TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠食欲的調節(jié)作用

楊瑞利，劉 芳，張 慧，周賽楠，王志廣，盧 娜，唐慶娟

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

隨著居民生活方式和飲食結構的不斷變化，中國人的超重率和肥胖率日益上升[1]。2016 年英國著名醫(yī)學雜志《柳葉刀》發(fā)表的關于全球成年人體重調查報告顯示：中國肥胖人群已突破9000 萬，超越美國成為全球肥胖人口最多的國家[2]。由肥胖帶來的一些并發(fā)癥：高血壓病、糖尿病、脂代謝紊亂、心臟病、惡性腫瘤等嚴重危害著人類的健康[3]。近年來，改善肥胖的方式主要有飲食調整，藥物、手術治療，體育運動干預等[4]。而飲食調控成為了近些年全世界關注的焦點[5]。

下丘腦是控制食物攝入和能量平衡的神經中樞，可以接受整合外周激素和腦-腸軸傳遞的信號，發(fā)放到效應器官，從而促進或抑制攝食[6?7]。瘦素和胰島素是參與食欲調控最主要的兩種外周激素。瘦素是一種由脂肪組織分泌的蛋白類激素，可以通過調節(jié)神經肽Y（Neuropeptide Y，NPY）和阿黑皮素原（Proopiomelanocortin，POMC）的的合成和釋放，從而抑制食欲[8]。胰島素是有胰島β細胞產生，調節(jié)食欲的機制與瘦素相似[9]。腦-腸肽包括促進食欲的腦-腸肽促生長素（ghrelin）和抑制食欲的腦-腸肽膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK），肽YY（Peptide YY，PYY），胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）[10]。腦-腸肽可以通過迷走傳入神經元將信號傳遞給下丘腦調節(jié)食欲，或者通過血腦屏障，直接作用于下丘腦中的特異性受體，從而調節(jié)食欲[11?12]。二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）屬于n-3 多不飽和脂肪酸，具有降脂減肥，控制食欲，調節(jié)脂質代謝，調節(jié)腸道菌群等功效[13]。劉新麗等[14]的研究表明n-3 多不飽和脂肪酸可以減少肥胖小鼠NPY、POMC 等食欲調節(jié)因子的表達。Golub 等[15]的研究表明，膳食補充DHA 會影響食欲或攝食量的調節(jié)。江亞娟[13]的實驗也表明N-3 多不飽和脂肪酸改善能量代謝，控制小鼠體重可能與調控小鼠飲食相關神經肽基因和解耦聯蛋白UCP 的表達有關。

實驗室前期研究發(fā)現DHA 可以通過食欲改善高脂飲食小鼠體脂蓄積。由于DHA 屬于多不飽和脂肪酸，具有6 個雙鍵，極易受光、熱的影響，同時極易發(fā)生氧化和酸敗。來源于魚油和藻油的DHA 多為甘油三酯型（Triglyceride，TG），尤其是魚油中TGDHA 含量較為豐富，但其帶有令人難以接受的魚腥味。限制了其在食品工業(yè)領域的開發(fā)利用。因此人們采用多種方式對它進行保護。脂質體作為一種新型微膠囊包埋技術，由于其兩親性，較高的生物相容性，穩(wěn)定性等受到廣泛關注[16]。很多文獻都曾報道，脂質體可以掩蓋魚油腥味[17]。楊梅等[18]的研究表明高磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）的磷脂更適合作為制備脂質體的壁材。目前的研究主要集中在魚油脂質體的制備，關于其對食欲調控的研究相對較少，這在很大程度上限制了魚油產品的開發(fā)利用。

本實驗以98%的PC 為壁材制備TG-DHA 脂質體，探究TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠食欲調節(jié)因子表達的影響，為開發(fā)相關的高附加值產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10/70 TG-DHA 金槍魚油 浙江舟山新諾佳生物技術有限公司；98%大豆磷脂酰膽堿（98% PC） 西安艾諾醫(yī)藥科技有限公司；SPF 級6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；瘦素（Leptin）試劑盒、胰島素（Insulin）試劑盒、阿黑皮素原（Proopiomelanocortin，POMC）試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司；TRIZOL 試劑 美國Invitrogen 公司；RNA 純化試劑盒 天根生化科技有限公司；5X All-In-One RT 裂解反轉錄一體試劑盒、EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix 加拿大abm 公司；10%低脂飼料（飼料代碼TP23522）、45%高脂飼料（飼料代碼TP23220） 南通特洛菲飼料科技有限公司，飼料配方見表1；其他試劑均為國產分析純。

表1 飼料配方Table 1 Feed formula

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Model680 型酶標儀 美國BioRAD 產品；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HT-7800 透射電子顯微鏡 天美中國科學儀器有限公司；SP-2500 紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16G 型臺式離心機上海安亭科學儀器廠；IQ5 Realtime PCR儀 美國Bio-RAD。

1.2 實驗方法

1.2.1 TG-DHA 脂質體的制備 稱取10/70 TG-DHA金槍魚油和98%大豆磷脂酰膽堿，用95%食用酒精溶解。旋轉蒸發(fā)、減壓濃縮（40 ℃，100 r/min）除去有機試劑，室溫靜止冷卻30 min，冷卻后加超純水洗膜，然后過200 nm 聚碳酸酯膜，即可得到TG-DHA魚油脂質體渾濁液[19]。

1.2.2 TG-DHA 脂質體包封率的測定

1.2.2.1 吸收波長的確定 分別將10/70 TG-DHA金槍魚油-石油醚和98%大豆磷脂酰膽堿-石油醚配制成0.6 mg/mL 的溶液。以石油醚為空白對照，分別用紫外分光光度計在200～400 nm 波長范圍內掃描兩種溶液，以確定最佳波長。

1.2.2.2 標準曲線 配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的6 種不同濃度的魚油石油醚溶液，以石油醚為空白對照，在1.2.2.1 測得的最佳波長處測定魚油石油醚溶液的吸光度，以魚油石油醚濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2.3 包封率測定 取適量TG-DHA 脂質體樣品，離心（8000 r/min）20 min。加入正己烷除去游離魚油。從下層溶液中取魚油脂質體樣品，用10%TritonX-100 甲醇溶液為破乳劑，超聲破壁（100 W）30 min，加石油醚提取，4000 r/min 離心6 min。取上清液用石油醚定容，在1.2.2.1 測得的最佳波長處測其吸光度，TG-DHA 魚油脂質體的吸光度為A，空白脂質體的吸光度為A0，計算△A=A?A0，根據1.2.2.2得到的標準曲線計算包封率[20]。

包封率（EE）：指包埋在脂質體里魚油質量占添加魚油質量的百分比

式中：Win 為包封的魚油質量，g；Wtot 為添加的魚油質量，g。

1.2.3 TG-DHA 脂質體形態(tài)學檢測 運用負染色法對脂質體懸浮液進行透射電子顯微鏡（TEM）觀察。取魚油脂質體樣品稀釋至10 mg/mL，將樣品滴在碳支持膜銅網上，然后用濾紙吸去多余液體；再將2%磷鎢酸滴在碳支持膜銅網上，濾紙吸干多余液體，室溫干燥。在放大倍率60000×，工作電壓75 kV的透射電鏡下觀察脂質體的形態(tài)[21]。

1.2.4 動物飼養(yǎng)與取樣 30 只SPF 級的雄性C57BL/6J小鼠暫養(yǎng)一周后，按體質量隨機分為三組，對照組（C），模型組（M），TG-DHA 脂質體組（L-DHA），除C 組喂養(yǎng)10%低脂飼料，其他兩組均喂養(yǎng)45%高脂飼料。4 周后開始灌胃，L-DHA 組灌胃TG-DHA 脂質體，C 組和M 組灌胃生理鹽水，灌胃劑量1000 mg/kg.bw。實驗小鼠養(yǎng)在普通環(huán)境下，單籠單只，室溫23±2 ℃，濕度55%～58%，12 h/12 h 光暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間所有動物均自由攝食和飲水。12 周后，摘眼球取血脫頸椎處死小鼠，取小腸，下丘腦等組織，?80 ℃保存。

1.2.5 小鼠體重增長率及能量攝入量的測定

能量攝入量(kcal)=平均攝食量×能量系數

式中，10%低脂飼料能量系數：3.58；45%高脂飼料能量系數：4.73。

1.2.6 血清食欲激素的測定 取上述各組小鼠血清，試劑盒法檢測血清中瘦素、胰島素、POMC 的濃度，具體方法按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 RNA 提取與qRT-PCR 使用提取試劑Trizol提取小腸、下丘腦中的總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。使用RNA 純化試劑盒去除蛋白質、無機鹽離子和有機雜質等。使用5X All-In-One RT裂解反轉錄一體試劑盒將RNA 反轉成cDNA。使用表2 所示引物，以β-actin 為內參基因，實時熒光定量PCR 按照 EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix試劑盒說明書進行設置。使用IQ5 型熒光定量PCR 儀進行測定mRNA 的相對表達量，擴增條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，20 s，95 ℃，15 s（45個循環(huán)）；5 ℃升溫至95 ℃（0.5 ℃/10 s），mRNA 相對表達量用2-ΔΔCT 法計算[22]。引物由上海生工生物工程有限公司合成；引物序列見表2：

表2 引物設計序列表Table 2 Primer sequences used for PCR

1.3 數據處理

所有實驗數據均用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±SD 表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 TG-DHA 脂質體包封率的測定

由圖1 可見，魚油-石油醚溶液在274 nm 處有最大吸光度，且在此波長處大豆磷脂酰膽堿-石油醚溶液無吸收波長，因此可以以274 nm 作為TGDHA 脂質體的最佳吸收波長。在274 nm 處測得標準曲線：A=0.9219X+0.0125，R2=0.9922；在此條件下測得TG-DHA 脂質體的包封率為85.83%，其包埋效果良好。

圖1 紫外掃描曲線圖Fig.1 Ultraviplet scanning spectrum

2.2 TG-DHA 脂質體形態(tài)學測定

由圖2 可見，TG-DHA 脂質體的形狀為圓形或橢圓形。外觀平滑完整，顆粒飽滿，分布均勻，脂質體邊緣幾乎沒有油脂，說明包埋效果良好。

圖2 TG-DHA 脂質體形態(tài)圖Fig.2 Morphology of TG-DHA liposome

2.3 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠能量攝入量的影響

體重增長率常作為高脂飲食誘導肥胖程度的常用指標，能量攝入量通常作為食欲變化的常用指標。如圖3A 所示，在第72～80 d,L-DHA 組實驗小鼠體重顯著低于M 組實驗小鼠體重。在飼養(yǎng)第44 d 之后，M 組小鼠能量攝入量一直高于C 組和L-DHA組小鼠（由圖3B 可見）。統(tǒng)計了實驗小鼠飼養(yǎng)過程中各組小鼠的體重增長率和能量攝入量，發(fā)現與C 組小鼠相比，M 組小鼠體重增長率（P<0.0001）和平均能量攝入量（P<0.01）極顯著升高。而與M 組小鼠相比，TG-DHA 脂質體的攝入極顯著降低了高脂飲食小鼠體重增長率（P<0.001）和能量攝入量（P<0.01）。表明TG-DHA 脂質體可能會通過調控高脂飲食小鼠的食欲從而降低高脂飲食小鼠的體重。

圖3 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠體重和能量攝入量的影響（n=10）Fig.3 Effects of TG-DHA liposomes on body weight and energy intake in high fat diet-fed mice（n=10）

2.4 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠血清食欲激素的影響

瘦素、胰島素、POMC 都是參與調控食欲的激素。瘦素主要通過作用于下丘腦的代謝調節(jié)中樞，發(fā)揮抑制食欲的作用；胰島素是一種促進食欲的激素；POMC 神經元通過釋放阿黑皮素原的剪切產物促黑激素（α-MSH）起到抑制食欲的作用。由圖4A 和圖4C 可見，高脂飲食極顯著降低了實驗小鼠血清中的瘦素（P<0.01），POMC（P<0.001）水平。且M 組小鼠出現了能量攝入量明顯增加的現象（P<0.01）。而TG-DHA 脂質體的攝入極顯著升高了實驗小鼠血清瘦素（上調了23.03%）、POMC（上調了1.30 倍）水平（P<0.0001），說明TG-DHA 脂質體或許可以通過增加高脂飲食小鼠體內的瘦素和POMC 的含量從而抑制其食欲[23]。有文獻報道補充DHA 會增加實驗動物體內POMC 水平的增加且會降低實驗動物攝食量[24]。如圖4B 所示，與C 組相比，高脂飲食極極顯著升高了實驗小鼠血清中胰島素水平（P<0.01），這可能是由于長期高脂飲食導致小鼠出現了胰島素抵抗現象，而TG-DHA 脂質體的攝入，極顯著降低了高脂飲食小鼠血清胰島素水平（P<0.01）降低了約38.18%。這與Martin 等[25]的研究結果相一致。

圖4 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠血清食欲激素水平的影響（n=10）Fig.4 Effect of TG-DHA liposome on serum appetite hormone in high fat diet-fed mice (n=10)

2.5 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠下丘腦食欲調節(jié)神經肽的影響

研究表明，血清食欲調節(jié)相關激素是通過作用于下丘腦，調節(jié)下丘腦促進食欲神經肽和抑制食欲神經肽的表達來調控食欲[26]。NPY 是促進食欲的神經肽，研究表明向下丘腦注射NPY，會顯著增加實驗動物的攝食量[27]。由圖5A 可以看出，高脂飲食具有增加小鼠下丘腦NPY 表達的趨勢，而TG-DHA 脂質體的攝入可以降低這一趨勢，但并未達到顯著水平（P>0.05）。α-MSH 是一種抑制食欲的神經肽，由圖5B 可見，與C 組相比，高脂飲食降低了M 組實驗小鼠下丘腦中α-MSH 的mRNA 相對表達量（P>0.05），而TG-DHA 脂質體的攝入極顯著增加了高脂飲食小鼠下丘腦α-MSH 的相對mRNA 表達量（P<0.001），增加約1.60 倍。POMC 是合成α-MSH的前體物質[28]。這與血清中POMC 檢測結果一致。

圖5 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠下丘腦食欲調節(jié)神經肽的影響（n=10）Fig.5 Effect of TG-DHA liposome on Hypothalamic appetite regulating neuropeptides in high fat diet-fed mice(n=10)

2.6 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠腸道中腦-腸肽表達的影響

由于TG-DHA 脂質體消化吸收的部位主要在胃腸道[29]。DHA 通過小腸上皮細胞時很可能會對相關基因的表達產生影響。因此我們檢測了實驗小鼠小腸中腦-腸肽的表達，如圖6 所示。CCK、PYY、GLP-1 都是抑制食欲的腦-腸肽。由圖6 所示，高脂飲食具有降低高脂飲食小鼠小腸中腦-腸肽表達的趨勢（P>0.05），而TG-DHA 魚油脂質體的攝入顯著增加了實驗小鼠小腸中PYY（1.32 倍）、GLP-1（78.10%）的mRNA 相對表達量（P<0.05）。表明TG-DHA 脂質體改善高脂飲食小鼠食欲可能與調節(jié)腸道中腦-腸肽PYY、GLP-1 的mRNA 表達量有關。

圖6 TG-DHA 脂質體對高脂飲食小鼠腸道中腦-腸肽表達的影響（n=10）Fig.6 Effect of TG-DHA liposome on the expression levels of brain-gut peptides of gut in high fat diet-fed mice (n=10)

3 討論與結論

本研究顯示，TG-DHA 脂質體的包埋效果良好，其包封率高達85.83%。透射電子顯微鏡觀察，脂質體外觀平滑完整，邊緣幾乎沒有油脂，且顆粒飽滿，大小相對均一。且本課題組之前的研究結果發(fā)現脂質體包埋后降低了己醛，2，4-庚二烯醛等會產生魚油腥味的物質，且TG-DHA 脂質體具有良好的穩(wěn)定性[30]。動物實驗研究結果顯示，TG-DHA 脂質體可以顯著降低高脂飲食小鼠的體重和能量攝入量。瘦素、胰島素、POMC 都是食欲相關激素。很多文獻都曾報道，瘦素可以通過下丘腦中特定的瘦素受體使POMC能神經元激活，從而調節(jié)食欲和能量平衡[31]。與瘦素相似，胰島素也可以通過與下丘腦受體結合激活POMC 能神經元，從而抑制攝食，調控能量平衡[32]。血清食欲相關激素的研究結果顯示，高脂飲食顯著增加了實驗小鼠血清中胰島素水平，這可能是由于長期高脂飲食導致小鼠出現了胰島素抵抗[33]。而TGDHA 脂質體的攝入，顯著降低了高脂飲食小鼠血清胰島素水平。同時高脂飲食顯著降低了血清中瘦素、POMC 水平，并未出現瘦素抵抗現象，這與王曉芳等[34]的研究結果相似。而TG-DHA 脂質體的攝入顯著增加了高脂飲食小鼠血清中瘦素和POMC 水平水平。

下丘腦在攝食調控中發(fā)揮著重要作用[35]。食欲相關激素通過作用于下丘腦，促進促食欲神經肽與抑制食欲的神經元的表達來調節(jié)食欲[26]。NPY 是促進食欲的神經肽，α-MSH 是抑制食欲的神經肽，由POMC 神經元裂解產生的。本實驗研究結果表明，高脂飲食具有升高NPY，降低α-MSH mRNA 表達的趨勢，而TG-DHA 脂質體的攝入顯著升高了α-MSH 的mRNA 表達，這與Schwinkendorf 等[36]的研究結果相一致。動物攝食后，營養(yǎng)物質接觸胃腸道從而刺激腦-腸肽的釋放。有文獻報道，高脂飲食對腸道中腦-腸肽的分泌有所損傷[37]。CCK、PYY、GLP-1 都是抑制食欲的腦-腸肽。Batterham 等發(fā)現小鼠攝食高脂肪飲食后PYY 降低[38]。本研究結果表明高脂飲食降低了小鼠小腸中CCK、PYY、GLP-1 的mRNA 表達，TG-DHA 脂質體的攝入顯著增加了實驗小鼠小腸PYY，GLP-1 的mRNA 表達。

綜上所述，本實驗研究表明TG-DHA 脂質體或許可以通過控制食欲相關激素或胃腸道中的腦-腸肽作用于下丘腦，促進抑食欲神經肽的表達，從而起到抑制食欲的作用。本研究可以更加有針對性的開發(fā)魚油新型食品，達到既經濟安全又高效的調節(jié)食欲的目的，以食療防治食欲異常，通過調控食欲縮小超重或肥胖人群的規(guī)模。