南極磷蝦油提取方法及生理活性研究進(jìn)展

周 莉，張明浩，姚家旭，楊 富

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430074）

南極磷蝦（Euphausia superba）是一種主要以浮游動(dòng)植物為食，生活在南極海域的群居生物，資源充足，在南極海域的生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用[1]。以新鮮南極磷蝦或干燥磷蝦粉為原料，利用合適的提取方法可得到南極磷蝦油[2]。作為一種新型的海洋功能性油脂，南極磷蝦油含有豐富的營養(yǎng)成分，包括磷脂（Phospholipid，PL）、多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）、蝦青素（Astaxanthin，AST）、維生素A（Vitamin A，VA）、生育酚（Tocopherols，TOC）等[3?4]，PUFA中二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），已被證明具有多種生理活性[5]。近年來研究表明，南極磷蝦油對(duì)人體健康有多種益處，包括抗炎、預(yù)防心血管疾病、抗糖尿病、促進(jìn)大腦功能和抗癌作用[2]。充足的資源與其具有的多樣功能特性使得南極磷蝦油極具研究價(jià)值與開發(fā)前景。本文論述了近年來南極磷蝦油的提取方法和生物活性的研究進(jìn)展，并進(jìn)行總結(jié)與展望，以期為南極磷蝦油的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 南極磷蝦油的提取

南極磷蝦或者經(jīng)過初步加工的干制磷蝦粉均可用于磷蝦油的提取，磷蝦捕撈死亡后快速自溶，氟含量升高不利于后續(xù)處理[6]，以冷凍磷蝦或干燥磷蝦粉為原料更適合于南極磷蝦油提取。目前南極磷蝦油的提取方法主要有溶劑法、臨界流體法和酶法，與之對(duì)應(yīng)，圖1 選取3 篇相關(guān)文獻(xiàn)并展示了其中南極磷蝦油活性物質(zhì)的含量[3,7?8]。在溶劑法中，使用極性溶劑乙醇提取磷蝦油具有較高的PL（39.20%）和EPA+DHA（28.66 g/100 g）含量，但AST 含量（149.85 mg/kg）和TOC（28.66 mg/100 g）含量較低，丙酮與之相反[3]；在臨界法中，超臨界CO2與亞臨界正丁烷提取磷蝦油均具有較多AST（262.2、248.4 mg/kg）和EPA+DHA（29.81、29.85 g/100 g），而PL 含量差異顯著（18.1%、28.7%）（P<0.05）[7]；最后，堿性蛋白酶對(duì)比復(fù)合蛋白酶提取磷蝦油具有更高的PL（50.19%）、EPA+DHA（36.91 g/100 g）、AST（520.75 mg/kg）、TOC（39.28 mg/100 g）含量[8]。由此可見，不同提取方式與條件對(duì)南極磷蝦油品質(zhì)存在著較大影響。上述數(shù)據(jù)來源于不同文獻(xiàn)，不能直接比較三種提取方法優(yōu)劣，下文對(duì)三種磷蝦油提取方法進(jìn)行簡要介紹。

圖1 不同提取方法對(duì)磷蝦油組成的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the composition of krill oil

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是提取油脂的經(jīng)典方法，也是文獻(xiàn)報(bào)道中提取南極磷蝦油最常用的方法。南極磷蝦油中具有極性PL，中性甘油三酯和疏水性AST 與TOC[3]，提取溶劑的選擇會(huì)顯著影響南極磷蝦油的產(chǎn)品質(zhì)量。

在單一溶劑提取條件下，極性溶劑，如乙醇和異丙醇的提取物具有較高的脂質(zhì)產(chǎn)量和磷脂含量，但甾醇、蝦青素和維生素含量較低；丙酮提取的脂質(zhì)產(chǎn)量和磷脂含量最低，但微量元素含量較高[3]。乙醇因具有適當(dāng)?shù)臉O性與綠色低毒特性被廣泛應(yīng)用于磷蝦油提取。張曉慧等[9]使用不同比例的乙醇-水混合溶劑實(shí)現(xiàn)了南極磷蝦油的提?。?5%乙醇）、精煉（無水乙醇）和富集（30%乙醇），最終得到磷蝦油中PL 含量為706.1 mg/g，EPA 和DHA 含量分別為23.9%，14.2%。這種一體化生產(chǎn)工藝在磷蝦油工業(yè)化生產(chǎn)上具有重大價(jià)值。

依次以丙酮、正己烷、乙醇為提取溶劑，每次提取15 min，經(jīng)三步提取后從磷蝦粉中提取得到三種磷蝦油。丙酮提取油中，AST、TOC、VA、膽固醇等次要成分較集中；而乙醇提取油的PL 和PUFA 含量最高，但微量組分少；正己烷提取油則介于二者之間[4]。多步提取不僅使磷蝦油營養(yǎng)價(jià)值最大化，也可為后續(xù)蝦油特定組分收集提供基礎(chǔ)。而利用混合溶劑進(jìn)行提取既可以獲得更多的活性物質(zhì)，同時(shí)避免了多步繁瑣操作。Tian 等[10]采用乙酸乙酯-正丁醇混合溶劑（1:1，V/V）進(jìn)行磷蝦油提取，僅提取5 min 后得到的磷蝦油中PL 含量為27.7%～42.3%，總產(chǎn)油率為4.15%～6.18%。采用乙醇、正己烷或其混合溶劑（1:2，V/V）提取磷蝦油得率分別為21.32%、8.50%和18.75%，PL 含量分別為64.82%、30.20%、55.41%，該混合溶劑同樣可作為合適的提取溶劑，提取油中PUFA 含量高[11]。在另一項(xiàng)乙醇-正己烷混合溶劑提取磷蝦油研究中，若溶劑組成中乙醇>正己烷，提取液不分層，此時(shí)降低溶劑中乙醇比例能夠增加油脂產(chǎn)率，在乙醇:正己烷=3:2 時(shí)提取率達(dá)最高74.49%；若正己烷>乙醇，則提取液在靜置30 min 后發(fā)生分層現(xiàn)象，在乙醇:正己烷=2:3 時(shí)，總油脂提取率可達(dá)95.23%（乙醇層54.77%，己烷層40.46%）[12]。

上述溶劑提取磷蝦油研究中，往往需要使用大量溶劑，料液比達(dá)1:6～1:30（W:V），同時(shí)耗費(fèi)較長時(shí)間。通過尋找新的提取溶劑或者改進(jìn)提取方法可以改善這一現(xiàn)象，例如采用親水性可調(diào)溶劑N-二甲基環(huán)己胺提取南極磷蝦油，該方法溶劑用量少，對(duì)環(huán)境友好且提取效率與氯仿/甲醇提取相當(dāng)[13]。另外較為新穎的離子液體或生物溶劑等同樣可應(yīng)用于油脂的提取，然而其在磷蝦油提取領(lǐng)域鮮有報(bào)道[14]。從改進(jìn)提取方法角度來看，在乙醇提取蝦油前使用1.0%檸檬酸鈉溶液浸泡處理干粉，可提高蝦油中的磷脂含量與流動(dòng)性，并且降低其酸值。因?yàn)闄幟仕徕c能與蝦油中的蛋白質(zhì)結(jié)合，去除磷蝦油中的蛋白質(zhì)、游離脂肪酸等雜質(zhì)[15]。在溶劑提取油脂時(shí)引入輔助條件，如超聲輔助溶劑提取可以提高出油率并減少提取時(shí)間[16]，這是值得嘗試的一種南極磷蝦油提取方法。

1.2 超臨界和亞臨界流體法

超臨界流體法（supercritical fluid extraction，SFE）是利用超臨界流體從原料中提取出特定組分的一種方法，在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體同時(shí)具有氣、液的擴(kuò)散、溶解能力，從而提供更優(yōu)的提取效率，在食品、化工等行業(yè)漸受歡迎[17?18]。在高價(jià)值脂類產(chǎn)品生產(chǎn)中，使用CO2或以丙烷和二甲醚為替代超臨界流體是當(dāng)前的發(fā)展趨勢[19]。

CO2超臨界溫度在31.1 ℃和7.38 MPa，可提取非極性、低分子量的弱極性化合物，其綠色安全特性使之成為油脂提取的主要溶劑[19]。趙泓博[20]將CO2-SFE 與溶劑法相結(jié)合，在CO2-SFE 提取過程中，無論夾帶劑乙醇的存在與否，所得油脂絕大部分為甘油三酯。而延長提取時(shí)間可提高磷脂含量，經(jīng)CO2臨界提取150 min 后的蝦油磷脂含量可超過97%，同時(shí)增加后續(xù)乙醇提取磷蝦粉產(chǎn)物中的EPA 和DHA 含量。除此之外，其創(chuàng)新性地探究了向CO2-SFE 中添加大豆油作載體助溶劑對(duì)南極磷蝦油提取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆油載體助溶劑不僅能提高磷蝦油產(chǎn)率與EPA 和DHA 含量，還能夠改變其產(chǎn)品特性，比如增加其氧化穩(wěn)定性與流動(dòng)性，減弱不良風(fēng)味。劉志東等[21]比較了CO2-SFE、溶劑法與壓榨法對(duì)南極磷蝦油的提取效果，結(jié)果表明CO2-SFE 的油脂產(chǎn)率接近壓榨法，低于溶劑法（無水乙醇），但CO2-SFE 產(chǎn)物的酸值與碘值均較高。

亞臨界流體法（subcritical fluid extraction，SubFE）利用亞臨界流體為萃取劑，根據(jù)極性相似原理提取特定組分，亞臨界狀態(tài)是指相對(duì)于近臨界和超臨界狀態(tài)存在的一種形式，萃取條件相對(duì)溫和[22]。具有較低的臨界壓力、溫度及適當(dāng)親脂性，丙烷和丁烷是廣泛應(yīng)用于油料提取的兩種流體[23?24]。比較n-butane-SubFE、CO2-SFE 和有機(jī)溶劑法提取南極磷蝦油，結(jié)果表明，n-butane-SubFE 提取磷蝦油具有超過CO2-SFE 的脂質(zhì)回收率（81.2%）、PL 含量（28.7 g/100 g）和TOC含量（67.7 mg/kg），以及超過乙醇提取的AST 含量（248.4 mg/kg），且其脂質(zhì)氧化程度低[7]。隨后Liu等[25]發(fā)現(xiàn)，選擇二甲醚為SubFE 流體，得到的磷蝦油相對(duì)于n-butane-SubFE 而言，具有更高的脂質(zhì)回收率（93.77%）、PUFA 含量（33.49%）和AST 含量（218.06 mg/kg）。利用臨界流體法提取南極磷蝦油，除流體種類外，溫度、壓力、流速等參數(shù)條件都需要大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。孫德偉等[26]采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)n-butane-SubFE 提取南極磷蝦油條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳條件下（提取時(shí)間120 min，壓力1.0 MPa，溫度40 ℃）脂質(zhì)提取率為21.39%，磷脂含量為28.68%，其中71.20%為磷脂酰膽堿。

1.3 酶解法

在植物油脂提取過程中，使用蛋白酶、纖維素酶、果膠酶或其他酶混合降解細(xì)胞壁可提高油脂收率[27]，其中，蛋白酶可使脂質(zhì)與蛋白質(zhì)分離，以此促進(jìn)使磷蝦油的釋放[28]。在提取南極磷蝦油前加入中性蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，與空白組相比，酶解磷蝦粉的油脂提取率顯著上升，其中堿性蛋白酶組提取率高于中性蛋白酶組，但中性蛋白酶組具有更高的AST、EPA 和DHA 含量[29]。對(duì)常用六種蛋白酶（木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶）酶解提取南極磷蝦油比較研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶提取磷蝦油的油脂收率較高（5.29%和4.90%），以堿性蛋白酶輔助提磷蝦油中PL（50.19%）和微量元素含量，其效果均高于另外五種蛋白酶[8]。將堿性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶一同加入以提取磷蝦油，提取效果同樣優(yōu)于溶劑提取[28]。Zhou 等[30]研究了不同種類酶的提取效果，包括中性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，結(jié)論與前文一致，復(fù)合蛋白酶的脂質(zhì)回收率最高。經(jīng)響應(yīng)曲面優(yōu)化提取條件后（酶濃度0.16%，45 ℃下酶解2.9 h），磷蝦油提取率可達(dá)86.02%。

南極磷蝦內(nèi)源酶活性極強(qiáng)，在捕撈死亡后容易發(fā)生自溶，故可以利用南極磷蝦自溶酶結(jié)合外源酶對(duì)其進(jìn)行酶解[31]。外源木瓜蛋白酶與內(nèi)源酶能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，在中性條件下酶解2 h 所得南極磷蝦油中EPA+DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于兩者單獨(dú)作用[32]。合理利用內(nèi)源酶可以減少外源酶使用量，甚至不需要使用外源酶。以大豆油為溶劑，從自溶6 h 的南極磷蝦水解物中富集營養(yǎng)成分，回收油中含有44.24 mg/kg的AST，總脂肪酸中含有1.1% EPA 和0.6% DHA[33]，這與上文中大豆油做載體助溶劑提取磷蝦油的研究相似，均體現(xiàn)了綠色提取理念。雖然利用蛋白酶解能提高脂質(zhì)成分的產(chǎn)率，但是上述文獻(xiàn)中酶解所需時(shí)間較長（2～6 h），該方法仍需要進(jìn)一步改良。

2 南極磷蝦油的生理活性

南極磷蝦油含有豐富的營養(yǎng)成分，如EPA、DHA、PL、TOC、VA、AST 等，其中DHA 和EPA 能夠促進(jìn)大腦發(fā)育，改善腦功能，調(diào)節(jié)脂質(zhì)和糖代謝。有研究證實(shí)，磷脂形式存在的DHA/EPA 在發(fā)揮其功能特性方面優(yōu)于甘油三酯或乙酯形式[5]，而高磷脂含量正是南磷蝦油組成特征之一[2]。蝦青素屬于類胡蘿卜素類，有顯著的抗氧化能力，研究發(fā)現(xiàn)蝦青素具有抗炎、抗氧化、促凋亡、抗癌等多種生物活性[34]。多種營養(yǎng)成分共同存在于南極磷蝦油中，使之具有較大的健康益處。關(guān)于磷蝦油的功能特性目前已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，從細(xì)胞、動(dòng)物以及臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦油具有抗炎、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗糖尿病、促進(jìn)大腦功能和抗癌等作用[2]，表1 列出了部分關(guān)于磷蝦油生理活性的研究進(jìn)展，包括其功能作用、磷蝦油組成與實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)論。文獻(xiàn)中使用的南極磷蝦油不盡相同，部分來源于商品磷蝦油，部分來源于實(shí)驗(yàn)室提取，導(dǎo)致其品質(zhì)和發(fā)揮功效的生理活性物質(zhì)種類和含量存在差異，這種差異在南極磷蝦油功能活性研究中是需要考慮的。

表1 部分磷蝦油生理活性的研究Table 1 Partial study on physiological activity of krill oil

2.1 心血管保護(hù)作用

血漿中的甘三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（Highdensity liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cho lesterol，LDL-C）等水平異常是引發(fā)心血管疾病的重要潛在性危險(xiǎn)因素[52]。在高脂肪食物中添加磷蝦油能夠降低LDLC，顯著改善C57BL/6J 小鼠的血脂異常、脂肪肝和葡萄糖代謝，此外還能降低肝臟的氧化損傷[35]。與之類似，正常飲食大鼠服用南極磷蝦油與魚油后，磷蝦油相比魚油有著更強(qiáng)的降低血清TG 和TC 能力[36]。磷蝦油與魚油均有降低血脂和調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的作用，但作用機(jī)制不同，作用效果也不同。魚油降低極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL），磷蝦油降低血漿非酯化脂肪酸[37]。磷蝦油還能引起腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劑量依賴性改變，此變化與高脂血癥的減輕有關(guān)[38]。在志愿者飲食中添加南極磷蝦油同樣產(chǎn)生了降總膽固醇作用，能夠有效降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[39]。磷蝦油除降低TG、TC 水平及高血壓大鼠的血壓外[40]，Parolini 等[41]還證明了南極磷蝦油和磷蝦蛋白對(duì)載脂蛋白E 缺乏小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有延緩作用。

2.2 抗炎作用

炎癥是機(jī)體對(duì)有害物質(zhì)產(chǎn)生的一種反應(yīng)，被認(rèn)為是機(jī)體的有益過程，但同樣會(huì)引起機(jī)體不適，例如發(fā)熱和疼痛，此外，慢性炎癥與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、炎癥性腸病、牛皮癬等疾病密切相關(guān)[2]，為了減輕疼痛和減少慢性炎癥的發(fā)生，在自然界中尋找具有優(yōu)異鎮(zhèn)痛抗炎活性物質(zhì)一直是醫(yī)藥學(xué)科的研究熱點(diǎn)[53]。南極磷蝦油能夠?qū)FN-α和TFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的CACO-2、HT29 細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果使促炎細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)減少，上皮完整性增加，從而減輕腸道炎癥的發(fā)生[42]。經(jīng)臭氧處理后磷蝦油能減少脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)[43]。向患有輕度膝關(guān)節(jié)疼痛受試者的飲食中補(bǔ)充南極磷蝦油，膝關(guān)節(jié)炎量表和血尿生化參數(shù)顯示南極磷蝦油具有抑制促炎性介質(zhì)和減緩骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的作用[44]。

2.3 神經(jīng)保護(hù)作用

大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森氏?。≒arkinson’s disease，PD）起因復(fù)雜，但往往與神經(jīng)炎癥相關(guān)，因此，對(duì)氧化途徑和炎癥反應(yīng)的抑制是治療神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)研究方向[54]。南極磷蝦油可能通過抑制細(xì)胞凋亡反應(yīng)和氧化損傷預(yù)防甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[45]。磷蝦油對(duì)LPS 誘導(dǎo)AD 小鼠模型神經(jīng)炎癥的影響研究表明，飲食中添加磷蝦油抑制了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2 的表達(dá)，降低了活性氧和丙二醛的水平，能夠減輕氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥引起的腦損傷，降低淀粉樣變性的產(chǎn)生和改善記憶功能[46]。而在半乳糖誘導(dǎo)腦衰老小鼠實(shí)驗(yàn)中，磷蝦油減少了多巴胺和cAMP 調(diào)節(jié)蛋白以及參與鈣通道蛋白的表達(dá)，緩解腸道菌群的失調(diào)，對(duì)腦衰老產(chǎn)生有益作用[47]。通過生化參數(shù)測定及水迷宮實(shí)驗(yàn)等方法評(píng)價(jià)磷蝦油喂食對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響，結(jié)果表明，磷蝦油可通過減少海馬Aβ42水平和降低氧化損傷，改善認(rèn)知功能及減輕焦慮，南極磷蝦油可作為具有神經(jīng)保功效的食品補(bǔ)充劑和或功能性成分[48]。

2.4 改善骨質(zhì)疏松作用

骨質(zhì)疏松癥可導(dǎo)致骨脆性增加，骨折幾率增高，是最常見的骨骼疾病，多見于絕經(jīng)后女性和老年男性，且女性的患病率高于男性。隨著老齡化程度增加，骨質(zhì)疏松癥已成為各國所面臨的健康問題[55]。對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松小鼠補(bǔ)充南極磷蝦油90 d后，通過小鼠的骨密度、生物力學(xué)強(qiáng)度和松質(zhì)骨微觀結(jié)構(gòu)，證明了南極磷蝦油可顯著防止骨丟失，改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，促進(jìn)骨的形成[49]。與之相似，分別給予ICR 小鼠大豆油與磷蝦油作飲食補(bǔ)充劑，發(fā)現(xiàn)磷蝦油通過GH/IGF-1 通路促進(jìn)了骨的縱向生長，并增加了骨骼肌礦物質(zhì)含量和強(qiáng)度[50]。對(duì)軟骨退變小鼠補(bǔ)充磷蝦油8 周后改善了其軟骨結(jié)構(gòu)，抑制了軟骨細(xì)胞的增生性分化與關(guān)節(jié)軟骨的異常凋亡[51]。此外，南極磷蝦磷酸化肽對(duì)去卵巢大鼠同樣具有改善松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和生化特性的功效[56]。

3 總結(jié)與展望

南極磷蝦油作為一種新型的海洋功能性油脂，含有豐富的營養(yǎng)成分，對(duì)人體健康有多種益處，具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)溶劑法提取磷蝦油是目前最常用的一種提取方式，技術(shù)成熟，成本低、步驟少，未來新型綠色溶劑的開發(fā)與提取工藝優(yōu)化可解決溶劑用量大，回收處理困難以及提取時(shí)間長等不足。酶解法提取磷蝦油條件溫和，綠色環(huán)保且油脂產(chǎn)率高，外源酶與內(nèi)源酶的協(xié)同作用使酶解法更適于鮮蝦的提取，外源酶的種類是提取過程中最重要的影響因素，另外，酶解耗時(shí)長也是需要考慮的問題。臨界流體法雖然對(duì)設(shè)備要求高，但能夠通過控制提取條件改變臨界流體的選擇，極具靈活性，因此需要在諸多試驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化提取參數(shù)，使之適于磷蝦油的提取。未來南極磷蝦油提取技術(shù)的突破創(chuàng)新將會(huì)對(duì)磷蝦油應(yīng)用研究產(chǎn)生很大推動(dòng)作用。

南極磷蝦油產(chǎn)生各種功能活性作用的機(jī)制復(fù)雜，雖有一定報(bào)道，但并不全面，其如今研究較多的是對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用。此外，許多學(xué)者在研究中僅關(guān)注南極磷蝦油中EPA 和DHA 成分含量，但在這之外還存在多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)之間是否存在相互作用，又或者各自發(fā)揮不同的生理活性作用仍不清楚，南極磷蝦油組成與其功效之間的關(guān)系如何，這些問題亟待未來研究探尋。