根瘤菌對水冬瓜根皮中二次代謝產物的影響

劉承貴，王 凱，李仕外，唐文雙，韓忠耀*

(1.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2.浙江新和成股份有限公司，浙江 紹興 312500)

根瘤菌[1-3]在豆科植物與非豆科植物中，通常起固氮增肥，促進植物體、中藥材生長及二次代謝產物積累功能。貴州特色民族藥水冬瓜根皮，來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥根皮，別名水五加、大接骨丹等[4]，在對水冬瓜根皮藥材野外調查采樣過程中，發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域分布的水冬瓜根部，發(fā)生與大豆根瘤菌共生的情況[5]，如貴州都勻小圍寨窯洞附近農舍與山腳處，水冬瓜根部大量有根瘤菌的存在情況，結瘤部位主要為側根。目前，有關山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的研究以用藥部位根皮部位為主、樹皮為輔，根皮中含有紫丁香苷[6-7]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等[8-10]，現(xiàn)代藥理實驗研究表明，山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu樹皮部位具有較好的免疫抑制[11-12]、抗炎鎮(zhèn)痛[13]等活性，同時，課題組前期對山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu根皮部位進行了提取工藝優(yōu)化[14]、質量控制[15-16]研究等。

查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，有關共生根瘤菌對水冬瓜根皮二次代謝產物的積累及藥材質量的影響與評價，尚無相關報道。因此，本實驗采用高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法對該藥二次代謝產物積累狀況開展相關研究，并采用烘干法測定浸出物含量，以期揭示根瘤菌對水冬瓜根皮藥材質量的影響。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，Agilent Cary 100紫外-可見分光光度計(美國安捷倫科技公司)，電子天平(FA1004B，溫州瑞昕儀器有限公司)，Sartorius BT25S電子天平(十萬分之一，德國塞多利斯公司)，101-3AB型烘箱等。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品(購自北京盛世康普化工技術研究院，批號：161214)，蘆丁對照品(購自成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17122001)，乙腈(天津科密歐化學試劑有限公司，色譜純)，磷酸(分析純，重慶川東化工(集團)有限公司)，水為娃哈哈純凈水(浙江娃哈哈集團有限公司)，亞硝酸鈉(分析純，重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20130307)，硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20170718)，氫氧化鈉((分析純，重慶川東化工(集團)有限公司，批號為20160101)，其他試劑均為分析純。

水冬瓜根皮藥材、共生根瘤菌水冬瓜根皮藥材均為自采，采集地點為貴州省都勻小圍寨窯洞區(qū)域，自采藥材經(jīng)黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校趙鴻賓副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根皮。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液提取

將自采同株水冬瓜根皮藥材根瘤菌部位與正常部位，烘箱烘干后的藥材，各取6份，每份約0.50 g，精密稱定后，記錄稱樣量，置于圓底燒瓶中，每份加入甲醇50 mL，每份樣品回流提取1 h，定性濾紙過濾于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 紫丁香苷含量測定方法

2.2.1 色譜條件[7]Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長220 nm，進樣量5 μL，柱溫35 ℃，體積流量1.0 mL·min-1，流動相為0.50%-磷酸溶液(A)-乙腈(C)，流動相洗脫條件見表1，保留時間為30 min。

表1 高效液相色譜流動相洗脫條件

2.2.2 對照品溶液的制備 取紫丁香苷對照品約8.60 mg，精密稱定，加入于50 mL量瓶中，取分析純甲醇適量，超聲溶解，再加入甲醇稀釋到刻度，搖勻，得質量濃度為0.172 0 mg·mL-1的紫丁香苷標準品溶液[14]。

2.2.3 供試品溶液 取“2.1”項下各供試品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液置于液相小瓶中，即得HPLC分析用各供試品溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，按照《中華人民共和國藥典》(2015版四部，0512高效液相色譜法測定)[16]。

圖1 對照品(A)與樣品(B) HPLC色譜

2.2.4 線性關系考察 精密量取標準品儲備溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，用分析純甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.1”項操作。以峰面積為縱坐標(Y)，溶液的質量濃度為橫坐標(X)作線性回歸方程，得到紫丁香苷線性回歸方程為Y=7 911.4X-12.736(r2=0.999 2)，線性范圍為0.034 4～0.516 0 mg·mL-1。

2.2.5 精密度試驗 參照文獻[7]，測定結果見表2，由表2可知，儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 參照文獻[7]，測定結果見表2，由表2可知，供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性較好。

2.2.7 重復性試驗 參照文獻[7]，測定結果見表2，由表2可知，該方法重復性良好。

表2 方法學考察結果 (n=6，%)

2.2.8 加樣回收率試驗 參照文獻[7]，測得樣品平均加樣回收率為100.43%，且RSD為1.98%，說明建立的方法回收率較好。

2.2.9 含量測定 精密吸取各供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，含量測定結果見表3。

表3 紫丁香苷含量檢測結果

2.3 總黃酮含量測定方法

2.3.1 標準曲線的繪制[14]取蘆丁對照品約18 mg，精密稱量，移置到50 mL量瓶內，加稀乙醇約為量瓶容積的1/3量，超聲溶解后，再加入稀乙醇適量，稀釋到刻度，搖勻，即得0.361 mg·mL-1的蘆丁標準品貯備液。精密吸取蘆丁標準品貯備液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋到刻度，搖勻。按照文獻[14]方法進行預處理，即可。在510 nm最大吸收波長下，稀乙醇空白調零，以蘆丁質量濃度(C值)為橫坐標，吸光度(A值)為縱坐標作A-C標準曲線，得蘆丁線性回歸方程為A=1.375 3C+0.000 24(r2=0.998 4)，結果表明蘆丁濃度在0.072 2～1.083 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 供試品溶液的制備及預處理 按“2.1”項操作，制得供試品溶液后，每份樣品，精密移取1 mL于10 mL量瓶中，按照文獻[14]方法進行預處理，依次用5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，依次進行波長衍生化后，即得總黃酮含量測定供試品溶液，備用。

2.3.3 方法學考察 參照文獻[7]，測定結果見表2，由表2可知，儀器精密度和重復性良好，樣品在2 h內穩(wěn)定性較好，可以滿足總黃酮含量測定檢測時限要求。

2.3.4 總黃酮含量測定 分別取“2.3.2”項下各供試品溶液，用Agient Cary 100紫外-可見分光光度計在510 nm 處分別檢測各樣品總黃酮含量，檢測結果見表4。

表4 總黃酮含量檢測結果

2.4 浸出物含量測定

按《中華人民共和國藥典》(2015版，四部“2201浸出物測定法”)[17]與課題組前期研究基礎篩選的浸出物測定方法[18]，對水冬瓜瓜根皮正常品與根瘤菌樣品進行浸出物含量測定，結果見表5。

表5 浸出物含量測定結果 (%)

2.5 含量測定結果分析

由表3、表4、表5可知，同株水冬瓜根瘤菌樣本與正常樣本二次代謝產物以紫丁香苷與總黃酮為指標評價相比較時，紫丁香苷平均含量分別為2.56 mg/g、0.51 mg/g，降低約5.02倍；總黃酮平均含量分別為0.062 9 μg/g、0.015 2 μg/g，降低約4.14倍。正常品浸出物測定結果無顯著性差異，而根瘤菌樣品波動較大，有顯著性差異。結果表明：水冬瓜根皮藥材與根瘤菌共生時，可極大降低其二次代謝產物含量，對該藥材二次代謝產物有不良影響。

3 討論

檢測二次代謝產物總黃酮時，首先要確定蘆丁標準液最大吸收波長。在200～800 nm波長下進行掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為510 nm，因此，將510 nm確定為最大吸收波長。

考察根瘤菌共生對同株藥材二次代謝產物影響過程中，與常規(guī)對共生植株起增加二次代謝產物含量或促進植物體生長積極作用相反，研究結果表明：同株共生根瘤菌大幅降低水冬瓜根皮藥材植物體二次代謝產物含量。同時，尚可通過指紋圖譜技術[19-21]，通過比較正常品藥材構建的指紋圖譜對照圖譜與根瘤菌病變藥材的相似度，來對藥材進行整體性質量評價，相關研究有待進一步深入開展。

綜上所述，根瘤菌顯著降低了水冬瓜根皮藥材中總黃酮、紫丁香苷的含量，而對浸出物結果影響不具有代表性意義，部分根瘤菌樣本浸出物含量高于正常部位。由于該藥物質基礎研究相對薄弱，根瘤菌對其他二次代謝產物的影響情況，在物質基礎研究基礎上，有待進一步深入研究與考察。