水飛薊賓原料藥、利加隆、水林佳大鼠體內(nèi)藥物動力學研究

周旖璇，張純剛，尹 麗，程 嵐

(遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116620)

水飛薊賓是從菊科植物水飛薊(SilybumMarianum(L.)Gaertn.)果實中提取的有效成分，是一種具有抗氧化性質(zhì)的黃酮類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理學表明水飛薊賓具有抗氧化[2]、保肝[3，6]、抗炎[4]、降血脂[5]、抗癌[6]以及神經(jīng)保護[7-8]等作用，目前主要應(yīng)用于肝膽系統(tǒng)疾病的治療。

由于水飛薊賓難溶于水、口服吸收差、生物利用度低，其臨床應(yīng)用受到了一定限制，故近年來國內(nèi)外正積極開發(fā)水飛薊賓新技術(shù)新劑型。目前水飛薊賓相關(guān)保肝藥物種類較多，如利加隆?、益肝靈片、水飛薊賓膠囊(水林佳?)和水飛薊賓葡甲胺片等，都在臨床得到廣泛應(yīng)用，對于急慢性肝炎、早期肝硬化、中毒性肝炎、脂肪肝、藥物中毒性肝損傷及酒精性肝損害有較好的療效。本實驗建立了快速、靈敏的高效液相色譜法測定大鼠血漿中水飛薊賓濃度，對水飛薊賓原料藥和市售利加隆?、水林佳?膠囊在大鼠體內(nèi)的藥物動力學進行研究，為水飛薊賓相關(guān)藥物的開發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀LC-2010A(日本島津公司)；XH-C漩渦混合器(金壇市白塔新寶儀器廠)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；HH-2K4四孔恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；FA1004精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

水飛薊賓原料藥(質(zhì)量分數(shù)98%，上海哈靈生物科技有限公司，批號HLZB0807)；卡馬西平對照品(質(zhì)量分數(shù)98%，天津西典化學科技有限公司，批號 C833320)；水飛薊賓對照品(質(zhì)量分數(shù)98%，上海哈靈生物科技有限公司，批號 110856-201506)；水飛薊素膠囊(Legalon?)(德國馬博士大藥廠)；水飛薊賓膠囊(水林佳?)(天津天士力制藥股份有限公司)；β-葡糖醛酸酶(SIGMA公司)；肝素鈉注射液(馬鞍山豐原制藥有限公司)；甲醇(OCEAPAK色譜級。瑞典歐森巴克化學公司)；冰乙酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 動物

健康SD大鼠18只，雄性，體質(zhì)量(250±20)g，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent Extend C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為A甲醇-B水相=44∶56(水相為水-冰醋酸=52∶1)梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；進樣量50 μL；檢測波長為287 nm；柱溫為40 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 水飛薊賓對照溶液制備 稱取水飛薊賓對照品50 mg于100 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得500 μg/mL的水飛薊賓對照品儲備液。取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成系列對照品溶液，濃度為100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL、10 000 ng/mL、20 000 ng/mL、100 000 ng/mL，放置在4 ℃條件保存。

2.2.2 內(nèi)標溶液制備 稱取適量卡馬西平對照品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成5 μg/mL的內(nèi)標溶液，放置在4 ℃條件保存。

2.2.3 給藥溶液制備 稱取水飛薊賓原料藥56.0 mg，用0.5% CMC-Na溶液8 mL混懸，配制成7 mg/mL的給藥溶液，放置在4 ℃條件保存。稱取含水飛薊賓56.0 mg的利加隆?(水飛薊賓含量約為38%)和水林佳?(水飛薊賓含量約為26%)，用0.5% CMC-Na溶液8 mL混懸，配制得7 mg/mL的給藥溶液，放置在4 ℃條件保存。

2.2.4 水飛薊賓質(zhì)控(QC)溶液的配制 取適量水飛薊賓對照品儲備液，加甲醇稀釋后配制成200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL的質(zhì)控溶液，放置在4 ℃條件保存。

2.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿150 μL，加入酶溶液(β-葡糖醛酸酶溶液，酶活性相當于1 000 U/100 μL) 100 μL，渦旋混合1 min，于37 ℃水浴中孵化8 h。取出，加入甲醇15 μL，內(nèi)標溶液(5 μg/mL卡馬西平溶液)15 μL，渦旋震蕩1 min，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋震蕩2 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液900 μL，40 ℃下吹干，加入流動相80 μL復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，取50 μL上清液進樣。

2.4 專屬性考察

取大鼠空白血漿150 μL，將加入內(nèi)標溶液15 μL改為加入甲醇15 μL，不加酶溶液，其余按“2.3”項下的方法操作，得到血漿樣品A；在空白血漿中加入水飛薊賓對照品溶液和卡馬西平溶液，按“2.3”項下的方法操作，得到血漿樣品B；取給藥后大鼠血漿樣品，按“2.3”項下的方法操作，得到血漿樣品C。色譜見圖1。

圖1 大鼠空白血漿(A)、大鼠空白血漿+對照品(B)和血漿樣品(C)HPLC色譜

2.5 方法精密度與準確度

取低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項條件進樣測定。每個濃度樣品測定6次，連續(xù)測定3天，計算日內(nèi)精密度、日間精密度和準確度。

2.6 提取回收率

取低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項條件進樣，記錄峰面積結(jié)果；另取大鼠空白血漿150 μL，加入甲醇15 μL，渦旋震蕩1 min，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋震蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，取900 μL上清液，加入3種不同濃度的質(zhì)控溶液和內(nèi)標溶液，40 ℃下吹干，用流動相80 μL復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，取50 μL上清液進樣，記錄峰面積結(jié)果。通過兩種峰面積之比求水飛薊賓與內(nèi)標的提取回收率。

2.7 穩(wěn)定性考察

取低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”項下方法處理，進樣分析，每個濃度制備3份樣品，分別考察水飛薊賓血漿樣品室溫放置2 h、處理后4 ℃放置24 h、凍融循環(huán)1次、凍融循環(huán)3次、-20 ℃放置30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。

表1 梯度洗脫程序 (%)

2.8 藥物動力學研究方法

將大鼠隨機分成3組，每組6只，給藥前禁食12 h(不禁水)。第1組灌胃給予水飛薊賓原料藥(給藥劑量：25 mg/kg)，第2組灌胃給予利加隆?(給藥劑量：25 mg/kg，以水飛薊賓計)，第3組灌胃給予水林佳?(給藥劑量：25 mg/kg，以水飛薊賓計)，在給藥后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h眼眶取血0.5 mL，置肝素化試管中，4 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃條件下保存。采用DAS 3.0軟件求得主要藥動學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 水飛薊賓測定方法學考察

3.1.1 方法專屬性 試驗結(jié)果表明，在上述色譜條件下，藥物和內(nèi)標峰形良好，水飛薊賓雙峰分離效果較好且出峰時間適宜，水飛薊賓雙峰的保留時間分別為8.860 min和9.882 min，內(nèi)標的保留時間為12.907 min。

3.1.2 標準曲線和定量下限 取空白血漿，加入水飛薊賓系列標準溶液，制備成10 h、20 h、100 h、200 h、500 h、1 000 h、2 000 h、10 000 ng/mL的標準血漿樣品。不加酶溶液，按“2.3” 項下依法處理。以水飛薊賓質(zhì)量濃度為橫坐標，水飛薊賓與卡馬西平的峰面積之比為縱坐標，求得標準曲線，采用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，回歸方程為Y=0.001 4x+0.036 9，R2=0.998 6(r=0.999 3)，水飛薊賓在10～10 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為10 ng/mL。

3.1.3 精密度和準確度 結(jié)果顯示，低、中、高3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度分別為2.42%、1.67%、1.91%(n=6)；日間RSD分別為2.38%、1.89%、1.81%(n=3)，準確度分別為(102.3±2.50)%、(101.6±1.70)%、(100.2±1.75)%(n=6)，符合要求。

3.1.4 提取回收率 低、中、高3個質(zhì)量濃度的提取回收率分別為84.3%、87.4%、82.3%，(n=3)。內(nèi)標卡馬西平的提取回收率為82.5%(n=3)。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗 試驗結(jié)果表明，血漿樣品在上述條件下的RE均在±15%內(nèi)，結(jié)果見表2。

表2 不同貯藏條件下穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3.2 藥物動力學結(jié)果

大鼠灌胃給予水飛薊賓原料藥、利加隆和水林佳的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 水飛薊賓原料藥、利加隆和水林佳大鼠體內(nèi)血藥濃度-時間曲線

將大鼠灌胃給予水飛薊賓原料藥、利加隆和水林佳的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用DAS 3.0軟件處理，藥物動力學參數(shù)見表3。結(jié)果顯示，利加隆、水林佳組Cmax分別為(495.3±123.5)ng/mL、(5 895.8±2 487.1)ng/mL，與原料藥組相比，藥物達峰濃度高，吸收好。原料藥、利加隆、水林佳AUC0～12分別為(1 459.0±321.2)ng·h/mL、(5 268.2±681.3)、(8 179.3±1 070.0)ng·h/mL，與原料藥組相比，兩組市售膠囊均提高了水飛薊賓生物利用度，相對生物利用度分別為361.0% 和560.6%。

表3 藥物動力學參數(shù)

4 討論

水飛薊賓是以水飛薊賓A和水飛薊賓B兩種非對映異構(gòu)體形式存在[9]，在本實驗色譜條件下，水飛薊賓為雙峰，分離效果較好，因此以雙峰峰面積之和來計算血漿中藥物濃度。水飛薊賓、卡馬西平在相同色譜條件下出峰位置合適，且無組分峰影響，故本實驗選用卡馬西平為內(nèi)標物[10]。

由于水飛薊賓在血液中大部分以葡糖醛酸結(jié)合型存在，游離型含量很低，為了更準確地考察水飛薊賓在大鼠體內(nèi)的生物利用度[11]，實驗采用酶解法，測定血漿中水飛薊賓總含量。采用SIGMAβ-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)溶液對血漿樣品進行預處理，在確定血漿樣品的處理方法過程中，比較了β-葡糖醛酸糖苷酶活性(100 U/100 mL、200 U/100 mL、500 U/100 mL、1 000 U100/mL)及孵化時間(1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h)對血藥濃度的影響，最終確定酶解條件為β-葡糖醛酸糖苷酶活性1 000 U/100 mL，37 ℃水浴孵化8 h。

與原料藥相比，兩種水飛薊賓膠囊生物利用度提高的原因可能為：利加隆是一種高品質(zhì)的水飛薊素制劑，具有高含量、高純度和高體外溶出度等特點。經(jīng)特殊工藝提取后，水飛薊素純度提高，水溶性增加，溶解度增大，更多藥物通過胃腸道黏膜被吸收，從而提高了生物利用度。水林佳是水飛薊賓與卵磷脂組成的復合物產(chǎn)品，利用固體分散技術(shù)提高了水飛薊賓水溶性和脂溶性，從而提高了生物利用度[12]。這種提高可能與水飛薊賓一卵磷脂復合物中的磷脂有關(guān)，磷脂是細胞膜的重要組成部分，能夠保持細胞膜的流動性，從而改善了胃腸道黏膜對藥物的吸收。

本實驗建立了HPLC法測定大鼠體內(nèi)水飛薊賓的血藥濃度，進而獲得其藥物動力學參數(shù)。該法簡單高效、靈敏度高、特異性強，適用于研究水飛薊賓在大鼠體內(nèi)的藥物動力學過程。