無(wú)菌豬和普通豬早期脂肪發(fā)育及脂肪組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異

邱小宇 劉作華，2 齊仁立，3

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；3.重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

動(dòng)物的胃腸道內(nèi)寄居著數(shù)量巨大、種類(lèi)繁多的微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌、病毒等，其中90%以上為細(xì)菌，涵蓋了數(shù)千種不同的菌屬［1］。成年豬的腸道細(xì)菌數(shù)量高達(dá)1014CFU/g，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidete）細(xì)菌占全部腸道菌的95%以上［2］。腸道菌群按照一定比例共存，相互依賴(lài)、相互約束，最終在宿主體內(nèi)形成一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)［3］?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可以調(diào)控宿主體內(nèi)多個(gè)組織或器官的發(fā)育與成熟，如腸道、肝臟、大腦、免疫系統(tǒng)等都會(huì)受到腸道微生物的直接或者間接影響［4-6］。而腸道微生物的失衡以及有害細(xì)菌的侵襲則會(huì)破壞宿主體內(nèi)的生理穩(wěn)態(tài)，甚至?xí)?dǎo)致宿主出現(xiàn)肥胖病［7］、糖尿?。?］、帕金森?。?］和抑郁癥［10］等多種疾病。

脂肪組織是動(dòng)物機(jī)體重要的組織器官，功能包括：調(diào)節(jié)體溫、保護(hù)內(nèi)臟器官，作為“燃料庫(kù)”為動(dòng)物儲(chǔ)存和提供能量。脂肪還可以通過(guò)多種方式（吸收脂溶性維生素、供給必須脂肪酸、分泌多種細(xì)胞因子等）干預(yù)和調(diào)控體內(nèi)其他組織器官的生理功能［11-12］。當(dāng)前，大量的研究結(jié)果表明，腸道微生物主要通過(guò)兩種方式影響宿主脂肪組織的發(fā)育和功能：（1）直接影響宿主消化道內(nèi)多糖等物質(zhì)的發(fā)酵以及能量物質(zhì)的產(chǎn)生與獲?。?3］；（2）經(jīng)由細(xì)菌代謝物（如短鏈脂肪酸等）調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞分化和成熟［14］。然而，目前腸道微生物干預(yù)和調(diào)控脂肪發(fā)育的研究多集中在無(wú)菌小鼠、悉生小鼠等嚙齒類(lèi)模型動(dòng)物上，對(duì)豬、牛、羊等具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家畜上的相關(guān)研究還相對(duì)較少。

無(wú)菌動(dòng)物是研究腸道微生物調(diào)節(jié)宿主生長(zhǎng)發(fā)育的重要模型工具。在以往的研究中，無(wú)菌豬主要用于探索腸道微生物群對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟的影響［15-17］，而利用無(wú)菌豬來(lái)揭示腸道微生物群對(duì)豬脂肪組織發(fā)育的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。此外，由于豬的腸道微生物組成和代謝模式與人有著較高的生理相似度［18］，因此基于豬腸道微生物的研究對(duì)人的生理和病理相關(guān)研究也會(huì)具有一定指導(dǎo)意義。本研究選用無(wú)菌仔豬（germ free piglets，GF piglets）和普通帶菌仔豬（normal piglets）進(jìn)行比對(duì)分析，比較兩種豬的脂肪組織形態(tài)、功能和基因表達(dá)的差異，揭示腸道菌定植對(duì)仔豬早期脂肪沉積和脂肪代謝的影響。研究的相關(guān)結(jié)果對(duì)于通過(guò)腸道微生態(tài)平衡改善動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能、維持動(dòng)物生理健康能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇無(wú)血緣關(guān)系，身體健康，外觀無(wú)異常，血清檢測(cè)豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、乙型腦炎病毒、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、布魯氏菌、豬肺炎支原體、豬流感病毒等病原微生物均為陰性的妊娠母豬在預(yù)產(chǎn)期前3 d進(jìn)行無(wú)菌剖腹產(chǎn)手術(shù)（無(wú)菌豬模型制備參照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)TCALAS71-2019執(zhí)行，3頭無(wú)菌豬由重慶市畜牧科學(xué)院無(wú)菌豬研究平臺(tái)提供）。將剖腹獲得的無(wú)菌仔豬飼養(yǎng)于無(wú)菌的隔離器內(nèi)。無(wú)菌豬的飲用水和配方奶粉均經(jīng)過(guò)60Co輻照且微生物檢測(cè)合格（飼料、飲用水微生物檢測(cè)參考孫靜等［19］的方法執(zhí)行）。無(wú)血緣關(guān)系的3頭普通仔豬在標(biāo)準(zhǔn)化的飼養(yǎng)環(huán)境中出生和生長(zhǎng)，正常母乳喂養(yǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在25日齡時(shí)，3頭無(wú)菌仔豬和3頭普通仔豬分別通過(guò)異氟烷呼吸麻醉，放血處死，在潔凈環(huán)境內(nèi)進(jìn)行采樣。迅速切開(kāi)仔豬頸部皮膚組織，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量頸部皮下組織的脂肪厚度。用無(wú)菌剪刀采集1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小的頸部皮下脂肪組織，預(yù)冷的生理鹽水漂洗3次后，分別放入4%中性甲醛中固定和液氮速凍后-80℃冰箱保存。

1.2.2 石蠟切片和HE染色 將固定24 h后的脂肪組織從4%的甲醛溶液中取出，用超純水反復(fù)沖洗12 h后置于75%乙醇內(nèi)，用70%、80%、90%、100%的梯度乙醇脫水，脫水后使用二甲苯透明、石蠟溶化后包埋，切成3 μm-5 μm厚的薄片后行進(jìn)行HE染色，蒸餾水洗5 min，蘇木精染色6 min，自來(lái)水洗凈，分化液20 s，水中浸泡20 min返藍(lán)，1%伊紅質(zhì)染1 min，自來(lái)水沖洗，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察脂肪組織細(xì)胞直徑大小和脂肪沉積差異。

1.2.3 蛋白提取和免疫印跡雜交 脂肪組織液氮研磨成粉末狀后，加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA蛋白裂解液，4%搖床過(guò)夜。充分裂解后，12 000 r/min，4℃離心5 min，吸取上清液并檢測(cè)蛋白濃度。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，加入Loading buffer充分混勻，98℃金屬浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入目標(biāo)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜。第2天用TBST室溫?fù)u洗3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，TBST搖洗3次，每次5 min。使用ECL反應(yīng)試劑盒，化學(xué)發(fā)光自動(dòng)成像儀曝光拍照。Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫檢測(cè) 脂肪組織加入適量預(yù)冷的生理鹽水研磨粉碎，1 000 r/min離心后取上清液，置于-20℃保存待測(cè)。使用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定脂肪細(xì)胞因子-脂聯(lián)素（adiponectin）和瘦素（leptin）的含量（上海酶聯(lián)生物有限公司），操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息學(xué)分析 使用試劑盒提取脂肪組織總RNA，Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，Agilent2100測(cè)定RIN值。利用帶有Oligo（dT）的磁珠分離mRNA，通過(guò)Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，對(duì)所獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除含有接頭的reads、全部都是A堿基的reads、含N比例大于10%的reads和低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條reads的50%以上）。

使用比對(duì)軟件Tophat2（2.1.1）將得到的序列對(duì)比到豬的參考基因組上。利用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）計(jì)算法，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量及其分布情況，并根據(jù)FPKM值分析樣本兩兩之間的相關(guān)性。差異表達(dá)基因篩選采用DEGseq2軟件并以RPKM（reads per kilobase transcriptome per million mapped reads）計(jì)算方法進(jìn)行，篩選條件為P＜0.001，F(xiàn)C＞2，至少一組中的RPKM＞1（FC為3個(gè)樣品表達(dá)量的平均值）。對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)尋找顯著性富集的通路，確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果中挑選具有明顯表達(dá)變化的脂肪代謝相關(guān)調(diào)控基因，使用qRT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。將測(cè)序所用的total RNA樣品使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，日本）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Q6熒光定量PCR儀（AB 公司，美國(guó)）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；（95℃ 5 s，60℃35 s）40 個(gè)循環(huán)。U6 為參照基因，2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±S.E.形式表示，用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行Student t檢驗(yàn)和作圖。*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)菌豬和普通豬的脂肪組織發(fā)育比較

圖1-A顯示了普通仔豬和無(wú)菌仔豬脂肪細(xì)胞的形態(tài)差異。與具備完整腸道微生物的普通仔豬相比，相同日齡無(wú)菌仔豬的脂肪沉積量明顯較少。無(wú)菌仔豬的頸部皮下脂肪厚度、脂肪細(xì)胞直徑顯著低于普通仔豬（P＜0.001；圖1-B，圖1-C）。脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ（peroxisome proliferators activated recepor γ，PPARγ）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是參與脂肪合成與沉積重要調(diào)控因子。Western blot分析表明，無(wú)菌仔豬脂肪組織中FABP4、PPARγ、ACC、FAS的蛋白表達(dá)量都顯著或極顯著低于普通仔豬（圖2-A），提示無(wú)菌仔豬在脂肪合成代謝方面顯著弱于普通仔豬。

圖1 無(wú)菌仔豬和普通仔豬脂肪沉積的差異Fig.1 Difference of fat deposition between GF pigs and normal pigs

脂聯(lián)素（adiponection）和瘦素（leptin）是脂肪組織分泌產(chǎn)生的兩種最為重要的細(xì)胞因子。試驗(yàn)結(jié)果表明，相比于正常仔豬，無(wú)菌豬的脂肪組織中脂聯(lián)素和瘦素的含量均不同程度降低（P=0.100，圖2-B；P=0.095，圖2-C）。這個(gè)結(jié)果一定程度上反應(yīng)了無(wú)菌仔豬脂肪組織生理功能的減弱。

2.2 轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）測(cè)序結(jié)果

經(jīng)RNA-seq分析，在無(wú)菌豬和普通豬上平均得到53 472 016條和59 866 864條原始測(cè)序序列（Raw reads）。去除低質(zhì)量的序列后，普通豬上得到干凈序列（Clean reads）59 285 399條（均值，下同），占總序列數(shù)的99.02%；無(wú)菌豬上得到干凈序列52 961 306條，占總序列數(shù)的99.04%。將Clean reads與豬的參考基因組基因序列比對(duì)，平均有48 033 697條序列比對(duì)豬參考基因組上（比對(duì)率＞85%）。其中，無(wú)菌豬和普通仔豬上的唯一比對(duì)序列分別占總比對(duì)序列的77.98%和79.43%（表1）。

圖2 無(wú)菌豬和普通豬的脂肪合成調(diào)控分子表達(dá)和脂肪細(xì)胞因子含量的差異Fig.2 Differences in fat synthesis regulatory factors and adipocytokines between GF pigs and normal pigs

2.3 無(wú)菌仔豬和普通仔豬脂肪組織基因表達(dá)情況

如圖3所示，6個(gè)RNA文庫(kù)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)基因覆蓋度好，無(wú)兩端傾向性，反應(yīng)了測(cè)序數(shù)據(jù)完整性及可信度高。對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行功能注釋?zhuān)跓o(wú)菌仔豬和普通仔豬共確認(rèn)了15 711個(gè)已知基因。將所有基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理后，分析并繪制無(wú)菌豬和普通豬的基因整體表達(dá)水平分布圖和樣本間基因相關(guān)性熱圖。結(jié)果顯示兩組的全部基因表達(dá)量整體差異不明顯，樣本間基因表達(dá)相關(guān)性好，反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和樣本選擇的可靠，可應(yīng)用于后續(xù)的差異基因篩選與分析（圖4）。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical list of mapping to genome

圖3 樣本測(cè)序基因覆蓋度Fig.3 Coverage of sequencing

2.4 差異表達(dá)基因及qRT-PCR驗(yàn)證

韋恩分析顯示13 747個(gè)基因在兩種豬上共表達(dá)，764個(gè)基因僅在普通仔豬中表達(dá)，1 200個(gè)基因僅在無(wú)菌仔豬中表達(dá)（圖5-A）。去除了低表達(dá)基因（FPKM＜1），然后根據(jù)變化倍數(shù)（fold change）＞2和P＜0.001的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differently expressed genes，DEGs）。結(jié)果顯示，無(wú)菌仔豬和普通仔豬的脂肪組織有695個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因338個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因357個(gè)（圖5-B 和5-C）。表2顯示了無(wú)菌仔豬脂肪中差異最顯著的10個(gè)上調(diào)基因和10個(gè)下調(diào)基因。其中，與脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)、合成以及代謝相關(guān)的基因：LIPG、SucCβ、PIK3C2G、CYP1A1；與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因：PRG4；與營(yíng)養(yǎng)能量代謝相關(guān)的基因：MAPKAPK；與氨基酸合成相關(guān)的基因：NRIP3、C4BPA。

圖4 樣本基因表達(dá)分布和相關(guān)性Fig.4 Distribution and correlation of genes expression patterns in different samples

通過(guò)qRT-PCR方法對(duì)測(cè)序中得到一些脂肪代謝調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)變化進(jìn)行驗(yàn)證，PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果基本一致（圖6）。與普通豬相比，無(wú)菌豬體內(nèi)一些調(diào)控脂肪分解代謝的基因如ATGL，UCP3表達(dá)顯著上調(diào)，此外，負(fù)責(zé)脂質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因如CD36和FATP1的表達(dá)水平也被上調(diào)，而涉及脂肪合成代謝的調(diào)控基因（PPARG和CEBPA）的表達(dá)則不同程度下調(diào)。

表2 十個(gè)表達(dá)差異最顯著的上調(diào)和下調(diào)基因Table 2 Top 10 up or down expressed genes

圖5 差異表達(dá)基因Fig.5 Differentially expressed genes

圖6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.6 Verification of the differentially expressed genes by qRT-PCR

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

將測(cè)序得到的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，進(jìn)一步揭示帶菌豬和無(wú)菌豬脂肪代謝的差異分子網(wǎng)絡(luò)。圖7分別顯示了無(wú)菌豬脂肪組織中表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)基因富集的KEGG通路（富集顯著性前20位）。表達(dá)上調(diào)基因主要富集于脂肪分解、脂質(zhì)代謝（sphingolipid，glycerolipid，ether lipid等）、PPAR信號(hào)通路；而表達(dá)下調(diào)基因主要與免疫功能、細(xì)胞生長(zhǎng)、物質(zhì)代謝（糖代謝、脂類(lèi)合成、氨基酸合成）和能量穩(wěn)態(tài)有關(guān)，主要包括細(xì)胞周期、糖酵解、PI3K-Akt信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。這些結(jié)果說(shuō)明缺少腸道菌的存在，仔豬體內(nèi)的物質(zhì)分解代謝和能量消耗大于能量蓄積和合成代謝，這些代謝的差異引起脂肪生長(zhǎng)和發(fā)育遲緩。

3 討論

脂肪是動(dòng)物體內(nèi)存儲(chǔ)能量的重要組織，脂質(zhì)合成與沉積同動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、代謝和能量周轉(zhuǎn)有著直接的關(guān)系［20］。在家畜中，脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)（肉、蛋、奶）也有重要的影響。早在2004年，腸道微生物首次被證實(shí)對(duì)宿主的脂肪組織發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用［21］。而隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)腸道微生物與動(dòng)物的脂肪沉積存在直接的聯(lián)系［22］。如Turnbaugh等［23］給體況相近的成年無(wú)菌小鼠接種肥胖或瘦的小鼠腸道微生物，飼養(yǎng)14 d后發(fā)現(xiàn)接種肥胖小鼠腸道微生物的無(wú)菌小鼠體脂含量分別比接種瘦小鼠腸道微生物的無(wú)菌鼠和未接種的無(wú)菌鼠體脂含量增加了20%和47%。然而目前大多數(shù)針對(duì)腸道微生物調(diào)控宿主脂肪發(fā)育的研究都基于嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型。豬作為一種自然界肥育度最高的動(dòng)物，是研究腸道微生物調(diào)控脂肪發(fā)育和脂質(zhì)代謝的天然有利模型。研究腸道微生物對(duì)于豬脂肪組織的影響不僅能補(bǔ)充我們對(duì)腸道微生物生理調(diào)控功能的認(rèn)識(shí)，也會(huì)為下一步通過(guò)微生物手段來(lái)改善豬肉品質(zhì)奠定新的理論基礎(chǔ)。本研究中，我們通過(guò)直接比較無(wú)菌仔豬和普通仔豬，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌豬的體脂沉積量、脂肪細(xì)胞尺寸、脂肪細(xì)胞分泌功能均弱于普通仔豬，說(shuō)明了腸道菌群的缺失導(dǎo)致宿主脂肪發(fā)育不良。

近年來(lái)，基于無(wú)菌動(dòng)物模型、菌群移植技術(shù)、宏基因組等多種研究技術(shù)，腸道微生物與宿主脂肪組織發(fā)育之間的聯(lián)系正在被逐漸揭示。腸道微生物影響脂肪組織發(fā)育可能涉及多種不同的機(jī)制。（1）腸道微生物可以調(diào)控胰島素等激素的分泌影響脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育［24］。（2）多數(shù)情況下，腸道微生物是通過(guò)產(chǎn)生和釋放代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸、生物胺、細(xì)菌素等物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)并作用于脂肪細(xì)胞和脂肪組織，影響脂肪組織代謝［25］。（3）腸道微生物還能通過(guò)“微生物-腸-腦軸”調(diào)控大腦的營(yíng)養(yǎng)感知、激素分泌、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而改變宿主的食欲、采食量、生長(zhǎng)節(jié)律、物質(zhì)代謝和能量周轉(zhuǎn)平衡，影響脂肪組織的發(fā)育［26-28］。（4）在一些特殊病理或者炎癥情況下，腸道菌群能突破腸道屏障，通過(guò)“腸漏”逃逸到脂肪組織，直接刺激和影響脂肪細(xì)胞［29］。其中，短鏈脂肪酸是目前研究較多的腸道菌重要代謝產(chǎn)物，除了作為能源底物直接被腸道吸收，它們也可以作為信號(hào)分子激活靶器官的G蛋白偶聯(lián)受體GPCR41和GPCR43，促進(jìn)瘦素等激素的分泌，調(diào)控宿主的糖脂代謝和脂肪組織胰島素敏感性［30-31］。本研究中，我們?cè)跓o(wú)菌豬的脂肪組織上也觀察到瘦素和脂聯(lián)素分泌量的減少和G蛋白偶聯(lián)受體家族基因（GPCR）的表達(dá)下調(diào)，可以推測(cè)無(wú)菌狀態(tài)下，腸道內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂肪酸大量減少進(jìn)而導(dǎo)致脂肪組織分泌功能的降低。

圖7 差異表達(dá)基因的KEGG功能富集Fig.7 KEGG enrichment analysis of the differentially expressed genes

伴隨著脂肪組織形態(tài)和功能變化的是分子層面的巨大差異。我們通過(guò)高通量測(cè)序解析了無(wú)菌豬和普通豬的脂肪組織基因表達(dá)譜的差異，這為進(jìn)一步探索腸道微生物調(diào)節(jié)豬脂肪組織發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示無(wú)菌豬的脂肪中，表達(dá)變化最顯著的差異基因主要與免疫、炎癥、脂肪和能量代謝直接相關(guān)。如已有文獻(xiàn)報(bào)道能催化ATP水解和具有抑制腸上皮細(xì)胞屏障功能的MAPK激酶蛋白酶（MAPK-Activated Protein Kinases，MAPKAPK）［32-34］、能在炎癥條件下被急劇上調(diào)來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的α-胰蛋白酶抑制劑重鏈3（Interα-trypsin inhibitor heavy chain 3，Itih 3）［35-36］以及與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝和氧化還原酶活性正相關(guān)的苯丙氨酸4-單加氧酶（phenylalanine 4-monooxygenase）都顯著表達(dá)上升［37］，而能激活糖原合成酶，促進(jìn)肝糖原的合成，增加甘油三酯的生成的磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合物（phosphatidylinositol 4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing subunit gamma，PIK3C2G）［38］、有助于高密度脂蛋白/低密度脂蛋白/極低密度蛋白通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生分解反應(yīng)并為細(xì)胞提供脂質(zhì)合成必需的脂質(zhì)前體以及具有一定抗炎癥作用的內(nèi)皮脂肪酶（endothelial lipase，LIPG）［39］、有著膽固醇水解活性和甘油三酯水解酶活性的羧酯酶1（carboxylesterase 1，CES1）［40-41］以及能抑制 LPS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6表達(dá)的細(xì)胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1，CYP1A1）均顯著下調(diào)［42］。

在嚙齒類(lèi)動(dòng)物類(lèi)動(dòng)物模型上，Backhed等［43］的研究發(fā)現(xiàn)無(wú)菌小鼠的能量利用和消耗高于普通小鼠。同樣地，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析我們發(fā)現(xiàn)無(wú)菌豬的能量代謝強(qiáng)于普通仔豬，但脂肪發(fā)育上卻弱于普通仔豬。如無(wú)菌豬中上調(diào)表達(dá)的差異基因顯著富集于脂肪分解、糖代謝和能量利用，如脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控信號(hào)通路（regulation of lipolysis in adipocytes）和糖異生相關(guān)的cAMP信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）等，而下調(diào)表達(dá)的基因則更多的與免疫、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)合成代謝有關(guān)，如具有調(diào)節(jié)器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及脂代謝功能的關(guān)鍵信號(hào)通路Hippo 信號(hào)通路（hippo signaling pathway）、與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、葡萄糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路以及與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的不飽和脂肪酸合成信號(hào)通 路（biosynthesis of unsaturated fatty acids signaling pathway）。這些研究結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)了正常的腸道菌群對(duì)于維持和促進(jìn)宿主動(dòng)物的脂肪代謝和脂肪組織發(fā)育是非常必要的。

4 結(jié)論

本研究基于無(wú)菌豬和普通豬脂肪細(xì)胞形態(tài)和脂肪基因表達(dá)譜的比較，證實(shí)了腸道微生物對(duì)于維持和促進(jìn)豬的脂肪組織發(fā)育具有重要影響。腸道微生物的缺失減少了豬的體脂沉積，削弱了脂肪細(xì)胞的生理功能，導(dǎo)致脂肪組織中數(shù)百個(gè)基因發(fā)生了顯著的變化，主要涉及細(xì)胞周期、免疫功能、物質(zhì)（糖、脂、氨基酸等）代謝和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控。