煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞的毒性作用

史新琛 ， 徐海明 ，2， 郝艷星 ， 張映馳 ， 張鵬舉 ，2， 田大年 ，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

一直以來，長期接觸煤塵導(dǎo)致的煤工塵肺是我國最主要的法定職業(yè)病之一[1]。關(guān)于塵肺的發(fā)病機(jī)制學(xué)說眾多，目前趨向于綜合作用學(xué)說[2]。早期的研究[3-5]表明，煤工塵肺患者及煤工塵肺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型生物樣本中（如外周血血清、肺泡灌洗液等）存在氧化應(yīng)激失衡及炎性反應(yīng)等現(xiàn)象。在參與炎癥反應(yīng)的諸多信號(hào)通路中，膽堿能抗炎通路是一條與神經(jīng)免疫機(jī)制相關(guān)的抗炎通路，通過分泌乙酰膽堿（ACh），抑制炎性因子釋放，快速而直接地調(diào)節(jié)全身性炎性反應(yīng)。一方面，ACh 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)。另一方面，很多非神經(jīng)細(xì)胞也可以合成ACh 并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細(xì)胞外液，作用于ACh 受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等生理學(xué)過程，該系統(tǒng)稱為非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)[6]。

課題組前期研究[7]表明，非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)關(guān)鍵分子乙酰膽堿酯酶（AChE）在煤工塵肺患者外周血血清中降低。研究[8-10]表明，非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)。本研究擬采用人肺腺癌A549 細(xì)胞為靶細(xì)胞，同時(shí)探討煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡、炎性細(xì)胞因子及非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)關(guān)鍵分子AChE 活性和ACh 受體的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人肺腺癌A549 細(xì)胞為來源于2 型肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，用含10%小牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，用0.125%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化傳代，2～3 d 傳代 1 次。

1.2 煤塵

煤塵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，粒徑＜5 μm（圖 1），硫含量 1.29%，灰分27.35%，揮發(fā)分7.94%，碳64.59%，不含二氧化硅。將坩堝用雙蒸水清洗干凈，置于含30%硝酸的液體中浸泡24 h，取出坩堝，用蒸餾水沖洗坩堝，待其自然晾干。將煤塵置于坩堝中，放于馬弗爐中，300 ℃烘烤4 h，待恢復(fù)至常溫，取出坩堝，將煤塵放于15 mL 潔凈的離心管中。隨后，將煤塵加入完全培養(yǎng)基中，配制成1 mg·L-1濃度的煤塵毒物，現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前梯度稀釋成相應(yīng)濃度。

圖1 煤塵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 電鏡表征圖（×10000）

1.3 細(xì)胞染毒

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為8.0×104個(gè)/mL，接種于 96 孔板中（100 μL/孔）。設(shè)置空白組、對(duì)照組及 50、100、200、400、600 μg·mL-1暴露組。圍繞實(shí)驗(yàn)孔的外圍孔中加1×PBS 溶液，用于維持濕潤條件?？瞻捉M只加入100 μL 的完全培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞。待細(xì)胞生長24 h 后，吸走培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組每孔加100 μL 的完全培養(yǎng)基，各個(gè)暴露組加入相應(yīng)濃度的煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液，染毒時(shí)長為24 h。暴露結(jié)束后，在空白孔、對(duì)照孔及暴露孔內(nèi)均加 10 μL 的 CCK8 溶液，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值，測(cè)定波長為450 nm。校正吸光度值（OD）為扣除空白孔OD 值之后的數(shù)值。

1.4 細(xì)胞上清液及裂解液收集

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，接種于 6 孔板中（2 mL/孔）。根據(jù) CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)細(xì)胞活力無影響的劑量為暴露濃度，暴露時(shí)長為24 h。暴露結(jié)束后，將上清液收集至離心管，用于測(cè)定白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達(dá)水平。隨后，加入預(yù)冷PBS 輕洗2 次，使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，加入100 μL濃度為 0.4 mmol·L-1的低鹽裂解液（含 0.5 mol·L-1的芐脒鹽酸鹽），劇烈振蕩30 s，冰上靜置4 min，重復(fù)上述操作 5 次。4 ℃低溫離心（12000 r·min-1）后，收集上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及AChE 表達(dá)水平。

1.5 生化測(cè)定

使用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定樣品中的總蛋白；通過比色法測(cè)定SOD（南京建成生物工程研究所）及MDA（北京華英生物技術(shù)研究所）水平；采用ELISA 法測(cè)定IL-6 水平（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；通過改良Ellman 法測(cè)定AChE 的活性。根據(jù)各試劑盒的線性測(cè)定范圍確定合適的稀釋倍數(shù)。

1.6 基因表達(dá)水平的測(cè)定

使用一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，熒光定量PCR 法檢測(cè)CHRNA9（Gen－Bank No. NM_017581.4）mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA 鏈的拷貝數(shù)，CHRNA9 上游引物序列為5’-CAGAGACGGCAGATGGAAA-3’，下游引物序列為 5’-CCACTGGACGAAGAGCATTAGAA-3’，管家基因 β-actin（GenBank No. NM_001101.5）上游引物序列為5’-GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3’，下游引物序列為 5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’，使用 2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 法。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q）］描述，兩組組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)的方法，多組組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)的方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 暴露對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞活性的影響

煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激A549 細(xì)胞24 h 后，測(cè)定細(xì)胞的存活率。結(jié)果表明，50、100、200 μg·mL-1煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)刺激細(xì)胞 24 h 后，對(duì)細(xì)胞存活率均無影響（P 均＞0.05），見表1。在后續(xù)的暴露實(shí)驗(yàn)中選擇這3 個(gè)劑量進(jìn)一步研究煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暴露對(duì)A549 細(xì)胞的損傷效應(yīng)。

表1 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549細(xì)胞 24 h 后對(duì)細(xì)胞活性的影響（）

表1 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549細(xì)胞 24 h 后對(duì)細(xì)胞活性的影響（）

注：有相同字母視為組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無相同字母視為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度/（μg·mL-1）n24 h 0 9 1.23±0.12a 50 9 1.03±0.19a 100 9 0.99±0.20a 200 9 0.90±0.16a 400 9 0.81±0.02bc 600 9 0.72±0.14c

2.2 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激下對(duì)A549細(xì)胞中SOD、MDA 及IL-6 表達(dá)水平的影響

GBW11104 暴露可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD 活性發(fā)生不同程度的變化。與對(duì)照組相比，100 μg·mL-1暴露組 SOD 活性降低了 15.4%（P＜0.05）。 暴露后各劑量組MDA 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。與對(duì)照組相比，100、200 μg·mL-1暴露劑量下IL-6 水平分別升高了74.5%和77.9%（P均＜0.05），見表 2。

表2 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞24 h 后對(duì) SOD、MDA 及 IL-6 水平的影響（）

表2 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞24 h 后對(duì) SOD、MDA 及 IL-6 水平的影響（）

注：有相同字母視為組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無相同字母視為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IL-6/（pg·μL-1）0 3 10.31±0.86a 44.97±2.06a 6.05±1.46b 50 3 9.49±1.21ab 45.57±2.71a 6.85±1.57b 100 3 8.72±0.94b 47.77±7.10a 10.56±3.55a 200 3 9.40±1.65ab 49.23±4.10a 10.76±1.66a煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/（μg·mL-1） nSOD/（U·mg prot-1）MDA/（pmol·mgprot-1）

2.3 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549細(xì)胞24 h 后對(duì)AChE 活性的影響

GBW11104 暴露可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AChE 活性發(fā)生不同程度的變化。與對(duì)照組相比，100 μg·mL-1暴露組 AChE 活性降低了 12.2%（P＜0.05），見圖2。

圖2 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞 24 h 后對(duì) AChE 活性的影響（）

2.4 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激對(duì)A549 細(xì)胞中的AChE 受體CHRNA9 mRNA 的表達(dá)水平

GBW11104 暴露與A549 細(xì)胞中非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)關(guān)鍵分子ACh 受體CHRNA9 mRNA表達(dá)水平的劑量-反應(yīng)關(guān)系呈倒U 形曲線。50、100、200 μg·mL-1暴露劑量下細(xì)胞內(nèi)CHRNA9 mRNA 表達(dá)水平分別相當(dāng)于對(duì)照組的231%、167%和 71%（P 均＜0.05），見圖 3。

圖3 煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞 24 h 后對(duì) CHRNA9 mRNA 表達(dá)水平的影響（）

3 討論

在塵肺發(fā)生、發(fā)展過程中，機(jī)體氧化和抗氧化平衡被打破是關(guān)鍵事件之一。SOD 是機(jī)體重要的清除自由基的物質(zhì)，機(jī)體開始接觸粉塵時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，SOD 表達(dá)水平應(yīng)激增高用以清除自由基。隨著接觸時(shí)間的延長，SOD 被逐漸消耗，其含量也降低。MDA 是生物膜的多不飽和脂肪酸過氧化分解的終產(chǎn)物，它通過交聯(lián)核酸等大分子物質(zhì)使組織老化，其含量可以作為機(jī)體生物膜受損傷程度的定量指標(biāo)之一[3，11-12]。在本研究中，盡管煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瞬時(shí)刺激并未影響A549 細(xì)胞中MDA 表達(dá)水平，但卻導(dǎo)致SOD 水平下降。提示煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暴露從一定程度上影響了A549細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化平衡。

IL-6 是由巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在塵肺的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抗炎、促炎、致纖維化等多種作用[12-13]。課題組前期研究[7]表明，與對(duì)照人群相比，煤工塵肺人群血清中IL-6 水平升高。Meta 分析結(jié)果[14]表明，IL-6 基因-174C/G 位點(diǎn)多態(tài)性與塵肺易感性之間無相關(guān)性，-634C/G 位點(diǎn)多態(tài)性與塵肺易感性之間有相關(guān)性，-634C/G 位點(diǎn)CC 基因型是塵肺的易感基因型。本研究中，GBW11104 刺激A549細(xì)胞24 h 后，上清液中IL-6 的表達(dá)量逐漸升高。這一結(jié)果提示，外源性煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以誘導(dǎo)A549 的炎性反應(yīng)。

ACh 除了作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞中傳遞信息外，也可被非神經(jīng)細(xì)胞合成并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細(xì)胞外液，作用于ACh受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等基本的生物學(xué)活動(dòng)，此被稱為非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)[15]。值得注意的是，肺泡上皮細(xì)胞也可合成和分泌ACh，同時(shí)表達(dá)ACh 受體。研究[8]表明，外源性的ACh受體激動(dòng)劑（如卡巴膽堿）作用于ACh 受體能促進(jìn)A549 細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT）。本研究中，煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暴露引起A549 細(xì)胞中AChE活性下降，同時(shí)可以影響CHRNA9 mRNA 的表達(dá)水平。上述結(jié)果提示，煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暴露可能通過影響非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)關(guān)鍵分子AChE及ACh 受體的水平，進(jìn)而影響A549 細(xì)胞的EMT過程。因此，下一步應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)A549 細(xì)胞EMT 結(jié)局的影響。

綜上，煤炭標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW11104 暴露對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞有一定的毒性作用，具體表現(xiàn)為影響中氧化和抗氧化平衡、導(dǎo)致炎性反應(yīng)、影響非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)關(guān)鍵分子AChE 及ACh受體的水平。