雄激素通過HMGB-1 介導(dǎo)細(xì)胞自噬促大鼠前列腺增生

秦凱悅， 趙瑞寧， 李亞杰， 楊博雅， 李佳鑫， 郭鳳英， 李光華， 聶黎虹

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科，銀川 750004）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性隨年齡增長不可避免的進(jìn)展性疾病[1]，嚴(yán)重時可導(dǎo)致下尿路梗阻癥狀（lower urinary tract symptoms，LUTS）[2]。雄激素的存在是BPH 發(fā)生的前提和基礎(chǔ)，但機(jī)制仍待進(jìn)一步明確[3-4]。自噬是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一種生命現(xiàn)象[5-6]，其在增生、炎癥、衰老等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，雄激素可以調(diào)控其發(fā)生[9]。研究[10-11]表明，5-α 還原酶抑制劑聯(lián)合自噬抑制劑可以降低BPH 患者臨床進(jìn)展的危險性，提示細(xì)胞自噬水平的改變可能在BPH 進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于雄激素調(diào)控自噬參與BPH 發(fā)生及機(jī)制的研究鮮有報道。本研究擬建立雄激素致大鼠BPH 動物模型，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗技術(shù)，探討細(xì)胞自噬在雄激素致大鼠BPH 發(fā)生中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

雄性 SD 大鼠（體質(zhì)量 250～270 g）購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，許可證號SCXK（寧）2011-001。

1.2 主要試劑

高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB-1）（RayBiotech Life 公司，美國）、丙酸睪丸素（testosterone propionate，TP）（北京 Solarbio公司，中國）、氯喹（chloroquine，CQ）（Sigma 公司，美國）、甘草甜素（glycyrrhizin，Gly）（東京化成工業(yè)株式會社，日本）、全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物，中國）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇凱基生物，中國）、5X 蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）、兔抗LC-3b（Sigma公司，美國）、兔抗 P62（Proteintech 公司，美國）、兔抗 Beclin-1（Proteintech 公司，美國）、兔抗HMGB-1（Abcam 公司，英國）、鼠抗 β-actin（北京中杉金橋公司，中國）、HRP 標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋公司，中國）、ECL 檢測試劑盒（江蘇凱基生物，中國）、HE 染料（北京中杉金橋公司，中國）、電鏡固定液（Servicebio 公司，武漢）、環(huán)氧樹脂（Sigma 公司，美國）。

1.3 動物模型建立

72 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，分別為Control 組、TP 組、HMGB-1 組，TP+HMGB-1 組、TP+CQ 組、TP+Gly 組，每組 12 只。TP 組：大鼠背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］；HMGB-1 組：大鼠麻醉（10%水合氯醛，3 mL·kg-1）后仰臥位固定，取下腹壁正中切口，逐層分離至腹腔，于膀胱下尋找到前列腺，行前列腺多點(diǎn)注射HMGB-1（200 ng），腹腔注射 1 次青霉素鈉（20 萬單位）預(yù)防感染；TP+HMGB-1 組：大鼠前列腺多點(diǎn)注射HMGB-1（200 ng）并行背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］；TP+CQ 組：大鼠背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］，腹腔注射 CQ［50 mg·（kg·d）-1］；TP+Gly 組：大鼠背部皮下 TP［3 mg·（kg·d）-1］，腹腔注射 Gly［10 mg·（kg·d）-1］；Control 組：大鼠開腹后行前列腺多點(diǎn)注射生理鹽水，背部皮下注射橄欖油。

1.4 收集標(biāo)本與計算前列腺指數(shù)

各組大鼠處理21 d 后，在麻醉狀態(tài)下迅速摘取前列腺組織；隨機(jī)取4 只，均分兩半后用于電鏡和HE 染色；8 只測量前列腺體積、濕重用于計算前列腺指數(shù)［大鼠前列腺濕重/大鼠體質(zhì)量×100%］后，組織凍存于-80 ℃冰箱用于Western blot 蛋白檢測。

1.5 形態(tài)學(xué)檢測

1.5.1 HE 染色 取前列腺組織在預(yù)冷的生理鹽水中沖洗干凈后，于4%多聚甲醛中固定24 h 取出，置于包埋盒中脫水過夜，次日浸蠟后包埋，冷凝后切片，二甲苯脫蠟，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅染色2 min，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，采圖。

1.5.2 透射電鏡 切取適當(dāng)大小的前列腺組織在預(yù)冷的生理鹽水中沖洗干凈后放入2%戊二醛4 ℃固定30～40 min，修剪組織呈長方體狀，切一角做標(biāo)記，修剪后的組織取出后放入新的固定液中4 ℃固定2 h，用緩沖液漂洗3 次后置于4 ℃冰箱待用；1%四氧化鋨4 ℃染色后磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗 3 次，每次 15 min；于 4 ℃冰箱中丙酮梯度脫水；脫水完成后，室溫進(jìn)行純丙酮加環(huán)氧樹脂1∶1 過夜，純環(huán)氧樹脂4 h 兩次，于包埋板中擺放樣品包埋；包埋后樹脂固化，超薄切片，檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察。

1.6 Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

準(zhǔn)備好蛋白樣品，BCA 法蛋白定量后，10%SDS-PAGE 凝膠電泳，切下目的條帶后80 V 轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶4 ℃冰箱封閉過夜PBST 洗膜，隨后加入目的一抗（LC-3b 為 1∶500，P62 為1 ∶2000，Beclin1 為 1 ∶2000，HMGB-1 為 1 ∶1000，β-Actin 為 1∶5000），一抗室溫下孵育 2～4 h 后加入目的二抗（2.5%脫脂牛奶配制1∶5000）室溫孵育2 h 后，配化學(xué)發(fā)光液ECL 顯色，拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BPH 大鼠不同處理后前列腺體積、濕重以及指數(shù)的比較

與Control 組比較，其他各組大鼠前列腺濕重和指數(shù)均有所增加（P 均＜0.05）；TP+HMGB-1組各項指標(biāo)均高于TP 組，HMGB-1 組、TP+CQ組和 TP+Gly 組各指標(biāo)均低于 TP 組（P 均＜0.05）；HMGB-1、TP+CQ 和 TP+Gly 組各指標(biāo)之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05），見表 1。

2.2 BPH 大鼠不同處理后前列腺組織HE 染色結(jié)果

Control 組大鼠前列腺腺體排列整齊，管腔大小較均勻，腺上皮細(xì)胞絕大多數(shù)呈單層柱狀、基底膜較完整，間質(zhì)細(xì)胞未見增生及炎細(xì)胞浸潤；TP 組前列腺腺體大小不一，多數(shù)腺體區(qū)域腺上皮呈多層高柱狀增生、部分呈乳頭樣增生，部分間質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)增生，可見炎細(xì)胞浸潤；HMGB-1 組前列腺腺體大小基本一致，腺上皮多層高柱狀增生；TP+HMGB-1 組腺體增生更加明顯，多數(shù)呈復(fù)層乳頭狀增生，細(xì)胞間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生明顯伴大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)區(qū)域血管擴(kuò)張充血明顯；TP+CQ 組和TP+Gly 組較TP 組前列腺上皮增生情況明顯緩解，部分腺上皮細(xì)胞呈復(fù)層高柱狀增生，僅見少量炎細(xì)胞浸潤，見圖1。

表 1 BPH 大鼠不同處理后體質(zhì)量、前列腺體積、濕重及指數(shù)的比較（）

表 1 BPH 大鼠不同處理后體質(zhì)量、前列腺體積、濕重及指數(shù)的比較（）

與 Control 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 TP 組比較 #P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 體質(zhì)量/g 前列腺體積/mL 前列腺濕重/g 前列腺指數(shù)Control 組 8 359±16 0.46±0.09 0.55±0.08 1.53±0.25 TP 組 8 349±8 1.16±0.21** 1.11±0.03** 3.18±0.12**HMGB-1 組 8 372±29 0.80±0.11*# 0.72±0.06*## 2.01±0.22*##TP+HMGB-1 組 8 328±15 1.66±0.49**# 1.26±0.17**# 3.74±0.40**#TP+CQ 組 8 312±19 0.73±0.05# 0.71±0.12*## 2.28±0.31*##TP+Gly 組 8 326±14 0.74±0.15# 0.74±0.13*## 2.23±0.39*##

2.3 透射電鏡觀察不同處理的BPH 大鼠前列腺組織自噬小體形成情況

Control 組前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)很少見到自噬小體；TP 組和HMGB-1 組細(xì)胞內(nèi)有較多自噬小體，且有疑似自噬小體的結(jié)構(gòu)；TP+HMGB-1 組較TP 組和HMGB-1 組可見更多的自噬小體；TP+CQ 和TP+Gly 組仍可見到自噬小體，見圖2。

2.4 BPH 大鼠不同處理后前列腺組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

與 Control 組比較，TP、HMGB-1 和 TP+HMGB-1 組前列腺組織 LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1、Beclin-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，P62 蛋白表達(dá)下調(diào)（P 均＜0.05），TP+HMGB-1 組較 TP 和 HMGB-1 組 LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.05）；TP 組與HMGB-1 組相比各指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）；與 TP 組、HMGB-1組和TP+HMGB-1 組相比，TP+CQ 組和 TP+Gly組LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，P62 蛋白表達(dá)上調(diào)（P 均＜0.05），見圖 3。

3 討論

圖 1 BPH 大鼠不同處理后前列腺組織HE 染色結(jié)果（×200）

圖 2 不同處理的BPH 大鼠前列腺組織透射電鏡結(jié)果（×25000）

圖3 BPH 大鼠不同處理后前列腺組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

BPH 是引起中老年男性排尿障礙原因中最常見的一種疾病[12]，通常發(fā)生在40 歲以后，50 歲男性的發(fā)病率約為40%，80 歲時高達(dá)80%，嚴(yán)重影響了中老年男性健康[13]。前列腺是終生依賴雄激素的器官，體內(nèi)睪酮經(jīng)5-α 還原酶作用，在前列腺間質(zhì)部位轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮，通過旁分泌的形式，與前列腺細(xì)胞的雄激素受體（androgen receptor，AR）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡從而促BPH 發(fā)生[11]。作為BPH 最主要的治療藥物，5-α 還原酶抑制劑起效緩慢，提示雄激素促BPH 發(fā)生的機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。近年來，自噬信號通路的激活在BPH 進(jìn)展中的作用備受關(guān)注[14]。雄激素參與細(xì)胞自噬水平的調(diào)控，AR 可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬核心基因和溶酶體基因上調(diào)自噬水平促前列腺癌的發(fā)展[15]。本課題組前期研究[16]表明，HMGB-1 參與了 BPH 的發(fā)生。BPH 患者前列腺組織中HMGB-1 的表達(dá)水平與其前列腺體積呈正相關(guān)；HMGB-1 可通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞自噬的發(fā)生[17-18]。以上現(xiàn)象提示，雄激素可能通過激活自噬促BPH 的發(fā)生，HMGB-1 可能參與了雄激素介導(dǎo)前列腺細(xì)胞自噬水平的變化。

本研究首先建立雄激素致大鼠BPH 動物模型。實(shí)驗觀察到TP 組大鼠前列腺組織明顯增生、自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)及自噬小體數(shù)量增加；聯(lián)合給予自噬抑制劑（TP+CQ）可致前列腺細(xì)胞自噬水平下調(diào)、組織增生程度減輕，提示雄激素可能通過激活細(xì)胞自噬促前列腺組織增生的發(fā)生。實(shí)驗同時觀察到，TP 組大鼠前列腺組織HMGB-1 表達(dá)水平增加、炎細(xì)胞浸潤；HMGB-1 是晚期炎癥因子，也是重要的自噬調(diào)控因子，提示表達(dá)增多的HMGB-1 可能參與了雄激素促前列腺細(xì)胞自噬水平上調(diào)的過程。為了驗證HMGB-1 在雄激素介導(dǎo)細(xì)胞自噬致大鼠前列腺增生中的作用，本研究首先給予大鼠前列腺多點(diǎn)注射HMGB-1，同樣觀察到前列腺組織增生、細(xì)胞自噬水平增加；其次，聯(lián)合給予TP+HMGB-1 致大鼠前列腺組織進(jìn)一步增生、細(xì)胞自噬水平進(jìn)一步增加；最后，聯(lián)合給予HMGB-1 抑制劑（TP+Gly），觀察到與TP+CQ 組類似的抑制細(xì)胞自噬及組織增生的實(shí)驗結(jié)果，提示TP 通過HMGB-1 介導(dǎo)前列腺細(xì)胞自噬、促組織增生的發(fā)生，而兩者可能具有協(xié)同促前列腺細(xì)胞自噬及組織增生的作用。

綜上所述，雄激素可以通過上調(diào)HMGB-1促細(xì)胞自噬致大鼠前列腺組織增生。在大鼠BPH發(fā)生的過程中，雄激素如何上調(diào)HMGB-1 及其二者如何協(xié)同發(fā)揮促前列腺組織增生的作用等均有待進(jìn)一步探討。