鄰氨基苯甲酸抑制TRPM2 通道對腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能及小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

仇莽莽 ， 焦 巖 ， 王芳姣 ， 張 燕 ， 鄭樂怡 ， 馬 康 ， 梁雪云 ，文玉軍 ， 余建強(qiáng) ， 何仲義 ， 牛建國 ，

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞研究所，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏特色中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，銀川 750004）

腦缺血是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一[1]，通常由腦內(nèi)動脈栓塞造成局部供血障礙引起，可導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死或凋亡等[2-3]。恢復(fù)缺血區(qū)的血液再灌注是腦缺血的最佳治療方法，而缺血后血流的再通可導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷[4]。探索有效預(yù)防腦缺血再灌注損傷的治療方法仍是目前臨床亟待解決的問題。腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)是其主要病理過程之一，減輕腦缺血再灌注后繼發(fā)性炎性反應(yīng)受到人們的廣泛關(guān)注[5]。當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過過度釋放炎癥因子、蛋白及其他生物活性分子介導(dǎo)炎性反應(yīng)，引起繼發(fā)性腦損傷[6]。瞬時(shí)受體電位通道M2（transient receptor potential cation channel subfamily member2，TRPM2）是一種非選擇性的可通透鈣離子的陽離子通道[7]，研究[8-10]表明，TRPM2可能與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌有關(guān)。N-（對戊基肉桂酰基）鄰氨基苯甲酸［N-（pamylcinnamoyl）anthranilic acid，ACA］為 TRPM2非選擇性離子通道抑制劑[11]，可電壓非依賴性地抑制TRPM2 通道。目前抑制TRPM2 通道對腦缺血再灌注損傷影響的研究較少。本研究擬利用小鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討ACA 抑制TRPM2對腦缺血再灌注損傷的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級 C57BL/6N 雄性小鼠 48 只，體質(zhì)量 18～22 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［合格證號SCXK（京）2016-0006］。小鼠放置在安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑及儀器

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）購自美國 Sigma 公司，TRPM2 通道抑制劑ACA 購自中國MCE（MedChem－Express），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自北京索萊寶科技有限公司，HE、Nissl染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，山羊抗離子鈣結(jié)合銜接分子 1（Iba1）多克隆抗體（ab48004）、小鼠抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）單克隆抗體［EPR16635］-Chimeric（ab210823）均購自美國 Abcam 公司，Cy3AffiniPureDonkeyAnti-Goat－IgG（H+L）、Cy5AffiniPureDonkeyAnti-MouseIgG（H+L）均購自美國Jackson 公司，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自中國博士德生化科技有限公司。激光散斑血流成像儀購自瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)公司，線栓購自中國北京西濃科技有限公司，體式顯微鏡購自中國深圳市瑞沃德生命科技有限公司，全波長酶標(biāo)儀購自美國熱電公司，冰凍切片機(jī)購自德國萊卡公司。

1.3 動物分組

48 只雄性C57BL 小鼠隨機(jī)分為3 組。假手術(shù)組（Sham）：麻醉小鼠后，游離左側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）及頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）后，逐層縫合。大腦中動脈栓塞再灌注組（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）：建立 MCAO/R 模型；ACA 組：建立MCAO/R 模型后，腹腔注射ACA。每組16 只。

1.4 方法

1.4.1 小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立 采用3.5%的水合氯醛麻醉小鼠后，分離CCA，沿CCA 向遠(yuǎn)心端游離ECA、ICA，活結(jié)結(jié)扎CCA。在ECA（遠(yuǎn)離CCA 處）與ICA 交叉處剪小口，將線栓從小口處插入至CCA 近心端，將線栓反轉(zhuǎn)180°與 CCA 平行，接著將線栓插入 ICA 約 1 cm 至有阻力時(shí)將線栓固定后剪斷多余線栓。逐層縫合后，將小鼠放在37 ℃恒溫毯上至其蘇醒。1 h 后拔出線栓，小鼠MCAO/R 模型完成。

1.4.2 Bederson 評分評估小鼠神經(jīng)功能 腦缺血再灌注損傷模型建立1 h 及24 h 后，采用Bederson 評分評估各組小鼠神經(jīng)功能。0 分：無神經(jīng)功能缺損；1 分：優(yōu)先向一側(cè)轉(zhuǎn)彎；2 分：環(huán)形轉(zhuǎn)圈；3 分：偏向一側(cè)縱向傾倒；4 分：小鼠無運(yùn)動；5分：小鼠死亡。本實(shí)驗(yàn)采用雙盲進(jìn)行評分。將MCAO/R1 h 后Bederson 評分為2 分的模型納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 給藥方法 ACA 組于小鼠腦缺血后約2 h腹腔注射 ACA（25 mg·kg-1）。ACA 用 0.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）新鮮配制。MCAO/R 組腹腔注射0.5%的DMSO。

1.4.4 小鼠大腦皮質(zhì)腦血流測定 在MCAO/R模型建立24 h 后，麻醉小鼠，剔去小鼠顱腦頂骨部鼠毛，切開皮膚，完全暴露骨膜，并在骨膜上滴加少量生理鹽水，將激光散斑血流成像儀掃描器調(diào)至小鼠腦正上方處，監(jiān)測大腦皮質(zhì)腦血流變化，記錄并分析數(shù)據(jù)。局部腦血流減少率=（ROI1－ROI2）/ROI1×100%（ROI1 表示右側(cè)腦血流量；ROI2 表示左側(cè)腦血流量）。

1.4.5 TTC 染色檢測小鼠腦梗死率 在MCAO/R模型建立24 h 后，將各組小鼠斷頭迅速取出新鮮大腦。用生理鹽水沖洗，放入預(yù)冷的腦槽中，在-20 ℃冰箱速凍5～8 min，將小鼠大腦冠狀切成厚度為2 mm 的腦片5 片，按順序放入已加入TTC 的反應(yīng)槽中，在37 ℃孵育箱中孵育12 min，棄掉TTC 溶液，加入4%多聚甲醛溶液，4 ℃過夜，后將腦片按順序擺放在刻度板上拍照。用Image-Proplus 軟件測梗死面積（A）和腦片的總面積（B），腦梗死率=（A1+A2+…+An）/（B1+B2+…+Bn）×100%（公式為最簡式，以抵消分子分母所乘的厚度 2 mm）。

1.4.6 腦組織灌注、固定、脫水及切片 在MCAO/R 模型建立24 h 后將各組小鼠麻醉，依次使用預(yù)冷的0.9%的氯化鈉溶液及4%多聚甲醛溶液灌注，斷頭取出完整大腦后放置于預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過夜。將腦組織依次轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液及30%蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水。冠狀冰凍切片，厚度為20 μm。

1.4.7 HE 染色觀察小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化 將冰凍切片在室溫條件下復(fù)溫15 min，4%多聚甲醛中固定5 min，流水沖洗 3 min；蘇木素室溫浸染 20 min，自來水流水沖洗10 min；分化液分化5 s，流水沖洗2 min；返藍(lán)液返藍(lán)2 min，流水沖洗3 min；伊紅染色10 min，流水沖洗7 min；95%乙醇Ⅰ3 s，95%乙醇Ⅱ3 s，100%乙醇Ⅰ3 s；100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各1 min；透明后用中性樹脂封片，室溫晾干后正置顯微鏡拍片。

在中國大陸情境下，國家既直接影響社會工作職業(yè)自主性，也通過其他三個(gè)層面，即職業(yè)、組織、服務(wù)使用者的影響間接影響社會工作職業(yè)自主性。即在目前語境下，當(dāng)一線社工面臨國家這一層面限制自主性的時(shí)候，如何訴諸于職業(yè)、組織、服務(wù)使用者，獲得一種“推力”，以此獲得自身發(fā)展的獨(dú)立和自主。作為從事一線服務(wù)的社工而言，本身是有自身的能動性，他們對這種復(fù)雜情境的反思就是一線社工建構(gòu)職業(yè)自主性的實(shí)踐策略。

1.4.8 Nissl 染色觀察小鼠腦組織神經(jīng)元丟失情況 將冰凍切片室溫復(fù)溫30 min，用PBS 洗3次，每次 5 min，轉(zhuǎn)入試劑 A（Cresyl violet Stain）染液中，56 ℃浸染 1 h，過水 3 次，每次 2～3 s，后放入試劑 B（Nissl Differentiation）中，孵化 3 min（至低倍鏡下透亮，肉眼白底淡紫色），100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各1 min，二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ中10 min，用中性樹脂封片，室溫晾干后正置顯微鏡拍片。

1.4.9 免疫熒光染色檢測小鼠腦組織Iba1 與i-NOS 表達(dá) 將冰凍切片室溫復(fù)溫15 min，TBS 洗3 次，5 min/次。用 5%BSA 封閉 2 h，分別加入山羊抗 Iba1 多克隆抗體（1∶200）和小鼠抗 iNOS 單克隆抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，TBS 洗 3 次后，分別加入 Cy3 標(biāo)記驢抗山羊 IgG（H+L）（1∶500）或 Cy5 標(biāo)記驢抗小鼠 IgG（H+L）（1∶500），室溫孵育 3 h，TBS 洗 3 次，10 min/次，用含 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，用圖像分析軟件Imagine J 分析平均熒光強(qiáng)度。每組取6 只小鼠樣本同一區(qū)域進(jìn)行拍照，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度值，比較組間差異。

1.4.10 ELISA 檢測小鼠血清 TNF-α 含量 在MCAO/R 模型建立24 h 后，采用眼眶取血的方法采集各組小鼠血液樣本，靜置后離心取上層血清。采用ELISA 試劑盒檢測TNF-α 含量，具體操作參照說明書方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACA 促進(jìn)MCAO/R 小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)

與 Sham 組（0.00±0.00）分相比，在腦缺血再灌注損傷 24 h 后，MCAO/R 組小鼠 Bederson 評分［（2.00±0.00）分］升高（P＜0.05）；在給予 ACA治療后，ACA 組小鼠 Bederson 評分［（0.83±0.58）分］較 MCAO/R 組降低（P＜0.05）。

2.2 ACA 改善了MCAO/R 小鼠大腦皮質(zhì)腦血流的灌注量

在腦缺血再灌注損傷24 h 后，激光散斑血流成像結(jié)果顯示，MCAO/R 組小鼠的缺血側(cè)腦血流量減少率［（49.10±4.47）%］較 Sham 組［（2.50±0.42）%］升高（P＜0.05），給予 ACA 治療后，與MCAO/R 組比較，ACA 組小鼠的腦血流量減少率［（24.13±1.49）%］下降（P＜0.05），見圖 1。

2.3 ACA 可減少M(fèi)CAO/R 小鼠腦梗死率

TTC 染色結(jié)果顯示，大腦正常組織被染為紅色，腦梗死部分未著色。與Sham 組［（0.00±0.00）%］梗死率相比，MCAO/R 組小鼠腦梗死率［（33.14±6.86）%］增加（P＜0.05）；與 MCAO/R 組相比，ACA 組腦梗死率［（7.78±3.51）%］降低（P＜0.05），見圖 2。

2.4 ACA 可減輕MCAO/R 小鼠大腦缺血側(cè)顳側(cè)皮質(zhì)、海馬CA1、CA3 及缺血半暗帶區(qū)損傷

圖1 ACA 對MCAO/R 小鼠缺血側(cè)腦血流的影響

圖2 ACA 對MCAO/R 小鼠缺血側(cè)腦梗死率的影響

2.5 ACA 可改善MCAO/R 小鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元的丟失

各組腦冠狀切片Nissl 染色結(jié)果顯示，與Sham 組相比，MCAO/R 組小鼠大腦顳側(cè)皮質(zhì)、海馬CA1、CA3 區(qū)及缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，殘留細(xì)胞大多表現(xiàn)為核固縮，深染，細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)。與MCAO/R 組比較，ACA 組各區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量增加，見圖4。

2.6 ACA 可減少M(fèi)CAO/R 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

腦缺血再灌注損傷24 h 后，免疫熒光染色方法觀察Iba-1 表達(dá)水平，選取缺血半暗帶區(qū)域觀察，Sham 組陽性細(xì)胞胞體較小，突起細(xì)小，而MCAO 組陽性細(xì)胞胞體明顯變大，突起變粗。結(jié)果顯示，MCAO/R 組小鼠 Iba-1 免疫熒光強(qiáng)度（98.34±8.71）較 Sham 組免疫熒光強(qiáng)度（35.59±10.54）升高（P＜0.05），與 MCAO/R 組相比，給予ACA 治療后小鼠Iba-1 免疫熒光強(qiáng)度（86.02±8.32）減少（P＜0.05），見圖 5。

2.7 ACA 可減少M(fèi)CAO/R 小鼠損傷區(qū)iNOS 表達(dá)

對腦缺血再灌注損傷24 h 后腦片進(jìn)行免疫熒光iNOS 染色，選取缺血半暗帶區(qū)域觀察ACA對MCAO/R 小鼠iNOS 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，MCAO/R 組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)域iNOS 免疫熒光強(qiáng)度（75.73±6.94）較 Sham 組免疫熒光強(qiáng)度（30.77±1.91）升高（P＜0.05），而給予 ACA 治療后免疫熒光強(qiáng)度（37.86±5.98）減少（P＜0.05），見圖 6。

2.8 ACA 可下調(diào) MCAO/R 小鼠血清 TNF-α 水平

ELISA 結(jié)果顯示，MCAO/R 組小鼠血清TNF-α 水平［（9.99±1.03）pg·mL-1］較 Sham 組［（1.59±0.20）pg·mL-1］升高（P＜0.05），與 MCAO/R 相比，給予 ACA 治療后血清 TNF-α 水平［（5.26±4.00） pg·mL-1］降低（P＜0.05）。

圖3 ACA 對MCAO/R 小鼠缺血側(cè)不同區(qū)域形態(tài)學(xué)的影響（↑：嗜酸性粒細(xì)胞；bar=50 μm）

圖4 ACA 對MCAO/R 小鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元的影響（bar=50 μm）

圖5 ACA 對MCAO/R 小鼠腦缺血側(cè)Iba-1 表達(dá)的影響

圖6 ACA 對MCAO/R 小鼠缺血側(cè)iNOS 表達(dá)的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立MCAO/R 模型[12]，TTC 染色顯示，MCAO/R 模型均出現(xiàn)一致的白色梗死區(qū)域，同時(shí)，模型建立后，激光散斑血流成像結(jié)果顯示，MCAO/R 模型小鼠缺血側(cè)腦血流降低，HE 染色顯示腦組織形態(tài)學(xué)的損傷，Nissl 染色呈現(xiàn)出神經(jīng)元的丟失，結(jié)果均證明本實(shí)驗(yàn)中腦缺血再灌注模型建立成功。

TRPM2 作為一種活性氧的感受器，參與了一系列的生理病理過程[13]。ACA 可以從胞外以電壓非依賴、濃度依賴的方式抑制TRPM2 通道[14]。本文觀察了ACA 對腦缺血再灌注小鼠的行為學(xué)影響，結(jié)果顯示，ACA 促進(jìn)了腦缺血再灌注損傷后小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。同時(shí)，激光散斑血流成像結(jié)果顯示，ACA 干預(yù)24 h 后，小鼠缺血側(cè)腦血流量增加；TTC 染色結(jié)果顯示，ACA 組小鼠腦梗死率較MCAO/R 組下降；HE 及 Nissl 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACA 組缺血側(cè)顳側(cè)皮質(zhì)區(qū)、海馬CA1、CA3及缺血半暗帶區(qū)組織結(jié)構(gòu)改善，炎性細(xì)胞減少，神經(jīng)元數(shù)目增加。上述結(jié)果均證明ACA 對小鼠腦缺血再灌注損傷具有改善作用。

當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過過度釋放炎癥因子、蛋白及其他生物活性分子而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，引起繼發(fā)性腦損傷[15-16]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化已被認(rèn)為是減輕腦缺血再灌注損傷的治療方向[17-19]。小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）的水平控制著多種細(xì)胞過程，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及促炎因子和抗炎因子的分泌[20-21]。TRPM2 可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)[13]，有研究[8]報(bào)道，在短暫性大腦中動脈梗塞損傷模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPM2mRNA表達(dá)上調(diào)；過氧化氫和二磷酸腺苷核糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流和TRPM2 陽離子電流升高[9]。以上發(fā)現(xiàn)均表明，TRPM2 與小膠質(zhì)細(xì)胞的功能密切相關(guān)。Iba-1 為小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白，常被作為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物。當(dāng)腦缺血再灌注后，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變大、突起變粗，Iba-1的表達(dá)量上調(diào)，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化[18]。使用ACA后，小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度受到了抑制。因此推斷，抑制TRPM2 可能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

炎性反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的主要病理過程之一，因此如何減輕腦缺血再灌注后繼發(fā)性炎性反應(yīng)受到廣泛關(guān)注。有研究[10]顯示，TRPM2可促進(jìn)多種促炎介質(zhì)如TNF-α 和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌增加。腦缺血后外周免疫細(xì)胞中TRPM2 被激活，可促進(jìn)炎性反應(yīng)，加重缺血性腦損傷[22]。Wehrhahn 等[23]報(bào)道，暴露于脂多糖的單核細(xì)胞中TRPM2 的表達(dá)增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-8 和TNF-α，加重炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)探討了ACA 對MCAO/R 小鼠的炎癥相關(guān)因子iNOS 及TNF-α 表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，ACA 治療后可降低缺血再灌注損傷后腦組織中iNOS 表達(dá)及血清TNF-α 水平。

綜上所述，小鼠腦缺血再灌注后，ACA 抑制TRPM2 通道對腦缺血再灌注損傷小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與ACA 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化并降低炎性因子的分泌有關(guān)。ACA 抑制TRPM2通道如何介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并介導(dǎo)炎癥通路，還需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果初步表明TRPM2可能成為腦缺血再灌注損傷治療的潛在靶點(diǎn)之一。