山茶油皂苷抗炎及抗菌作用研究

馮秋瑜，覃欽成，白燕遠(yuǎn)*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤醫(yī)藥與醫(yī)養(yǎng)結(jié)合人才小高地，廣西 南寧 530200)

山茶油在日常生活中是一種食用油，但是不少專家和學(xué)者經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山茶油具有很高的藥用價(jià)值。《本草綱目》記載山茶油具有潤(rùn)腸、清肺、祛痰等功效，“茶油性寒涼，味甘平，潤(rùn)腸通便，清熱化濕，潤(rùn)肺祛痰，利頭目”?！毒V目拾遺》認(rèn)為其具有殺蟲潤(rùn)腸等作用，能“潤(rùn)腸清胃，殺蟲解毒”[1]。《農(nóng)政全書》中描述山茶油“療瘡疥，退濕熱”?！吨袊?guó)藥典》將山茶油收錄其中，認(rèn)為其是一種軟膏基質(zhì)和注射用茶油的原料?，F(xiàn)代臨床對(duì)山茶油的功效和作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)山茶油能夠降血壓、降血脂以及對(duì)心腦血管疾病的預(yù)防具有較好效果。同時(shí)，山茶油還能夠清熱解毒、殺菌、抵抗紫外線，能夠有效預(yù)防皺紋和曬斑，所以也常將其應(yīng)用于皮膚科的治療中[2]。隨著人們對(duì)自然的崇尚，天然抗菌以及抗炎劑的開發(fā)成為近年來(lái)臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究山茶油抗菌消炎的活性成分，深入開發(fā)山茶油作為皮膚科用藥的應(yīng)用領(lǐng)域，助推廣西山茶油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，使山茶油的應(yīng)用價(jià)值得到更充分體現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

共48只實(shí)驗(yàn)小鼠，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(桂)2020-0031，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境飼喂5～7 d。

1.2 山茶油皂苷制備

由廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃慧學(xué)副教授通過(guò)乙醇熱回流方法提取得到，經(jīng)測(cè)定皂苷含量為66.3%。

1.3 供試菌種

大腸埃希菌EC(Escherichia coli，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；白色念珠菌MA(Monilia albicans，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；腸炎沙門氏菌SE(Salmonella enteritidis，購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司)；英諾克李斯特菌LM(L.monocytohenes，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；須癬毛癬菌TM-p(Trichophyton mentagrophyte，購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司)。

1.4 試劑

齊墩果酸(購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司)；佛波酯(TPA，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA) 試劑盒，均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.5 抗炎模型建立以及小鼠給藥方案

將48只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，地塞米松組(采用地塞米松治療，劑量為2.5 mg/kg) 和山茶油皂苷低、中、高劑量組(劑量分別為10.0 mg/kg、20.0 mg/kg和40.0 mg/kg)。除空白對(duì)照組外，其余各組在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)涂抹20 μL佛波酯致炎。并于造模同時(shí)，地塞米松組、山茶油皂苷組小鼠均在右耳內(nèi)外側(cè)涂抹相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)5 d，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠涂抹等體積生理鹽水。

1.6 小鼠耳腫脹程度測(cè)定

小鼠給藥6 h后，采用厚度測(cè)定儀(數(shù)字測(cè)厚儀)對(duì)小鼠兩只耳朵的厚度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量結(jié)果為每只小鼠測(cè)量2只耳朵的厚度差值。

1.7 小鼠耳朵組織中TNF-α、IL-6、IL-1β指標(biāo)測(cè)定

取小鼠相同部位的耳組織，對(duì)其稱重，留作備用。然后取一定質(zhì)量的耳組織，加入一定量生理鹽水，其中質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9。將耳組織做剪碎處理，并制作成組織勻漿，濃度為10%，最后做離心處理。離心處理好后，根據(jù)ELISA試劑盒使用說(shuō)明和操作步驟，對(duì)離心后的耳組織上清液進(jìn)行分析，測(cè)量耳組織中3種指標(biāo)的水平。

1.8 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

根據(jù)微量肉湯稀釋法，將待測(cè)山茶油皂苷提取液過(guò)濾除菌，2倍稀釋法將其用培養(yǎng)基稀釋成80.000～0.001 mg/mL稀釋液。取微量稀釋板(96孔)，每孔加入50 μL稀釋樣品液以及菌懸液，以100 μL劑量的不加樣品液且含菌培養(yǎng)基作對(duì)照，每組3個(gè)平行。EC、SE、LM在37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，MA在25 ℃下培養(yǎng)48 h，TM-p于25 ℃ 條件下培養(yǎng)7 d。觀察孔板測(cè)試菌生長(zhǎng)狀態(tài)，與對(duì)照孔比較發(fā)現(xiàn)，菌生長(zhǎng)被抑制，培養(yǎng)基清亮采用的最低藥物濃度值為山茶油皂苷最小抑菌濃度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 山茶油皂苷對(duì)小鼠耳腫脹程度的影響

與模型對(duì)照組相比，地塞米松組、山茶油皂苷組均能顯著降低小鼠耳厚度(P<0.05)，且山茶油皂苷高劑量組(40.0 mg/mL)耳腫脹抑制率與地塞米松組相當(dāng)(P>0.05)，見表1。

表1 山茶油皂苷對(duì)小鼠耳腫脹程度的影響

2.2 耳組織中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

山茶油皂苷高劑量能夠改善耳組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減少TNF-α、IL-6、IL-1β含量，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 耳組織中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

2.3 山茶油皂苷抑菌結(jié)果

山茶油皂苷對(duì)5個(gè)測(cè)試菌種均具有較好的抑菌能力，尤其是對(duì)須癬毛癬菌具有較優(yōu)越的抑菌活性，MIC=0.005 mg / mL，詳見表3。

表3 山茶油皂苷抑菌結(jié)果

3 討論

山茶油渾身是寶，且具有明確的抗炎抗菌作用。在本研究中，采用TPA致小鼠耳腫脹模型對(duì)山茶油皂苷抗炎活性結(jié)果顯示，地塞米松和山茶油皂苷局部治療TPA致小鼠耳腫脹，均顯著降低了小鼠耳腫脹程度(P<0.05)，且山茶油皂苷高劑量組(40.0 mg/mL)耳腫脹抑制率與地塞米松組相當(dāng)(P>0.05)，表明山茶油皂苷具有較好的抗炎作用。林朝悅等[5]采用角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹，經(jīng)茶油治療后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于消除腫脹和抗炎效果較好。對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析，推斷出現(xiàn)這種結(jié)果的原因在于茶油對(duì)于小鼠體腫脹足內(nèi)的丙二醛具有顯著降低效果，同時(shí)提高了SOD的整體活性，在抗炎的過(guò)程中可釋放出自由基，這有助于減輕小鼠體內(nèi)組織的氧化反應(yīng)。

人體炎性因子重要指標(biāo)參數(shù)包括TNF-α、IL-6，前者主要出現(xiàn)在炎性反應(yīng)初期，主要作用在于促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的釋放，同時(shí)還可以促進(jìn)IL-6釋放。TNF-α還作為反應(yīng)炎癥程度的重要指標(biāo)，直接反映患者體內(nèi)發(fā)生炎癥的嚴(yán)重程度[6]。IL-6能夠活化蛋白激酶，從而影響到轉(zhuǎn)錄激活因子，對(duì)于炎癥反應(yīng)的進(jìn)程起到促進(jìn)作用。IL-1β能夠促進(jìn)免疫應(yīng)答，也直接參與到人體炎性反應(yīng)的過(guò)程中，提高了人體NK細(xì)胞的殺傷能力，有助于提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-6[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山茶油皂苷的不同劑量組均能夠降低TNF-α水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中中劑量、高劑量組可明顯降低IL-6、IL-1β水平(P<0.05)，表明山茶油皂苷的抗炎過(guò)程和作用機(jī)理可能與抑制炎性因子TNF-α、IL-6的正常表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)性，在一定程度上能夠有效抑制炎癥的惡性反應(yīng)，有助于遏制炎癥反應(yīng)過(guò)程，防止組織因?yàn)檠装Y反應(yīng)而進(jìn)一步損傷。

山茶油具有一定的抑菌效果，常應(yīng)用于細(xì)菌、霉菌、酵母的抑菌過(guò)程中。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)不同菌種的抑菌濃度不盡相同，如對(duì)金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、大腸埃希菌、黑曲霉和米曲霉、枯草芽孢桿菌的濃度值分別為3%、1%、4%、3%和7%[8-9]。抑菌效果與氨芐青霉素相同，同時(shí)其熱穩(wěn)定性較高，不受pH差異影響。本實(shí)驗(yàn)選擇代表性菌種做試驗(yàn)，結(jié)果表明山茶油皂苷對(duì)環(huán)境有害菌具有抑菌能力，尤其對(duì)須癬毛癬菌效果最好，MIC為 0.005 mg/mL，因此，山茶油皂苷對(duì)有害菌具有較好抑菌活性。

除了具有抑菌、抗炎效果，山茶油還具有促進(jìn)藥物吸收的功效。王愛萍等[10]發(fā)現(xiàn)山茶油可直接影響皮膚結(jié)構(gòu)，對(duì)皮膚的屏障效果具有減弱效果，滲透性強(qiáng)，這樣有助于藥物通過(guò)皮膚吸收。研究發(fā)現(xiàn)山茶油的組織成分與人體皮膚較為類似，所以兩者的相容性較好，無(wú)刺激性[11]。相關(guān)研究顯示，山茶油能夠促進(jìn)氟比洛芬在皮膚組織中的吸收率，從而有效提高藥物經(jīng)皮滲透能力[12，13]。

綜上所述，山茶油皂苷在體外顯示對(duì)TPA致小鼠耳腫脹模型具有較強(qiáng)的抗炎作用，可能與抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β合成與釋放有關(guān)，并對(duì)多種菌有一定抑菌作用。