新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重組蛋白的原核表達(dá)、純化及應(yīng)用

張西西 張怡青 李玉林 韓笑 王國(guó)強(qiáng)、4 王曉軍 王旭東王云龍

（1.河南師范大學(xué)，新鄉(xiāng) 453007；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450010；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，鄭州 450010；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；5.河南省職工醫(yī)院，鄭州 450002）

自2019 年 12 月以來(lái)，新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引發(fā)的肺炎疫情在中國(guó)武漢暴發(fā)，隨后疫情迅速蔓延，擴(kuò)散至全球各地區(qū)［1］。在不到兩個(gè)月的時(shí)間里，疫情已經(jīng)蔓延至超過(guò)200個(gè)國(guó)家和地區(qū)，對(duì)人類(lèi)的生命安全和全球經(jīng)濟(jì)造成巨大的負(fù)面影響［2-3］。面對(duì)急速增長(zhǎng)的發(fā)熱疑似病例或無(wú)癥狀的密切接觸者，開(kāi)發(fā)出靈敏、快速、特異的診斷檢測(cè)技術(shù)仍是當(dāng)務(wù)之急。

SARS-CoV-2 是一種新型高傳染性的冠狀病毒，基因大小約為 29.8 kb，基因組 5′端的基因編碼主要為部分非結(jié)構(gòu)蛋白。3′端編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括表面刺突糖蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）、外膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）。N蛋白是冠狀病毒中含量最豐富的蛋白，位于病毒內(nèi)部，具有高度保守性［4-5］。N蛋白是一種具有高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒體組裝過(guò)程中，N蛋白與病毒RNA結(jié)合形成螺旋核衣殼并且與病毒基因組復(fù)制和調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)。因此，N蛋白常用作冠狀病毒檢測(cè)的靶點(diǎn)，是免疫學(xué)快速診斷試劑的核心原料［6］。

然 而，SARS-CoV-2和 SARS-CoV、MERS-CoV的結(jié)構(gòu)蛋白有較高的同源性［7-8］，為提高熒光免疫層析試紙條的特異性，本研究分析了N蛋白全長(zhǎng)的保守性，選取全長(zhǎng)N蛋白序列中C端，約13 kD的特異序列作為靶蛋白，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在原核系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)SARS-CoV-2 N蛋白C端重組蛋白［9］，利用Ni2+親和層析柱和凝膠過(guò)濾層析柱探索蛋白的純化方式從而獲得高純度的目的蛋白，初步應(yīng)用于熒光免疫層析試紙條的包被抗原，可以快速區(qū)分PCR確診的新冠陰陽(yáng)血清，為COVID-19的快速大規(guī)模初期篩查提供生物原料。

1 材料與方法

1.1 材料

抗SARS-CoV-2 全長(zhǎng)N蛋白兔抗血清、原核系統(tǒng)表達(dá)的SARS-CoV-2 全長(zhǎng)N蛋白、大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）、質(zhì)粒pET21b由本實(shí)驗(yàn)室保存；COVID-19核酸陰性血清、陽(yáng)性血清由河南省疾病預(yù)防控制中心提供；氨芐青霉素、IPTG誘導(dǎo)劑為索萊寶公司產(chǎn)品；酵母粉、蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品；氯化鈉為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。三羥甲基氨基甲烷為河南東格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；咪唑?yàn)樯ど锕こ坦煞萦邢薰井a(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的序列的合成和重組載體構(gòu)建 參考NCBI的SARS-CoV-2冠狀病毒的N蛋白全長(zhǎng)基因序列（GenBank：MT434817.1），通過(guò) EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，選取N蛋白全長(zhǎng)序列C端（249AA-350AA）110個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的基因序列作為靶序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行人工合成，目的基因序列連入載體pUC57。以pUC57/NC 為模板，NC-F和NC-R為引物（表1），擴(kuò)增新冠N蛋白C段靶基因序列。擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pET21b分別通過(guò)雙酶切（Nde Ⅰ和XhoⅠ）、連接和轉(zhuǎn)化將合成的靶基因序列插入pET21b質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體，雙酶切和測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET21b-NC。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將pET21b-NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞?；罨膒ET21b-NC的重組菌按1∶1 000的比例加入含有氨芐青霉素（50 μg/mL）LB培養(yǎng)基中搖晃培養(yǎng)至菌液OD600nm至0.8時(shí)，設(shè)置37℃、25℃、16℃3個(gè)不同的誘導(dǎo)溫度，按終濃度為0.4 mmol/L加入IPTG，誘導(dǎo)時(shí)間分別為4 h、10 h、20 h，之后將菌體離心，用20 mmol/L Tris（pH8.0）緩沖液重懸并超聲破碎，離心后收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 重組蛋白發(fā)酵和純化 重組蛋白在37℃，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h時(shí)，80%的目的蛋白以水溶性形式存在。按照此條件，大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)結(jié)束離心收集菌體，20 mmol/L Tris（pH8.0）緩沖液重懸菌體，冰浴超聲破碎（350 W，工作5 s，停止 5 s，超聲 20 min），12 000 r/min離心 10 min，將超聲破碎后的上清溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液直接上樣，進(jìn)行Ni2+親和層析純化，上樣流速為3.5 mL/min，上樣結(jié)束，用緩沖液繼續(xù)沖洗至基線，換用含有100 mmol/L咪唑的緩沖液除去雜蛋白，沖洗至基線，再用含300 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白，收集流出液。流出液經(jīng)過(guò)超濾濃縮管（截留分子量：3 kD）濃縮之后，以2 mL/min速度上樣，進(jìn)凝膠過(guò)濾層析（Superdex-200），收集第2個(gè)流出峰［10］，即為純化目的蛋白。使用SDS-PAGE電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并用 Image Lab 6.0軟件對(duì)蛋白純度進(jìn)行量化分析，同時(shí)用高效分子排阻色譜法鑒定重組蛋白的純度。

1.2.4 Western blot鑒定重組蛋白 將純化后的目的蛋白和誘導(dǎo)前的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束，通Bio-Rad濕轉(zhuǎn)電泳儀冰浴條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（100 V，40 min）。轉(zhuǎn)膜后放入 10 mL 含5%脫脂奶粉的PBST溶液中，37℃封閉2 h，棄去封閉液，加入用PBST 1∶1 000稀釋的抗全長(zhǎng)N蛋白兔抗血清，37℃孵育2 h，棄去一抗，用PBST洗滌3次，每次5 min，然后加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，37℃，孵育2 h，再用PBST洗滌3次，每次5 min；最后滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色觀察。

1.2.5 重組目的蛋白的初步應(yīng)用 參考前期本實(shí)驗(yàn)室熒光免疫層析試紙條制備方法［11-12］，用純化的新冠重組NC蛋白作為包被抗原，以1 mg/mL在NC膜上劃線，實(shí)驗(yàn)室制備的全長(zhǎng)N蛋白標(biāo)記熒光微球，組裝熒光免疫層析試紙條。以兔抗全長(zhǎng)N蛋白兔抗血清作為陽(yáng)性對(duì)照，正常人血清作為陰性對(duì)照，優(yōu)化層析試紙條各種工藝，條件確定后，組裝50個(gè)試紙條，送往河南省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)20份新冠核酸檢測(cè)確證的臨床血清標(biāo)本（10份陽(yáng)性，10份陰性），滴加80 μL的原倍血清至加樣孔，10 min后將試紙條置于紫外燈下照射觀察，陰陽(yáng)通過(guò)檢測(cè)線是否出現(xiàn)熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果

2.1 靶目的蛋白序列選取

通過(guò) EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) SARS-CoV-2（YP_009724397.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和 MERSCoV（YP_009047211.1）的N蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，可以看出在N蛋白的C端三者有較大的差異，因此本研究選取了249-350AA共102個(gè)氨基酸序列作為靶序列，人工合成構(gòu)建重組載體，以期原核表達(dá)純化后，N蛋白具有更高的特異性（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

以pUC57/NC 為模板，特異型引物NC-F和NC-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到了大小約為350 bp的靶基因片段，與預(yù)期相符（圖2-A）。重組載體用Nde I和Xho I雙酶切驗(yàn)證，得到目的片段和pET21b線性片段（圖2-B），表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-NC。

2.3 重組蛋白可溶性表達(dá)分析

通過(guò)設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度和時(shí)間來(lái)探索重組蛋白是否能夠進(jìn)行可溶性表達(dá)，SDS-PAGE（圖3）電泳結(jié)果可以看出：在37℃、25℃和16℃誘導(dǎo)條件下，上清和沉淀均有目的蛋白，且上清中目的蛋白的表達(dá)量均高于沉淀表達(dá)，37℃誘導(dǎo)4 h條件下目的蛋白在上清中表達(dá)量最大（泳道 2），因此，誘導(dǎo)條件確定為：在0.4 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h。

2.4 重組蛋白的純化

將工程菌株BL21（DE3）/pET21b-NC按照2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行大量表達(dá)，采用Ni2+親和層析柱和凝膠過(guò)濾層析柱純化目的蛋白，誘導(dǎo)前菌液和誘導(dǎo)后超聲破碎上清以及不同方法純化后用12% SDSPAGE電泳觀察分析，結(jié)果顯示，目的蛋白分子量約為13 kD，與預(yù)期相符，其在上清液中大量表達(dá)，Ni2+親和層析柱純化后，目的蛋白純度達(dá)85%，再經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析后，除去了一條雜帶，純度進(jìn)一步提升，達(dá)到90%以上（圖4）。進(jìn)一步通過(guò)高效分子排阻色譜法對(duì)最終純化的蛋白樣品進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，重組蛋白在2-3 min左右出現(xiàn)明顯單一的色譜峰，其他位置未出現(xiàn)色譜峰，說(shuō)明重組蛋白有很好的純度（圖5）。

圖1 SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 的 N 蛋白 C 末端氨基酸序列對(duì)比Fig.1 Comparison of N protein C-terminal amino acid sequences of SARS-CoV-2, SARS-CoV and MERS-CoV

圖2 N 蛋白 C 端序列基因表達(dá)載體的 PCR 及雙酶切鑒定Fig.2 N protein C-terminal sequence gene expression vector PCR and double enzyme digestion

圖3 重組蛋白可溶性表達(dá)Fig.3 Soluble expression of recombinant protein

圖4 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白原核表達(dá)和純化的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of the C-terminal recombinant protein of SARS-CoV-2 N protein

圖5 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白凝膠過(guò)濾層析純化的高效液相分析Fig.5 High performance liquid phase analysis of SARSCoV-2 N protein C-terminal recombinant protein gel filter chromatography

2.5 Western blot鑒定重組蛋白

Western blot結(jié)果顯示，在純化后（泳道1）13 kD處有一條明顯的單一條帶，而誘導(dǎo)前（泳道2）無(wú)條帶，表明目的蛋白正確表達(dá)，同時(shí)純化的目的蛋白可以與全長(zhǎng)的N蛋白免疫兔抗血清進(jìn)行特異性反應(yīng)（圖6）。

圖6 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis of SARS-CoV-2 N protein C-terminal recombinant protein

2.6 重組蛋白的初步應(yīng)用

10份新冠陰性血清T線無(wú)熒光信號(hào)，C線均有熒光信號(hào)，10份陽(yáng)性血清中有9份T線顯示強(qiáng)的熒光信號(hào)，1份顯示弱的熒光信號(hào)，C線均有熒光信號(hào)（圖7）。該結(jié)果說(shuō)明目的蛋白作為包被抗原組裝的免疫熒光層析試紙條可以初步應(yīng)用于新型冠狀病毒抗體的初篩。

圖7 熒光免疫層析試劑血清檢測(cè)Fig.7 Serum detection of fluorescent immunomy

3 討論

在SARS-CoV-2冠狀病毒的4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是冠狀病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，而且是病毒的主要抗原，N蛋白有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答［13］。其抗體較抗 S 蛋白抗體出現(xiàn)早，檢出率高，維持時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明 N 蛋白的免疫原性高于 S蛋白。但是因與其他冠狀病毒序列有較高的同源性［14-15］，特異性不強(qiáng)，為了提高N蛋白的特異性，本研究將N蛋白的基因組進(jìn)行改造，截取C端具有特異性的序列，人工合成C端序列并制備基因工程菌通過(guò)原核表達(dá)的方式獲得可溶性重組蛋白。

本研究運(yùn)用原核系統(tǒng)對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并確定其在誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，IPTG終濃度為0.4 mmol/L 時(shí)重組蛋白可在上清溶液中大量表達(dá)。本研究探索了重組蛋白的純化方式并確定了運(yùn)用層析柱的方式純化蛋白，通過(guò)Ni2+親和層析使蛋白溶液中大多數(shù)雜質(zhì)去除，使重組蛋白的純度得到大幅提升，又使用凝膠過(guò)濾層析，利用其對(duì)不同大小分子的分離作用使重組蛋白的純度進(jìn)一步提升，通過(guò)SDS-PAGE電泳和高效液相可以確定最終得到的重組蛋白純度可達(dá)到90%以上。本研究以全長(zhǎng)的N蛋白免疫兔抗血清為一抗，通過(guò)Western blot可以證明重組蛋白能夠與全長(zhǎng)的N蛋白抗體結(jié)合，具備良好的可結(jié)合性和生物活性。本研究將重組蛋白應(yīng)用于熒光免疫層析試紙的包被抗原，健康人血清未出現(xiàn)假陽(yáng)性，10份核酸檢測(cè)陽(yáng)性的病人血清可以檢測(cè)出9份陽(yáng)性結(jié)果和1份弱陽(yáng)性結(jié)果。說(shuō)明重組蛋白具備一定的抗原性和應(yīng)用潛力。

由于本研究測(cè)試的血清樣本量較少，還不足以說(shuō)明以重組蛋白為原料制作的檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用效果，以及相較于其他類(lèi)型檢測(cè)試劑的特異性的提升。但是，以上結(jié)果仍然可以說(shuō)明本研究制備的重組蛋白具備較高的生物活性和應(yīng)用潛力，可用于核酸檢測(cè)全流程質(zhì)控及試劑盒開(kāi)發(fā)階段的模擬測(cè)試。

4 結(jié)論

SARS-CoV-2 N 蛋白 C末端在適當(dāng)?shù)臈l件下（誘導(dǎo)溫度 37℃，誘導(dǎo)時(shí)間 4 h， IPTG 終濃度0.4 mmol/L），可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中超過(guò)80%以可溶形式表達(dá)。通過(guò) Ni2+親和層析和凝膠過(guò)濾層析，目的蛋白純度超過(guò) 90%。且目的蛋白在熒光免疫層析檢測(cè)試紙中表現(xiàn)出較好的反應(yīng)原性和特異性，可初步用于 COVID-19 的早期初篩。