離子液體超聲輔助協(xié)同萃取中藥天麻指標(biāo)成分的研究

段新新，王莉，吳仁安，鄧仕任，夏林波

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023)

天麻(GastrodiaelataBlume)為蘭科植物天麻的干燥塊莖，其氣微，味甘，性平，歸肝經(jīng)。天麻具有息風(fēng)止痙[1]、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，可用于治療肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、驚癇抽搐、眩暈、頭痛、肢體麻木、手足不遂、風(fēng)濕痹痛等,同時(shí)還有抗抑郁的作用[2]。天麻中含有天麻苷、多糖、香莢蘭醇、香蘭醛、維生素A、琥珀酸、β-谷甾醇、黏液質(zhì)等多種成分[3]，其中含量較高的主要成分是天麻苷，也稱(chēng)天麻素。天麻素具有鎮(zhèn)定和安眠的作用，通常用來(lái)治療頭暈?zāi)垦?、失眠多?mèng)、神經(jīng)衰弱等。近年來(lái)有關(guān)天麻的指標(biāo)成分研究領(lǐng)域比較重視。巴利森苷類(lèi)成分是由天麻素和檸檬酸組成，具有熱不穩(wěn)定性，酯鍵易斷裂發(fā)生降解，在一定條件下，易與天麻素相互轉(zhuǎn)化，且含量遠(yuǎn)高于天麻素及其苷元[4]。以巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G為代表，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 巴利森苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)式

目前，天麻中天麻素及巴利森苷類(lèi)化合物的提取方法主要有超聲波提取法[5-6]、浸提法、回流提取法[7-8]、微波萃取[9]和酶解提取法[10]等，提取溶劑主要有甲醇、乙醇、水。這些溶劑提取率低，能耗大，且易造成環(huán)境污染等問(wèn)題。室溫離子液體是由一個(gè)有機(jī)陽(yáng)離子和一個(gè)有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成的液態(tài)有機(jī)鹽，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，離子液體具有極性可調(diào)控、熱穩(wěn)定性好，液態(tài)范圍寬、蒸汽壓小[11]等特點(diǎn)，此外離子液體還可根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)，通過(guò)改變陰陽(yáng)離子的組合或基團(tuán)的引入以提高對(duì)目標(biāo)化合物的提取率[12]，是一種可替代傳統(tǒng)溶劑的新型綠色溶劑[13]，在天然產(chǎn)物提取方面廣受關(guān)注[14-16]。目前，基于離子液體對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的工藝鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[17-22]所提到過(guò)的天麻的指標(biāo)成分提取及質(zhì)量控制，將天麻素及巴利森苷類(lèi)化合物同時(shí)作為天麻指標(biāo)成分進(jìn)行考察更為全面。因此，本試驗(yàn)以天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E及巴利森苷G為指標(biāo)，通過(guò)離子液體結(jié)合超聲輔助的方法對(duì)天麻進(jìn)行提取，并運(yùn)用質(zhì)譜法檢測(cè)研究，通過(guò)考察影響提取率的主要因素以確立最佳提取條件。由于不同因素可能對(duì)各指標(biāo)成分提取效果的影響有所不同，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以各指標(biāo)成分離子強(qiáng)度的加和作為主要考察指標(biāo)來(lái)進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 巴利森苷類(lèi)化合物在負(fù)離子模式下的高分辨質(zhì)譜參數(shù)

由于巴利森苷B與巴利森苷C，巴利森苷E與巴利森苷G為同分異構(gòu)體[26]，因此這4種物質(zhì)分別考察巴利森苷B與巴利森苷C、巴利森苷E與巴利森苷G離子強(qiáng)度的加和。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FSJ-A03D1粉碎機(jī)(小熊電器股份有限公司)；QTSXR20500型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；HSE-12B型固相萃取裝置(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；HGC-12A型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；SolariX XR-15T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS,Bruker Daltonics,德國(guó))；電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；Centrifuge 5804R艾本德冷凍離心機(jī)。

1.2 材料 中藥飲片天麻，購(gòu)于大連市益春堂大藥房(西安路店)，產(chǎn)于安徽亳州中強(qiáng)中藥飲片有限公司，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所王莉教授鑒定為中藥天麻飲片；甲醇為分析純；試驗(yàn)用水為超純水；離子液體1-丁基-3-甲基咪唑乙酸鹽([BMIM][CH3COO],純度98%，深圳市益百順科技有限公司)；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([BMIM][Cl]，純度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-丁基氯化吡啶([BPY]Cl，純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法學(xué)考察

2.1 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI電噴霧離子源負(fù)離子模式掃描：流速2 μL·min-1；掃描范圍(m/z)46～1 500；分辨率240 000；霧化氣壓1.0 bar；毛細(xì)管電壓4.5 kV；干燥氣溫度200 ℃，流速4.0 L·min-1；離子累積時(shí)間0.1 s。

2.2 精密度試驗(yàn) 取天麻粗粉100 mg,加入1 mL 70%甲醇水溶液，浸泡30 min后超聲60 min，離心(4 ℃，14 000 r·min-1)10 min，取上清液，過(guò)SPE(C18)柱除去離子液體，水洗后再用甲醇洗脫。將收集到的洗脫液氮?dú)獯蹈?，再? mL 70%甲醇水溶液復(fù)溶，再次離心后取上清液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。連續(xù)進(jìn)樣3次，根據(jù)各指標(biāo)成分的離子強(qiáng)度計(jì)算RSD。結(jié)果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分別為0.82%、1.18%、2.67%和2.85%，表明儀器具有較好的精密度。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取天麻粗粉3份，其他操作同“2.2”項(xiàng)下。結(jié)果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分別為3.88%、13.78%、2.37%、13.46%，3份樣品測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于15%，表明本法具有較好的重復(fù)性。

3 提取條件的考察

3.1 單因素考察

3.1.1 離子液體的考察 取天麻粗粉4份，每份100 mg，放入離心管中，分別加入70%甲醇及濃度為0.5 mol·L-1不同離子液體的70%甲醇水溶液，離子液體分別為[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl，料液比1∶10，浸泡30 min后超聲60 min，離心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)，取上清液，過(guò)SPE柱(C18)除去離子液體，水洗后再用甲醇洗脫。將收集到的洗脫液氮?dú)獯蹈?，各? mL 70%甲醇水溶液復(fù)溶，再次離心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)后取上清液，按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣3次，取平均值，觀察不同離子液體提取的天麻指標(biāo)成分的離子信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果如圖2。

由圖可知，[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl 3種離子液體對(duì)天麻素及巴利森苷A、B、C、E、G的提取效果均明顯強(qiáng)于70%甲醇水溶液。其中，提取天麻素及巴利森苷A時(shí)，[BMIM][CH3COO]的效果最好,其他均為[BPY]Cl的提取效果最好。因3種離子液體與甲醇比較，都具有較高的提取效率，后續(xù)將在正交分析中進(jìn)一步考察三者的影響。

3.1.2 離子液體濃度的考察 取中藥天麻粗粉6份，每份100 mg，分別加入濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5 mol·L-1的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液1 mL，其他操作同“3.1.1”項(xiàng)下，考察離子液體濃度對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的影響(見(jiàn)圖3)。

圖3 離子液體濃度對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，[BPY]Cl-70%甲醇水溶液濃度為1.5 mol·L-1時(shí)，對(duì)天麻素及巴利森苷A的提取效果遠(yuǎn)高于其他濃度，而其濃度為0.5或1 mol·L-1時(shí)對(duì)巴利森苷E、G的提取效果更好。此外，離子液體濃度對(duì)巴利森苷B及巴利森苷C的提取效率無(wú)明顯影響。綜合6個(gè)指標(biāo)成分的離子強(qiáng)度，選擇提取天麻指標(biāo)成分的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液濃度為1 mol·L-1。

3.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)的考察 取中藥天麻粗粉5份，每份100 mg，放入離心管中，加入濃度為1 mol·L-1的[BPY]Cl的甲醇水溶液，甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、90%、100%，其他操作同“3.1.1”項(xiàng)下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻指標(biāo)成分提取效果的影響，見(jiàn)圖4。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)對(duì)天麻素及巴利森苷A的提取效果遠(yuǎn)高于其他，而甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)對(duì)巴利森苷B/C、E/G的提取效果較好。綜合6個(gè)指標(biāo)成分的提取效果，選擇的[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%。

3.1.4 料液比的考察 取中藥天麻粗粉4份，每份100 mg，放入離心管中，加入濃度為1 mol·L-1的[BPY]Cl-甲醇溶液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g·mL-1)，其他操作同“3.1.1”項(xiàng)下，考察料液比對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的影響，見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)天麻指標(biāo)成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶5或1∶20時(shí)，1 mol·L-1[BPY]Cl-甲醇溶液的對(duì)天麻素、巴利森苷A、B、C的提取效果均好于其他，而料液比為1∶5時(shí)，對(duì)巴利森苷E、G提取效果最好。綜合6種指標(biāo)成分，提取效果最好的料液比為1∶5。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取參數(shù) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇離子液體種類(lèi)(A)、離子液體濃度(B)、提取溶劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)作為因素進(jìn)行考察，以分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度作為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，不考慮因素間的交互影響，進(jìn)一步優(yōu)化天麻中指標(biāo)成分的提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平表如表2所示。由于料液比過(guò)小會(huì)導(dǎo)致取樣困難，因此在本次正交試驗(yàn)中選用料液比1∶5、1∶10、1∶15三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

取天麻粉末9份，每份100 mg，按照4因素3水平正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在此條件下對(duì)天麻中指標(biāo)成分進(jìn)行提取，比較總指標(biāo)成分的分子離子峰相對(duì)強(qiáng)度。

由表3中R值可看出，各因素對(duì)天麻總指標(biāo)成分提取量的影響大小順序依次為：A>C>B>D，即離子液體種類(lèi)>甲醇體積分?jǐn)?shù)>離子液體濃度>料液比。通過(guò)分析可知，離子液體-超聲波輔助法提取中藥天麻中指標(biāo)成分較佳的提取條件為：A2B1C1D1，即離子液體[BMIM]Cl，離子液體濃度0.5 mol·L-1，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶5(g·mL-1)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.3 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取天麻粉末3份，每份100 mg，分別以最佳提取工藝(A2B1C1D1)進(jìn)行萃取，結(jié)果3份樣品的分子離子峰加和強(qiáng)度分別為1.26、1.31和1.28，平均值為1.28。由數(shù)據(jù)可知，正交法所得到的離子液體協(xié)同超聲輔助提取最佳工藝穩(wěn)定可靠，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 討論

離子液體協(xié)同超聲輔助提取是一種新型、綠色的提取方法，相比于傳統(tǒng)溶劑，該方法的提取效率更高，其原理可能為：①離子液體可與被提取物發(fā)生氫鍵作用、疏水作用等分子間作用力[12]；②離子液體對(duì)纖維素有良好的溶解能力，細(xì)胞壁的主要成分就是纖維素[26]。

試驗(yàn)所用到的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀具有分辨率高、精密度好、操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，能夠很好地檢測(cè)ESI電噴霧離子源產(chǎn)生的多電荷離子，在中藥提取及化合物解析方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值及前景。

本試驗(yàn)對(duì)中藥天麻指標(biāo)成分的提取工藝進(jìn)行了考察及優(yōu)化，該工藝操作簡(jiǎn)單、節(jié)能、環(huán)保、高效，是提取天麻素及巴利森苷類(lèi)化合物的有效方法，為離子液體超聲輔助協(xié)同提取天麻指標(biāo)成分提供參考。