP3基因敲除小鼠可以存活下來［20］，這表明RIP1在個體生長發(fā)育和生存中必不可少，同時暗示著RIP3在個體生長發(fā)育過程中的功能或可被替代。

哺乳動物中有大量研究表明，RIP1是炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。RIP1通過激酶依賴性和非依賴性方式調(diào)節(jié)炎癥信號，響應(yīng)TNF和Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）家族配體的刺激［20-21］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）與其受體TNFR1結(jié)合后，通過接頭蛋白TRADD將RIP1募集到TNFR1上，同時還招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）、凋亡抑制蛋白 1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）和 cIAP2，最終形成初始質(zhì)膜結(jié)合復(fù)合物Ⅰ［22］（圖2）。其中，TRAF2和cIAPs催化RIP1多聚泛素化［23］，多聚泛素化的RIP1激活NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，而RIP1通過激活NF-κB促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)［24］。在缺失cIAPs或泛素連接酶的情況下，RIP1依賴其激酶活性與FADD和caspase-8前體結(jié)合，形成了復(fù)合物Ⅱ，促進(jìn)caspase-8前體加工剪切成其活性形式，從而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，啟動經(jīng)典的caspase依賴性細(xì)胞凋亡［25］（圖2）。有報道顯示，泛素連接酶Pellino3能夠以RIP1為靶點抑制TNF誘導(dǎo)的復(fù)合物Ⅱ的形成［26］。RIP1在TNF誘導(dǎo)的信號通路中具有雙重作用——通過泛素化作用激活NF-κB和MAPK信號通路參與炎癥反應(yīng)，和RIP1去泛素化激活caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同一種蛋白的不同作用形式觸發(fā)兩條完全相反的途徑，表明了RIP1在決定細(xì)胞命運方面起著關(guān)鍵性作用。

圖1 哺乳動物 RIP 家族成員及蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Protein domain of mammalian RIP family members

RIP1不僅在調(diào)控TNF信號途徑中扮演關(guān)鍵角色，在TLR3和TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也發(fā)揮重要作用。TLR3和TLR4通過接頭蛋白TRIF間接作用RIP1，這種相互作用依賴于TRIF和RIP1中共有的RHIM結(jié)構(gòu)域［27-28］。當(dāng)TLR3和TLR4分別識別進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒雙鏈RNA（dsRNA）和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）時，TLR3直接與TRIF結(jié)合，而TLR4通過招募β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白相關(guān)接頭分子（TIR domain-containing adaptor-inducing IFNβ-related adaptor molecule，TRAM）與 TRIF結(jié) 合，TRIF再通過RHIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與RIP1的相互作用（圖2），RIP1通過其激酶活性募集和活化FADD和caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。此外，TRIF和RIP1以及TRAF6和泛素連接酶Pellino1形成復(fù)合物，隨后募集和活化轉(zhuǎn)化生長因子激酶（TGFβ-activated kinase，TAK）、轉(zhuǎn)化生長因子激酶靶蛋白（TGFβactivated kinase binding protein，TAB）和 IκB 激 酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）復(fù)合體，最終介導(dǎo)下游NF-κB信號的激活從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)［29］。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（fas-associated death-domin-like IL-1βconverting enzyme inhibitory protein，F(xiàn)LIP）會 抑 制TRIF-RIP1復(fù)合物激活FADD和caspase-8從而阻斷細(xì)胞凋亡［30］。模式識別受體維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ）識別病毒RNA后，招募下游接頭分子線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS），隨后募集和活化RIP1、FADD和TRADD等形成線粒體相關(guān)復(fù)合物，介導(dǎo)下游干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factors，IRFs）和 NF-κB 的 激 活［31］。 而活化的caspase-8能夠剪切RIP1，抑制了RIP1對RIG-Ⅰ復(fù)合物下游IRF3的激活［32］。目前，有關(guān)RIP1在細(xì)胞死亡和TLRs所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的作用機(jī)制得到了較深入的研究，但對于其在RIG樣受體（RIG-Ⅰ like receptors，RLRs）所介導(dǎo)的信號通路中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

RIP1通過激酶依賴性和非激酶依賴性兩種方式調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡［33］。RIP1不依賴其激酶活性形成TNF誘導(dǎo)的死亡復(fù)合物Ⅰ來參與炎癥反應(yīng)；同時，也可通過其激酶活性誘導(dǎo)caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和RIP3-MLKL（mixed lineage kinase domainlike protein）介導(dǎo)的程序性壞死［34］。有大量研究表明，RIP1和RIP3在介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死方面起著重要的作用［11，35-36］。當(dāng) caspase-8 的蛋白活性受到抑制時，RIP1通過RHIM結(jié)構(gòu)域與RIP3相互作用，同時，RIP1和RIP3依賴各自激酶活性催化自身磷酸化［37］，形成一個磷酸化驅(qū)動的壞死小體，RIP3再募集和磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上破壞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［38-39］（圖2）。有報道顯示，RIP1和RIP3基因敲除小鼠與RIP1和MLKL基因敲除小鼠的存活時間比只敲除RIP1基因小鼠長幾天［30，40-41］，表明RIP1和RIP3或RIP1和MLKL的同時缺失可能造成壞死小體無法組裝，從而阻斷細(xì)胞程序性壞死，為生物體提供了一定的保護(hù)作用。敲除小鼠成纖維細(xì)胞中的TRAF2基因可促進(jìn)RIP1-RIP3-MLKL壞死小體結(jié)合，觸發(fā)程序性壞死［42］。cIAPs和TAK1通過抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死小體介導(dǎo)的活性氧（ROS）產(chǎn)生從而阻斷細(xì)胞程序性壞死［43-44］。RIP3可以調(diào)控包括TLRs、TNF和DAI在內(nèi)的多種信號途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［40，45-46］。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，TRIF可以不經(jīng)過RIP1直接招募RIP3啟動程序性壞死［47］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)受體DAI在識別病毒雙鏈DNA后，可以通過RHIM結(jié)構(gòu)域的相互作用直接招募RIP3，催化RIP3磷酸化并形成寡聚體，導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［48］。目前的研究表明，程序性壞死主要發(fā)生在凋亡通路受到抑制的情況下［49-50］，RIP1-RIP3-MLKL形成壞死小體，磷酸化的MLKL轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，但尚不清楚MLKL是通過直接還是間接作用誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂。

圖2 哺乳動物 RIP1 和 RIP3 介導(dǎo)的信號通路Fig.2 RIP1 and RIP3-mediated signaling pathways in mammals

RIP3不僅是程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡（pyroptosis）。細(xì)胞焦亡是指炎癥依賴性的細(xì)胞死亡，其特征是組裝一個稱為炎癥小體的多聚蛋白復(fù)合物，誘導(dǎo)caspase-1的加工和激活，最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放［51］。RIP3可以激活caspase-8，致使caspase-8對IL-1β前體進(jìn)行剪切，同時促進(jìn)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的成熟和分泌［50］（圖2）。有研究顯示，當(dāng)細(xì)胞中缺失凋亡抑制蛋白cIAPs時，RIP3可以激活caspase-8介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的加工，在不依賴MLKL的情況下激活NLRP3炎癥小體從而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡；相反地，在細(xì)胞中缺失cIAPs和caspase-8的情況下，RIP3和MLKL對于TLRs誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活則變得至關(guān)重要［49］。A20可以與泛素化的RIP3形成復(fù)合物，阻礙NLRP3炎癥小體中caspase-1和caspase-8的組裝，從而抑制IL-1β的加工［52］。有研究表明，缺乏caspase-8和RIP3的細(xì)胞大大影響了caspase-1的加工，并減少了感染誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，與此同時，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性也受到損傷［53］。早期研究表明，RIP3的過表達(dá)會抑制HEK293T細(xì)胞中TRIF依賴的NF-κB 激活［54］，但近來有研究發(fā)現(xiàn)，RIP3可通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的TLR4信號通路，激活NF-κB信號，起到重要的促炎作用［55］。因此，RIP3可能會影響NF-κB激活，但其對NF-κB活性的調(diào)控作用及具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究。

1.2 RIP1和RIP3在硬骨魚類中的研究進(jìn)展

近年來，在硬骨魚類的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了哺乳動物RIP1和RIP3的同源基因，在斑馬魚（Danio rerio）、鯉魚（Cyprinus carpio）、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）和青魚（Mylopharyngodon piceus）中均發(fā)現(xiàn)RIP1，RIP3的同源基因在斑馬魚、鯉魚和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中也有報道。

硬骨魚類RIP1和RIP3在細(xì)胞死亡方面的作用與哺乳動物類似：斑馬魚cIAP蛋白可以通過泛素連接酶促進(jìn)RIP1的多聚泛素化，進(jìn)而調(diào)節(jié)TNFR1死亡復(fù)合物的組裝［56］；傳染性胰腺壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）感染斑馬魚后，通過TNF-α觸發(fā)的死亡信號來誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的程序性壞死［57］；在cIAP拮抗劑和caspase抑制劑存在時，TNF-α刺激后半滑舌鰨RIP3蛋白可與MLKL相結(jié)合，且RIP3的過表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［58］。有研究通過ROS定量分析發(fā)現(xiàn)，RIP1、RIP3和PGAM5敲降使TNF過表達(dá)的斑馬魚ROS降低到正常水平；白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）的過表達(dá)使早期巨噬細(xì)胞的殺菌效力增強(qiáng)，而RIP1和RIP3的基因敲降逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果［59］。通過構(gòu)建色盲斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)突變體胚胎中RIP3敲降可以通過抑制ROS的形成防止視錐細(xì)胞死亡，表明RIP3介導(dǎo)的程序性壞死是視錐細(xì)胞死亡的潛在原因［60］。此外，有機(jī)磷殺蟲劑“毒死蜱”（chlorpyrifos，CPF）暴露可下調(diào)鯉caspase-8的表達(dá)水平并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，上調(diào)RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死［61］；在除草劑“莠去津”（atrazine，ATR）的作用下，鯉魚RIP1、RIP3、MLKL和FADD的轉(zhuǎn)錄水平以及RIP3和MLKL的蛋白水平顯著增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［62］。目前，對于硬骨魚類RIP1和RIP3研究的熱點聚焦在其介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死上，而有關(guān)RIP3調(diào)控炎癥小體組裝和激活的研究還存在空白。因此，對硬骨魚類RIP3的功能及其介導(dǎo)的信號通路調(diào)控機(jī)制尚需深入研究。

對硬骨魚類的先天免疫和炎癥反應(yīng)方面的研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚RIP1可與TRIF相互作用參與TLRs介導(dǎo)的信號通路，也可與TRAFs結(jié)合介導(dǎo)下游NF-κB和干擾素（interferon，IFN）通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖4），且RIP1過表達(dá)抑制新加坡石斑魚虹彩病毒（singapore grouper iridovirus，SGIV）和赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）復(fù)制，并上調(diào)IFN、IRFs和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平［63］，這表明RIP1可能在宿主的抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。但同時有研究顯示，青魚RIP1可與MAVS相互作用抑制MAVS對IFN的激活作用，同時負(fù)調(diào)控MAVS介導(dǎo)的RLRs抗病毒信號通路［64］（圖4），而哺乳動物中的研究顯示RIP1可以激活MAVS介導(dǎo)的抗病毒信號通路［31］，這表明RIP1在硬骨魚類和哺乳動物中的抗病毒免疫功能可能有所不同。目前研究顯示硬骨魚類RIP1在TLRs和RLRs介導(dǎo)的信號通路中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2 RIP2

2.1 RIP2的分子結(jié)構(gòu)和功能

RIP2又叫RIP樣凋亡調(diào)控蛋白激酶（RIP-like-interacting CLARP kinase，RICK）或 含 caspase激活募集域白介素-1β轉(zhuǎn)化酶相關(guān)激酶（CARD-containing IL-1β converting enzyme-associated kinase，CARDIAK），可以激活 NF-κB 和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［65-67］。RIP2在N端有激酶結(jié)構(gòu)域，C端有一個caspase激活募集域（caspase activation and recruitment domain，CARD），可以介導(dǎo)與其他含CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，如模式識別受體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋 白 1（nucleotide-binding oligomerization domains，NOD1）、NOD2 和 caspase-1 等［68-69］（ 圖1）。 除 去CARD-CARD間的相互作用，RIP2還可以和其他蛋 白 特 異 性 結(jié) 合， 包 括 TLR2［70］、cIAP1/2［71］、TRAF3［72］和 CD40［73］。RIP2 廣泛表達(dá)在生物體各組織中，RIP2缺失嚴(yán)重抑制TLR4和NOD1介導(dǎo)的NF-κB激活，IL-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少，并削弱抗原受體誘導(dǎo)下的T細(xì)胞增殖和分化［70，74］，表明RIP2在炎癥反應(yīng)、先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮了重要作用。

RIP2在哺乳動物NOD1和NOD2介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)中起著重要作用。NOD1和NOD2可分別識別進(jìn)入宿主細(xì)胞的病原菌肽聚糖（peptidoglycan，PGN）中的 iE-DAP（γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid）和 胞 壁 酰 二 肽（muramyl dipeptide，MDP）并激活，通過CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用招募RIP2，活化TAB-TAK和IKK復(fù)合體并誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號通路激活，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和抗菌分子的產(chǎn)生［68］（圖3）。許多與RIP2相互作用或調(diào)節(jié)RIP2泛素化的分子能參與調(diào)控NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號通路：Caspase-12通過與RIP2結(jié)合，致使NOD1/2信號受到抑制和抗菌反應(yīng)減弱［75］；RIP2同家族的RIP7可以通過促進(jìn)RIP2磷酸化來正調(diào)控NOD1/2-RIP2信號通路［76］；甲狀腺激素受體相互作用蛋白6（thyroid hormone receptor interactor 6，TRIP6）通過TNF或IL-1的介導(dǎo)，與RIP2相互作用以正調(diào)控NOD1介導(dǎo)的信號通路［77］。RIP2的多聚泛素化是NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟［78-79］。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）通過與RIP2結(jié)合被招募到NOD1/2-RIP2復(fù)合物中，促進(jìn)RIP2的多聚泛素化從而介導(dǎo)NF-κB和MAPK 的激活［80-81］。Pellino3和cIAP1/2與XIAP作用基本相同，通過促進(jìn)RIP2多聚泛素化從而激活TAB-TAK和IKK復(fù)合體［71，82］。而TNF-α誘導(dǎo)蛋白A20、去泛素化酶OTULIN（OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）和去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白（cylindromatosis，CYLD）都可以通過對RIP2去泛素化進(jìn)而對NOD1/2-RIP2信號進(jìn)行負(fù)調(diào)控并抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生［83-85］。目前已證實有多種泛素化修飾酶可參與調(diào)控NOD1/2-RIP2介導(dǎo)的NF-κB和MAPK的信號通路，是否還有其他泛素化酶可參與調(diào)控，它們之間是否存在協(xié)同作用，這些問題尚有待進(jìn)一步解答。

RIP2除參與NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號通路，還可參與包括TNF、IL-1和TLRs在內(nèi)的多種NF-κB激活途徑。RIP2與caspase-1可通過CARD-CARD相互作用，介導(dǎo)NF-κB的激活［69］。而凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）可通過其CARD結(jié)構(gòu)域干擾RIP2與caspase-1的結(jié)合，抑制RIP2和caspase-1互作誘導(dǎo)的NF-κB信號，促進(jìn)caspase-1的激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β的加工［86］（圖3）。同時還有報道顯示，RIP2可以與TRAF1、TRAF2、TRAF5和 TRAF6多個TRAF成員相互作用，誘導(dǎo)NF-κB的激活［87］。在某些情況下RIP2也能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，如RIP2可以直接激活死亡受體家族中的Fas受體，從而參與Fas受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［65］。目前尚不清楚RIP2如何促進(jìn)Fas受體介導(dǎo)的凋亡及在細(xì)胞死亡中扮演怎樣的角色，這些科學(xué)問題值得在未來深入了解。

2.2 RIP2在硬骨魚類中的研究進(jìn)展

近來，在斑馬魚、南亞野鯪（Labeo rohita）、斜帶石斑魚、麥瑞加拉鯪（Cirrhinus mrigala）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、 牙 鲆（Paralichthys olivaceus）、金魚（Carassius auratus L.）、鮸魚（Miichthysmiiuy）和卡特拉魚（Catla catla）研究中相繼報道了RIP2的同源序列。在南亞野鯪［88-89］、麥瑞加拉鯪［90］、斜帶石斑魚［91］和卡特拉魚［92］中，用 iEDAP、MDP、LPS和聚肌胞苷酸（poly I：C）刺激以及病原體嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）感染后，RIP2的表達(dá)上調(diào)；在金魚中，RIP2作為NLR信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白可與NOD1/2相互作用，并且可以激活NF-κB通路，同時RIP2參與調(diào)控金魚巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的表達(dá)［93］；鮸魚NOD1通過LRR結(jié)構(gòu)域識別iEDAP并通過招募RIP2激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［94］。在斑馬魚中，RIP2的過表達(dá)誘導(dǎo)I型IFN和NF-κB啟動子激活，且RIP2過表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出抗病毒和抗細(xì)菌感染的能力［95］；斑馬魚組蛋白H2A可以與RIP2作用協(xié)同誘導(dǎo)抗菌基因和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）相關(guān)基因的表達(dá)［96］；RIP2可參與調(diào)節(jié)NLRs信號、MHC抗原呈遞和自噬，對幼體發(fā)育至關(guān)重要，但由NOD1介導(dǎo)的MAPK信號和下游CD44a-Lck-PI3K-Akt信號與RIP2無關(guān)［97］。魚類中存在多種與哺乳動物RIP2相似的下游級聯(lián)反應(yīng)：如在虹鱒魚中，使用RIP2抑制劑顯著降低iE-DAP誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的表達(dá)［98］；在牙鲆中，RIP2定位于細(xì)胞質(zhì)，RIP2的過表達(dá)會上調(diào)PGN刺激的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)［99］。此外，金魚ASC可以與RIP2和caspase-1相互作用，ASC的過表達(dá)可抑制RIP2對NF-κB的激活作用［100］（圖4）。硬骨魚類RIP2通過NOD1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)NLRs信號和MHC抗原呈遞，還可通過與NOD1/2或caspase-1相互作用誘導(dǎo)NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，參與宿主抗菌和抗病毒免疫反應(yīng)，但不參與NOD1介導(dǎo)的MAPK信號通路，這表明了硬骨魚類RIP2介導(dǎo)的信號通路與哺乳動物有所不同。

3 RIP4和RIP5

圖3 哺乳動物 RIP2 介導(dǎo)的信號通路Fig.3 RIP2-mediated signaling pathways in mammals

RIP4又叫蛋白激酶C-δ相互作用激酶（protein kinase C-δ interacting protein kinase，DIK）［101］或蛋白激酶C相關(guān)激酶（protein kinase C-associated kinase，PKK）［102］，RIP4的 N 端包含激酶結(jié)構(gòu)域，C端具有錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeat，ANK）（圖1）。RIP4敲除小鼠在出生幾小時后就不能存活，其骨骼形態(tài)發(fā)生變化，同時角質(zhì)形成細(xì)胞分化受損，而缺失RIP4的小鼠淋巴細(xì)胞會使外周B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，RIP4在B淋巴細(xì)胞發(fā)育和維持成熟B淋巴細(xì)胞再循環(huán)中占據(jù)重要地位［103-105］，這暗示著RIP4可能在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著作用。

RIP4的過表達(dá)依賴其激酶活性可誘導(dǎo)NF-κB和氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號的激活［106-107］。在哺乳動物中，RIP4介導(dǎo)的NF-κB激活需要IKK復(fù)合體中的調(diào)節(jié)亞基IKK-α和IKK-β，RIP4通過使IKK-α和IKK-β上絲氨酸位點磷酸化，活化IKK復(fù)合體從而激活NF-κB［108］。促分裂原活化蛋白激酶激酶的激酶2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2，MEKK2）和 MEKK3通 過與RIP4相互作用使其磷酸化，而磷酸化的RIP4增強(qiáng)了這兩種蛋白激酶對NF-κB的激活［109］。同時有研究表明，B細(xì)胞活化因子（B cell-activating factor，BAF）介導(dǎo)的 NF-κB 活化需要 RIP4的參與［110］，RIP4的Lys51和Lys145是cIAP1介導(dǎo)的泛素化和NF-κB活化的兩個關(guān)鍵氨基酸殘基［111］。此外，TRAF家族的幾個成員包括TRAF1、TRAF3和TRAF6通過與RIP4結(jié)合，抑制RIP4誘導(dǎo)的NF-κB活化［106］。在凋亡過程中，caspase通過作用于RIP4中間結(jié)構(gòu)域的Asp340和Asp378氨基酸位點使RIP4發(fā)生剪切，從而抑制NF-κB信號通路［106］。RIP4通過和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）相互作用增強(qiáng)STAT3的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎性因子-3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）的 表達(dá)［112］。哺乳動物中有關(guān)RIP4的研究主要集中在其對NF-κB信號的激活，而它是否還參與了其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程目前尚不清楚。

哺乳動物RIP5在其結(jié)構(gòu)上與RIP4相似，N端為激酶結(jié)構(gòu)域，C端具有ANK序列，這暗示它可能具有類似于RIP4的功能（圖1）。RIP5的過表達(dá)可誘導(dǎo)具有DNA斷裂等凋亡形態(tài)特征的細(xì)胞死亡［113］。RIP5可能通過成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號通路在后腎發(fā)育和成熟中發(fā)揮作用［114］，也可能參與控制細(xì)胞衰老和細(xì)胞死亡［115］，但它的具體功能尚不清晰。

目前，尚未在硬骨魚類中報道RIP4的同源基因，僅在斑馬魚中報道敲除RIP5會導(dǎo)致發(fā)育缺陷，F(xiàn)GF信號丟失［116］。

4 RIP6和RIP7

RIP6又叫富亮氨酸重復(fù)激酶1（leucine-rich repeat kinase 1，LRRK1），它的結(jié)構(gòu)域十分獨特又與RIP激酶密切相關(guān)。RIP6在N端含有ANK結(jié)構(gòu)域，除了含有激酶結(jié)構(gòu)域外還包含富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）和Roc/COR結(jié)構(gòu)域（ras complex protein/C-terminal of Roc）（圖1）。

RIP6可參與和調(diào)節(jié)特定的內(nèi)體運輸，如RIP6可以使Ras相關(guān)蛋白7（ras-related protein 7，Rab7）在S72位點上磷酸化，促進(jìn)Rab7與其效應(yīng)分子Rab7相互作用溶酶體蛋白（Rab7-interating lysosomal protein，RILP）的相互作用，促進(jìn)含有表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內(nèi)體向核周區(qū)域運輸［117］。有研究發(fā)現(xiàn)，RIP6基因敲除小鼠出現(xiàn)了骨骼發(fā)育不良并伴有硬化，這與骨硬化性干骺端發(fā)育不良的表型相似［118］。哺乳動物RIP6主要與內(nèi)體運輸和骨骼發(fā)育相關(guān)，但其對骨骼發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需深入研究。

RIP7又叫做LRRK2，在N端含有LRR序列，C端有WD40重復(fù)序列，中間包括Roc/COR結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域（圖1）。RIP7基因突變是家族性和偶發(fā)性帕金森病的常見遺傳原因，在帕金森患者中RIP7表達(dá)量增加［119］。在RIP7基因敲除小鼠的肝臟中，低氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）蛋白的表達(dá)增加且其靶基因促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）的表達(dá)也顯著增加［120］。此外，RIP7可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運輸和維持細(xì)胞器形態(tài)，RIP7基因敲除和藥物抑制其激酶活性分別會引起嚙齒動物和靈長類動物細(xì)胞溶酶體異常［121-122］，RIP7基因發(fā)生突變的帕金森患者細(xì)胞中溶酶體形態(tài)發(fā)生改變［123］。同時，RIP7是RIP2的一種正調(diào)控因子，通過正調(diào)控NOD1/2-RIP2途徑誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［76］，這也暗示RIP7可通過RIP2參與調(diào)控宿主的先天免疫反應(yīng)。

目前，尚未在硬骨魚類中報道RIP6同源基因，而RIP7僅在斑馬魚中有相關(guān)報道。研究顯示，斑馬魚RIP7突變使與抗感染和免疫疾病相關(guān)的基因表達(dá)明顯受到影響，其抗病原菌感染的能力顯著減弱［124］。早期研究認(rèn)為RIP7的敲降不會導(dǎo)致斑馬魚多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損失［125］，但近來的研究發(fā)現(xiàn)RIP7敲降不僅會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損失，還會導(dǎo)致腎前導(dǎo)管中鈉鉀泵蛋白的錯誤定位引起發(fā)育紊亂［126］。因此，關(guān)于RIP7對神經(jīng)細(xì)胞的功能與作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語與展望

過去的十幾年中，關(guān)于不同RIP家族成員的結(jié)構(gòu)、功能和參與調(diào)控的信號通路解析方面取得了很大進(jìn)展，越來越多的研究表明它們在宿主抗感染免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要作用。RIP1是細(xì)胞死亡的重要節(jié)點性蛋白，是細(xì)胞選擇凋亡還是程序性壞死的開關(guān)，RIP3是程序性壞死和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，RIP1與RIP3組成壞死小體在程序性壞死中發(fā)揮重要作用。目前硬骨魚類中有關(guān)RIP1和RIP3的研究大都集中在參與細(xì)胞死亡的過程，而對其參與調(diào)控宿主先天免疫和炎癥反應(yīng)的研究較為匱乏。RIP2與宿主的先天免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可介導(dǎo)多種促炎因子的表達(dá)，并可通過模式識別受體參與宿主的抗菌和抗病毒免疫反應(yīng)。目前研究表明硬骨魚類RIP2所介導(dǎo)的信號通路與哺乳動物有所不同，但多數(shù)研究停留在配體或病原體刺激下對其表達(dá)水平的影響，后續(xù)研究需要對其功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入解析。而不管在哺乳動物還是硬骨魚類中，有關(guān)RIP4、RIP5、RIP6和RIP7的研究都較少，它們具體的功能和作用機(jī)制尚不清楚。盡管目前對硬骨魚類RIP家族成員的功能研究有限，但隨著第三代測序技術(shù)的發(fā)展和CRISPR/Cas9等基因敲除技術(shù)的進(jìn)步，相信在不遠(yuǎn)的未來將不斷揭示RIP家族成員在魚類抗病免疫和細(xì)胞程序性死亡中的重要性，豐富和發(fā)展硬骨魚類乃至哺乳動物的免疫學(xué)知識。

圖4 硬骨魚類 RIP1、RIP2 和 RIP3 介導(dǎo)的信號通路Fig.4 RIP1, RIP2, and RIP3-mediated signaling pathways in teleosts