基于“以方測證”的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)寒濕痹證 動物模型的構(gòu)建研究

林也 戴宗順 張婷 張逢 胡勝濤 張二兵 宋厚盼 陳聰 蔡雄 廖菁

〔摘要〕 目的 基于以方測證理論建立與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）病變特征、發(fā)病機(jī)制相符的中醫(yī)“痹證”動物模型。方法 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、風(fēng)寒濕痹證模型組、風(fēng)寒濕痹證模型+烏頭湯組（烏頭湯組）、風(fēng)寒濕痹證模型+四妙丸組（四妙丸組），每組10只大鼠?？瞻捉M大鼠無任何干預(yù)措施，余各組大鼠均先予以風(fēng)寒濕環(huán)境刺激14 d，再誘導(dǎo)建立佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠模型，同時(shí)烏頭湯組與四妙丸組分別給予烏頭湯和四妙丸灌胃治療，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。記錄各組大鼠發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率;動態(tài)檢測大鼠足腫脹體積和評價(jià)關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分;HE染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化;CT檢測大鼠骨關(guān)節(jié)破環(huán)情況。結(jié)果 與風(fēng)寒濕痹證模型組比較，烏頭湯明顯延遲大鼠發(fā)病時(shí)間并降低其發(fā)病率，顯著減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹率及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，明顯抑制滑膜組織增生及骨破壞程度（P<0.01），而四妙丸組大鼠病變程度與風(fēng)寒濕痹證模型組無明顯差別（P>0.05）。結(jié)論 基于以方測證思路，成功復(fù)制了與RA病變特征和發(fā)病機(jī)制相符的RA風(fēng)寒濕痹病證結(jié)合大鼠模型，為系統(tǒng)深入研究治療RA方證對應(yīng)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;風(fēng)濕痹證;方證對應(yīng);佐劑性關(guān)節(jié)炎;烏頭湯;四妙丸

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.003

Construction of Animal Model of Rheumatoid Arthritis with Wind Cold Dampness Arthralgia Syndrome Based on the Theory of "Testing Syndrome by Formula"

LIN Ye1， DAI Zongshun2， ZHANG Ting1， ZHANG Feng1， HU Shengtao1， ZHANG Erbing1， SONG Houpan2，

CHEN Cong2， CAI Xiong1*， LIAO Jing2*

（1. Institute of Innovation and Applied Research in Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha，

Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Translational Research in TCM Formulas and Zheng，

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To establish an animal model of "arthralgia syndrome" in traditional Chinese medicine （TCM） based on the theory of testing syndrome by formula， which was consistent with the pathological characteristics and pathogenesis of rheumatoid arthritis （RA）. Methods 40 male Sprague-Dawely （SD） rats were randomly assigned into the blank group， the wind cold dampness arthralgia syndrome model group， wind cold dampness arthralgia syndrome model+Wutou Decoction group， wind cold dampness arthralgia syndrome model+Simiao Pill group， with 10 rats in each group. There was no intervention in the blank group， the rats in other groups were stimulated by wind， cold and wet environment for 14 days， and then induced to establish adjuvant arthritis （AIA） rat model. At the same time， the wind cold dampness arthralgia syndrome model+Wutou Decoction group， wind cold dampness arthralgia syndrome model+Simiao Pill group were given Wutou Decoction and Simiao Pill by gavage until the end of the experiment. The onset time and incidence rate of rats were recorded. Foot swelling volume and arthritis index score were measured dynamically. HE staining was used to observe the pathological changes of the ankle joint in rats. CT was used to detect the fracture of bone and joint in rats. Results Compared with the wind cold dampness arthralgia syndrome model group， Wutou Decoction significantly delayed the onset time of rats and reduce the incidence of a disease， significantly reduce index score， joint swelling rate and arthritis of rats significantly inhibit the synovial tissue and bone damage （P<0.01）， and the lesion degree of wind cold dampness arthralgia syndrome model+Simiao Pill group and the wind cold dampness arthralgia syndrome model group was no significant difference （P>0.05）. Conclusion Based onthe theory of testing syndrome by formula， we successfully reproduce the characteristics and pathogenesis of RA and pathological changes of RA wind cold dampness arthralgia syndrome in the rat model of combined disease for system in-depth study in the treatment of RA certificate corresponding to molecular mechanism laid a foundation.

〔Keywords〕 rheumatoid arthritis; wind cold dampness arthralgia syndrome; correspondence of formula-Zheng; adjuvant-induced arthritis; Wutou Decoction; Simiao Pill

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)反復(fù)發(fā)炎，纏綿難愈，滑膜細(xì)胞“類腫瘤生長”，有不死的癌癥之稱，為臨床難治性疾病之一[1-3]。流行病學(xué)研究[4-5]表明，全球發(fā)病率為0.5%～1%，我國患病率為0.28%～0.36%，其5年致殘率高達(dá)30%～50%。目前，RA臨床治療常用藥物主要有5類，包括非甾體抗炎藥、緩解病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑及中藥制劑治療[6]。盡管RA的有效治療藥物已從非甾體抗炎藥逐步發(fā)展到現(xiàn)代生物制劑，甚至基因治療，但這些藥物均存在非特異靶向性，毒副作用大，常伴隨免疫功能受損，潛在地威脅生命健康，至今仍缺乏理想的治療藥物與方法[7]。

中醫(yī)藥治療自身免疫疾病具有一定的特色和優(yōu)勢，其多組分、多途徑、多靶點(diǎn)整合效應(yīng)能長效控制病情進(jìn)展[8]。辨證論治是中醫(yī)學(xué)治療疾病的特色與精華。動物模型是研究人類疾病的重要途徑之一。因此，基于中醫(yī)學(xué)理論，理解中醫(yī)“辨證論治”的精髓所在，創(chuàng)建“證候”動物模型是突破中醫(yī)藥重大前沿科學(xué)問題的關(guān)鍵難題之一[9-10]。RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”中最為常見的臨床疾患之一，與中醫(yī)古籍所記載的“歷節(jié)”“鶴膝風(fēng)”“尪痹”等病證相似[11-12]?！端貑枴け哉摗分小帮L(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也”是中醫(yī)論治“痹證”的理論基礎(chǔ)，課題組前期研究[13]通過給予大鼠風(fēng)寒濕刺激再注射含熱滅活結(jié)核桿菌的完全弗氏佐劑（completefreund adjuvant， CFA）的方法，明確了風(fēng)寒濕對佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis， AIA）大鼠發(fā)生發(fā)展的影響。本實(shí)驗(yàn)基于前期研究基礎(chǔ)，運(yùn)用“以方測證”思路，擬構(gòu)建具有中醫(yī)特色的RA風(fēng)濕寒痹證病證結(jié)合動物模型，旨在為RA的基礎(chǔ)與臨床研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（80±10） g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SYXK（湘）2019-0009，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h∶12 h晝夜交替。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

熱滅活結(jié)核桿菌H37Ra（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）（美國BD公司，批號6183641）;礦物油（美國Sigma Aldrich公司，批號M8410）;二甲苯、無水乙醇、異丁醇、正丁醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;EDTA脫鈣液（北京索萊寶科技有限公司，批號20181225）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

自動煎藥機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司，型號YJD13-GL/YJD20C-GL/YJD30-GL）;電子天平（日本島津公司，型號ATY224）;足腫測定儀（意大利UGO公司，型號Basile 37140）;玻璃微量注射器（瑞士Hamilton公司，型號250 μL）;人工氣候造模箱（上海汗諾公司，型號PRX-150B）;動物永久標(biāo)記儀（AIMS公司）;高分辨率小動物微型CT（美國PerkinElmerCaliper LS公司，型號Quantum FX Demo）;動物氣體麻醉機(jī)（美國Smith公司，型號SurgiVet CDS9000）。

2 方法

2.1? 實(shí)驗(yàn)藥物

按比例取烏頭湯（制川烏6 g，黃芪9 g，麻黃9 g，白芍9 g，甘草9 g），藥材飲片按原方比例混合，蒸餾水浸泡30 min后，于自動煎藥機(jī)中煎煮1.5 h，濾出藥液，以相同體積的蒸餾水重復(fù)煎煮1次，合并兩次藥液，減壓濃縮為浸膏，按照大鼠與人的劑量換算比例計(jì)算，烏頭湯給予4倍臨床等效劑量15 g/kg。四妙丸（黃柏9 g，蒼術(shù)9 g，牛膝9 g，薏苡仁9 g）制備方法同烏頭湯，其給藥劑量為12 g/kg。

2.2? 模型制備及干預(yù)方法

大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為空白組、風(fēng)寒濕痹證模型組（風(fēng)寒濕痹證組）、風(fēng)寒濕痹證模型+四妙丸組（四妙丸組）、風(fēng)寒濕痹證模型+烏頭湯組（烏頭湯組），每組10只大鼠。除空白組大鼠正常飼養(yǎng)外，余所有大鼠于實(shí)驗(yàn)第1天開始置于改良的智能人工氣候箱給予風(fēng)寒濕刺激（風(fēng)速5 m/s，溫度 0～2 ℃，濕度90%～95%），每天1次，每次4 h，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。并在實(shí)驗(yàn)第15天，于大鼠尾根部皮下注射0.1 mL含200 μg Mtb的CFA誘導(dǎo)AIA，同時(shí)烏頭湯組、四妙丸組分別給予相應(yīng)劑量的烏頭湯和四妙丸灌胃治療，直至實(shí)驗(yàn)第45天結(jié)束。

2.3? 觀察指標(biāo)

2.3.1? 大鼠足腫脹體積測量? CFA注射前，在大鼠的踝關(guān)節(jié)處作永久性標(biāo)記，并測量雙后足容積基礎(chǔ)值。參考文獻(xiàn)[14]方法，CFA注射后的第6天開始，每3天進(jìn)行一次足腫脹體積大小測量，動態(tài)記錄大鼠關(guān)節(jié)腫脹度。

2.3.2? 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分? CFA注射后，每天觀察并記錄各組大鼠發(fā)病時(shí)間以及發(fā)生率。參考文獻(xiàn)方法[15]，采用國際通用5級評分法對每只大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。

2.3.3? 大鼠后足CT檢測? 末次給藥后，異氟烷麻醉大鼠，小動物CT掃描大鼠后足，評價(jià)關(guān)節(jié)骨破壞程度。

2.3.4? 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)觀察? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，剪取大鼠雙后足，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，EDTA脫鈣，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（haematoxylin eosin， HE）染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡拍照，觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)改變。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Dunnetts檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1? 大鼠發(fā)病時(shí)間及發(fā)病率情況

與風(fēng)寒濕痹證組比較，烏頭湯組大鼠發(fā)病時(shí)間顯著延遲（P<0.01），同時(shí)其發(fā)病率也明顯降低（P<0.01）;而四妙丸治療后大鼠發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率并沒有得到改善。見圖1。

3.2? 大鼠足腫脹容積及關(guān)節(jié)評分評價(jià)

風(fēng)寒濕痹證組較空白組大鼠足腫脹體積與關(guān)節(jié)炎評分顯著增加（P<0.01）;給予四妙丸治療后，大鼠足趾部炎癥損傷并沒有得到改善，大鼠足腫脹體積與關(guān)節(jié)炎評分和風(fēng)寒濕痹證組接近（P>0.05）;而給予烏頭湯治療后，與風(fēng)寒濕痹證組比較，大鼠足腫脹容積（P<0.05或P<0.01）和關(guān)節(jié)炎評分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見圖2。

3.3? 大鼠關(guān)節(jié)組織病理觀察

空白組大鼠關(guān)節(jié)腔光滑完整，周圍未見炎性細(xì)胞浸潤;風(fēng)寒濕痹證組大鼠關(guān)節(jié)腔腔隙明顯狹窄，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，血管翳生成;給予四妙丸治療后，大鼠關(guān)節(jié)腔隙狹窄未見明顯好轉(zhuǎn);而給予烏頭湯治后，大鼠關(guān)節(jié)腔腔隙增寬，炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯減輕。見圖3。

3.4? 大鼠關(guān)節(jié)骨破壞情況

空白組（圖4A）大鼠足趾關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整;風(fēng)寒濕痹證組（圖4B）大鼠足趾關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形;給予四妙丸治療后（圖4C），大鼠骨破壞情況未見明顯好轉(zhuǎn);而給予烏頭湯治后（圖4D），大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較完整，關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑。見圖4。

4 討論

RA是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”中最為常見的臨床疾患之一，與中醫(yī)古籍所記載的“歷節(jié)”“鶴膝風(fēng)”“尪痹”等病證相似[11-12]。近年來，中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療RA愈來愈受到臨床醫(yī)生的重視，中醫(yī)藥辨證論治、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，不僅可以改善患者癥狀，提高患者生活質(zhì)量，而且可顯著降低化學(xué)藥物引起的毒副作用及耐藥性，具有一定的特色和優(yōu)勢。動物模型是研究人類疾病的重要途徑之一。構(gòu)建符合中醫(yī)證候特點(diǎn)的RA動物模型是現(xiàn)階段中醫(yī)藥研究的重要載體，亦是促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。課題組前期研究[13]，采用改良的智能人工氣候箱，選擇雄性SD大鼠AIA模型，研究風(fēng)寒濕對RA（痹證）發(fā)生發(fā)展的作用。首先對風(fēng)寒濕刺激條件進(jìn)行了優(yōu)選，確定了“風(fēng)速5 m/s、溫度0～2 ℃、相對濕度90%～95%”。風(fēng)寒濕入侵機(jī)體發(fā)生疾病應(yīng)該是一個(gè)長期的過程，可能是長期居住或工作在潮濕、陰冷、氣候易變環(huán)境，從而在具有特定遺傳背景的個(gè)體誘發(fā)了RA。因此，采用給予雄性SD大鼠風(fēng)寒濕刺激14天再誘導(dǎo)建立AIA的方案。本研究在前期研究基礎(chǔ)之上運(yùn)用以方測證的方法，結(jié)合病理學(xué)與放射學(xué)等實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)一步評價(jià)RA風(fēng)寒濕痹證模型建立的成功與否。

烏頭湯素以溫經(jīng)祛寒、除濕止痛之效著稱，首見于張仲景《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》：“病歷節(jié)，不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之”。原方由麻黃、芍藥、黃芪、甘草（灸）各三兩，川烏五枚組成，共奏溫經(jīng)散寒、除濕止痛之效。研究表明，烏頭湯可顯著改善寒濕型RA患者關(guān)節(jié)腫脹、晨僵等癥狀，延緩關(guān)節(jié)骨破壞，改善患者生活質(zhì)量[16-17]。四妙丸是治療濕熱痹證的經(jīng)典方，載于清代張秉成的《成方便讀》，原方由黃柏、薏苡仁、蒼術(shù)、牛膝各八兩，水泛為丸而成。四妙丸可顯著緩解RA患者關(guān)節(jié)癥狀，抑制關(guān)節(jié)炎癥，促進(jìn)關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)，改善實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)，達(dá)到控制病情活動[18]。研究采用烏頭湯作為RA風(fēng)濕寒痹證病證結(jié)合動物模型的“方證對應(yīng)”論證方劑，以四妙丸作為“非方證對應(yīng)”的論證方劑，具備一定的理論和臨床依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果從“以方測證”的角度分析，運(yùn)用烏頭湯治療風(fēng)寒濕痹證模型組后，大鼠發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率明顯降低（P<0.01）;其關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評分顯著減輕（P<0.01），并且其關(guān)節(jié)組織病理表現(xiàn)明顯改善，證明該方有效。另外，運(yùn)用四妙丸治療風(fēng)寒濕痹證模型組后，大鼠足腫脹體積與關(guān)節(jié)炎評分和風(fēng)寒濕痹證組接近（P>0.05），表明無療效，從反證角度認(rèn)為風(fēng)寒濕痹證也是成功的。綜合本文所有結(jié)果，初步認(rèn)為RA風(fēng)濕寒痹病證結(jié)合動物模型的造模是成功的，為后續(xù)中醫(yī)藥治療RA的藥效機(jī)制研究及中藥抗RA新藥的開發(fā)研究提供新的載體。

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