精氨酸處理對采后冬棗黑斑病的抗病作用

常璐璐，張樂樂，于有偉，王小佳，張少穎

（山西師范大學食品科學學院，山西臨汾 041004）

冬棗果實營養(yǎng)豐富，含有人體所需的19 種氨基酸和鉀、鐵、銅等多種微量元素，還含有VC、VB1、VB2等多種維生素[1]，口感脆甜，鮮食品質(zhì)極佳，深受人們喜愛。冬棗在貯藏期間最易受互隔交鏈孢（Alternaria alternata）侵染而產(chǎn)生黑斑病，因此，采后冬棗的防腐保鮮一直是人們研究的熱點[2]。目前，國內(nèi)外研究的保鮮方法主要包括物理、化學和生物保鮮法[3]。物理保鮮方法如氣調(diào)[4]和減壓技術[5]能有效抑制果實的呼吸，減慢果實水分的蒸騰速度和抑制微生物活動，延緩果實的衰老進程，減少腐爛?；瘜W處理方式如1-MCP[4]或CaCl2[6]處理也能有效保持冬棗的硬度，降低冬棗腐爛率，減緩冬棗中可滴定酸和VC含量的下降。常用生物制劑保鮮也能夠有效抑制冬棗的腐爛，如殼聚糖[7]、金針菇蛋白酶解肽[8]、銀杏葉提取液[9]等處理在誘導抗病方面也有一定效果。目前在產(chǎn)業(yè)中應用較多的冬棗防腐保鮮技術包括冷藏[10]、氣調(diào)包裝[4]。雖然，上述保鮮技術都具有一定的效果，但是考慮到經(jīng)濟、便捷等因素，尋求更為實用方便的誘導抗病防腐保鮮技術就顯得更為迫切。

精氨酸（Arginine，Arg）是多胺和NO 合成的前體物質(zhì)，二者在多種果蔬的生物脅迫和非生物脅迫中有著重要作用[11]。目前，Arg 多用于鶴望蘭[12]、月季[13]、百合[14]等鮮花的保鮮處理；也有研究發(fā)現(xiàn)采前Arg 處理能夠誘導番茄果實的抗病性[15]，同時發(fā)現(xiàn)內(nèi)源NO 濃度與處理后的苯丙氨酸解氨酶（phenylalamineammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）及β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活性呈正相關，說明Arg 通過影響NO 生物合成和調(diào)控防御酶的活性來誘導果實的抗病性。另外，Arg 處理對番茄灰霉病也有一定的抑制效果[15]。有研究還發(fā)現(xiàn)，Arg 處理抑制了白蘑菇貯藏期間PPO 和PAL 活性，誘導了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，增強了白蘑菇的抗病能力[16?18]。但是關于Arg 處理誘導采后冬棗果實抗病性方面的研究還很少，而且也缺乏系統(tǒng)深入的研究。

本研究以冬棗果實為試驗材料，通過不同濃度Arg 溶液浸泡處理，研究損傷接種A.alternata后，冬棗果實病斑直徑、抗病相關酶活性（PAL、POD、GLU、CHI）以及抗病物質(zhì)（黃酮、多酚、木質(zhì)素）的變化，以期豐富Arg 處理在果實采后抗病保鮮方面的理論研究，并為冬棗的采后防腐保鮮提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

供試白熟期冬棗果實 于2020 年9 月27 日采自山西省臨汾市堯都區(qū)堯鄉(xiāng)冬棗種植基地，采摘后迅速用紙箱包裝，運輸至實驗室，室溫（26±2 ℃）貯藏備用；供試Arg 購自上海阿拉丁試劑公司；A.alternata（BNCC115062） 購自北納生物有限公司，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中保存，使用前于PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d。

H1850R 高速臺式冷凍離心機 湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SpectraMax M2/M2e 酶標儀 上海普迪生物科技有限公司；IMS-40 全自動雪花制冰機 常熟市雪科電器有限公司；759S 紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；MDF-U53V超低溫冰箱 日本三洋集團；OLYMPUS-CX31 生物顯微鏡 山東博科再生醫(yī)學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液制備 取28 ℃培養(yǎng)10 d 的鏈格孢菌，加入無菌水（含0.05% Tween-20）后，刮下培養(yǎng)皿上的孢子，三層紗布過濾后，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)、稀釋，配制成1×105個/mL 的孢子懸浮液。

1.2.2 果實浸泡、損傷接種處理 用2%次氯酸鈉溶液浸泡棗果實2 min，自來水沖洗后自然晾干。將晾干后的果實分為四組，每組200 個，然后分別在0、20、200、1000 μmol/L Arg 溶液浸泡10 min，取出自然晾干，裝于塑料盒中，于室溫（26±2 ℃）、相對濕度90%下貯藏24 h。24 h 后用75%的酒精均勻噴灑消毒，之后用直徑為3 mm 的打孔器在棗果實中部打一個直徑為3 mm，深度為2 mm 的孔，取5 μL 配置好的A.alternata孢子懸浮液（1×105個/mL）接種于孔內(nèi)。接種完后裝入塑料盒中用聚乙烯薄膜封口于室溫（26±2 ℃）、相對濕度90%下貯藏。定期觀測病斑直徑，每次觀測60 個果實，重復三次。每隔1 d取10 個棗果實損傷部位皮下0.2～10 mm 范圍內(nèi)的果肉存放于超低溫冰箱（?80 ℃）內(nèi)用于測定后期指標。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 病斑直徑測定 利用十字交叉法測量冬棗的病斑直徑，每次測量60 個冬棗病斑的橫縱徑，重復3 次（每20 個為一組），求平均值。

1.2.3.2 PAL、POD、GLU 和CHI 活性的測定 PAL活性的測定參照曹建康等[19]的方法，做適當修改。取4 g 棗粉，加入4 mL 提取液（含有40 g/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）和5 mmol/Lβ-巰基乙醇）。在4 ℃、12000×g 離心30 min，收集上清液。取兩支試管，一支試管加入3 mL 硼酸緩沖液（50 mmol/L、pH8.8），0.5 mL L-苯丙氨酸溶液（20 mmol/L）、0.5 mL 酶液；另一支將酶液煮沸6 min后加入。兩支試管均于37 ℃下保溫10 min，加入0.1 mL HCl（6 mol/L）終止反應，在290 nm 處測定吸光度值。以吸光度值增加0.01 為1 個PAL 活性單位（U），表示為U·h?1·g?1FW。

POD 活性的測定參照曹建康等[19]的方法，稍作修改。離心管中加入3.0 g 果蔬組織樣品和3.0 mL提取緩沖液，于4 ℃，12000×g 離心30 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆?。取一支試管，反應體系包括3.0 mL 愈創(chuàng)木酚溶液（25 mmol/L）和0.5 mL 酶提取液，最后加入200 μL H2O2溶液（0.5 mol/L），同時開始計時。在波長470 nm 處測定吸光度值，15 s 后開始記錄，每隔1 min 記錄一次，重復三次。以吸光度值增加1 為1 個過氧化物酶活性單位（U），表示為U·min?1·g?1FW。

GLU 活性的測定參照曹建康[19]的方法稍作修改。取2.0 g 果蔬組織樣品，加入2.0 mL 經(jīng)預冷的提取液（含1 mmol/L EDTA-Na2、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、1 g/L L-抗壞血酸），于4 ℃，12000×g 離心30 min，收集上清液。準備2 支試管，分別加入100 μL昆布多糖（4 g/L），1 支試管中加入100 μL 上清液、另一支加入100 μL 煮沸上清液。37 ℃保溫40 min后加入1.8 mL 蒸餾水和1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（DNS），最后用蒸餾水稀釋至25 mL。測定540 nm處的吸光度值，分別記作ODS和ODC。重復三次，以每秒鐘每克果蔬組織分解昆布多糖產(chǎn)生 1×10?9mol 葡萄糖為一個 GLU 活性單位（U），表示為U·mol·s?1·g?1FW。

CHI 活性測定參照曹建康等[19]方法并作修改。取3 g 棗粉，加入4 mL 預冷丙酮，于4 ℃、12000×g離心30 min。反應體系為0.5 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液（50 mmol/L、pH5.2）、0.5 mL 膠狀幾丁質(zhì)懸浮液（10 g/L）和0.5 mL 酶液，對照管煮沸5 min。37 ℃水浴1 h，加0.1 mL 脫鹽蝸牛酶（30 g/L）繼續(xù)水浴1 h，最后加0.2 mL 四硼酸鉀溶液（0.6 mol/L），煮沸3 min 后迅速冷卻，于585 nm 處測定吸光度值。酶活性單位是U·mol·s?1·g?1FW。

1.2.3.3 黃酮、多酚、木質(zhì)素含量的測定 黃酮測定參考武繼蕓[20]的方法，稍作修改。取0.5 g 果蔬組織樣品，加入4.0 mL 80%的乙醇，于4 ℃，8000×g 離心20 min，收集上清液待用。取0.2 mL 樣液，加入0.6 mL NaNO2試劑，搖勻反應5 min 后加0.6 mL Al2Cl3溶液（10%），混勻后于室溫下放置6 min，最后加入2 mL NaOH 溶液（1 mol/L），室溫下放置15 min。在510 nm 處測定吸光度值。用蘆丁標準品制作標準曲線，所有實驗均重復測定3 次。總黃酮含量以樣品中所含蘆丁的當量（mg·g?1FW）來表示。

多酚測定參考Fan 等[21]的方法，取0.5 g 果蔬組織樣品，加入4.0 mL 80%的乙醇，于4 ℃，8000×g 離心20 min，收集上清液待用。取0.2 mL樣液，加入2.0 mL Folin-Ciocalteau 試劑（稀釋10 倍），反應5 min后加入2.0 mL Na2CO3（10%），混勻后于室溫下放置1.5 h，在765 nm 處測定吸光度值。用沒食子酸溶液制作標準曲線，所有實驗均重復3 次。總酚含量以樣品中所含沒食子酸的當量（mg·g?1FW）來表示。

木質(zhì)素測定參照常晨等[22]的方法，取1 g 果蔬組織樣品，加入4.0 mL 預冷的95%的乙醇混勻，于4 ℃，12000×g 離心10 min，分別用95%的乙醇、乙醇:正己烷=1:2（v/v）沖洗沉淀三次。收集沉淀后加入1 mL 的溴乙酰（25%），70 ℃恒溫水浴30 min。加入1 mL NaOH 溶液（2 mol/L）終止反應，再加入2 mL 冰醋酸和0.1 mL 鹽酸羥胺（7.5 mol/L）。離心后取上清液0.25 mL，用冰醋酸定容至5 mL。在280 nm 處測定吸光度值，所有實驗均重復測定3 次。木質(zhì)素含量以OD280·g?1FW 表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 處理數(shù)據(jù)并進行Duncan’s 多重比較分析，Origin 2019 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 Arg 處理對接種A.alternata 后冬棗果實病斑直徑的影響

冬棗采后接種A.alternata后病斑直徑在貯藏期間呈上升趨勢，由圖1 可知，在貯藏的20 d 中，200 μmol/L Arg 處理組的病斑直徑最小，對照組的病斑直徑最大。在貯藏的第8 d，對照組的病斑直徑分別比20、200、1000 μmol/L Arg 處理高57.40%、60.04%、38.28%。到第20 d 時，對照組的病斑直徑比處理組分別高出52.14%、66.77%、41.50%。說明Arg 處理可以有效抑制接種A.alternata后棗果實病斑直徑的增長。

2.2 Arg 處理對冬棗果實中抗病相關酶活性的影響

PAL 是冬棗抗病過程中的重要酶類，能參與植物抗病過程中多種抗病物質(zhì)的合成。如圖2A，在貯藏期間，20、200 μmol/L Arg 處理組PAL 活性在0～12 d 呈上升趨勢，在12～20 d 呈下降趨勢，在第12 d時，兩個處理組酶活性分別為96.7 和123.4 U·h?1·g?1，對 照 組PAL 活 性 為59.9 U·h?1·g?1，比 對 照 組 高61.4%、106%。1000 μmol/L Arg 處理組和對照組的PAL 活性在0～16 d 呈現(xiàn)上升趨勢，16 d 后下降，第16 d 兩 組 酶 活 性 分 別 為56.9、70.2 U·h?1·g?1，1000 μmol/L 處理組比20 和200 μmol/L 處理組的活性低21.5%、42.4%；對照組比20 和200 μmol/L處理組的活性低3.4%、29%。

POD 主要參與植物體內(nèi)酚類化合物的氧化和植物細胞壁中木質(zhì)素的形成過程，有助于加強細胞壁的屏障作用以限制病害的發(fā)展[22]，增強植物的抗病性。如圖2B 所示，POD 活性在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，各組均在第4 d 出現(xiàn)活性高峰。貯藏期間，200 μmol/L 處理組POD 活性始終高于對照組，而1000 μmol/L 處理組POD 活性始終低于對照組。第16 d 時，20、200 μmol/L 處理組分別比對照組的POD 活性高6.8%、18.9%。

圖2 Arg 處理對冬棗果實中PAL（A）、POD（B）、GLU（C）、CHI（D）活性的影響Fig.2 Effect of arginine treatment on the activities of PAL (A),POD (B),GLU (C) and CHI (D) in winter jujube

GLU 是參與果實抗病作用的重要病程相關蛋白，它可以通過水解真菌細胞壁中的葡聚糖來參與植物的防御反應[23?24]。如圖2C 所示，在貯藏0～4 d時，GLU 活性急劇上升，在第4 d 時各組活性均達到最大值，之后則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。在第4 d 時，20、200、1000 μmol/L 處理組比對照組的GLU 活性分別高25%、31%、22%。直到20 d 時，各處理組和對照組的GLU 活性仍然有較大差異，各處理組的酶活性分別是對照組的10.5 倍、13.75 倍、6.75 倍。

CHI 直接作用于真菌細胞壁的主要組成成分幾丁質(zhì)，通過破壞真菌的細胞壁結(jié)構增強植物的抗病性。如圖2D 所示，在處理后0～4 d，酶活性快速上升，4 d 之后，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在處理前8 d，20、200、1000 μmol/L 處理組的CHI 活性均高于對照組。在第4 d 時，各處理組的酶活性分別比對照組的高45%、87%和6%?？傮w來看，貯藏期間200 μmol/L處理組的GLU 活性一直高于其他處理組和對照組。

2.3 Arg 處理對冬棗果實中黃酮、多酚和木質(zhì)素含量的影響

黃酮是植物中重要的抗氧化和抗病物質(zhì)，黃酮含量的測定在判定抗病作用方面有重要意義。在貯藏期間，黃酮的含量先快速上升，而后變化相對平穩(wěn)。由圖3A 可知，各處理組的黃酮含量均高于對照。到第12 d 時，20、200、1000 μmol/L 處理組和對照組的差異較大，各處理組分別比對照組高37.5%、41.2%、25%。到20 d 時，各處理組的黃酮含量分別為1.18、1.25、1.14 mg·g?1，分別比對照組高6.3%、12.6%、2.7%。

多酚也是植物體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)，在果實對抗采后病原菌中起著重要作用，貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，各處理的多酚含量在接種后的整個貯藏期間均高于對照。由圖3B 可知，貯藏第8 d時，各組的多酚含量最高，20、200、1000 μmol/L 處理組和對照組的多酚含量分別為2.93、2.99、2.83、2.67 mg·g?1，各處理組分別比對照組高9.7%、11.9%、5.9%。

木質(zhì)素的沉積可以降低病原菌致病酶對寄主細胞的降解，延緩病原菌對寄主植物的侵染。如圖3C 所示，20、200 μmol/L 處理組木質(zhì)素含量在0～8 d 時緩慢上升，8 d 后逐漸下降，1000 μmol/L 處理組木質(zhì)素含量在4～8 d 時緩慢上升，8 d 后逐漸下降，而對照組的木質(zhì)素含量在處理后前16 d 一直緩慢下降，到20 d 時略有升高。貯藏期間，各處理組的木質(zhì)素含量均高于對照，其中，200 μmol/L 處理組棗果實的木質(zhì)素含量最高。各處理組均在貯藏第8 d時木質(zhì)素含量最高，分別為3.68、3.72、3.64 OD280·g?1，分別比對照組高2.5%、3.6%、1.3%。

圖3 Arg 處理對冬棗果實中黃酮（A）、多酚（B）、木質(zhì)素（C）含量的影響Fig.3 Effect of arginine treatment on the contents of flavones(A),polyphenols (B) and lignin (C) in winter jujube

3 討論

Arg 作為人體必需氨基酸，同時是植物體內(nèi)一種重要的氮素儲藏營養(yǎng)物，也是多胺（PA）和NO 這兩個重要信使分子的前體物質(zhì)，與果蔬采后抗性密切相關[22]。在應對不同的生理病害時，植物細胞積聚的PA 通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)運過程和生理生化反應來抵抗病害，如PA 作為抗氧化劑和自由基清除劑能減少細胞內(nèi)的活性氧，防止細胞氧化損傷。NO 作為抗病機制中的信號分子，已被證實與PAL、GLU 和CHI等抗病酶的活性呈正相關[15]。研究表明，Arg 處理可以延緩番茄[15]、白蘑菇[16]的腐爛速度，但是關于Arg 處理誘導采后果蔬抗病性的研究還不深入。

病斑直徑能夠直觀反映果實的抗病作用效果。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Arg 處理對接種A.alternata后冬棗的病斑直徑擴展有明顯的抑制作用，各處理組的病斑直徑均小于對照組，這與季娜娜在研究精氨酸處理誘導番茄果實抗病性時的發(fā)現(xiàn)一致[24]。因此，Arg 浸泡處理對抑制棗果實的黑斑病是有效的。此外，體外實驗結(jié)果顯示Arg 對A.alternata無直接抑制作用（未發(fā)表），由此推測Arg 可能通過誘導作用來增強棗果實的抗病性，并進行后續(xù)研究。

棗果實的誘導抗病性與果實中抗病相關酶活性的變化密切相關。PAL、GLU、CHI 是植物抗病相關的重要酶類[25]。PAL、GLU、CHI 活性的增加在誘導抗病性中起關鍵作用，有助于增強果實抵御病原菌入侵的能力，進而抑制病害的發(fā)生[26?27]。PAL 是苯丙烷途徑的初始通道酶，其活性的增加不僅與抗病有密切關系的黃酮、多酚等物質(zhì)的合成有關，還參與植物細胞壁木質(zhì)化，從而直接限制病原菌的生長。GLU 和CHI 是植物組織中兩種關鍵的抗病相關蛋白，二者分別是真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)和葡聚糖的水解酶，具有降解真菌細胞壁的能力[28?29]。POD 參與植物細胞壁的構建過程，如酚類化合物的氧化、亞甲基化和木質(zhì)化，這有助于加強細胞壁結(jié)構以限制病原菌的發(fā)展[30]。本研究表明，Arg 浸泡處理棗果實后，其PAL、GLU、CHI 活性都有明顯上升，表明Arg 處理通過提高抗病相關酶的活性來誘導果實產(chǎn)生抵抗病原菌的能力，這與季娜娜的研究結(jié)果一致[24]。而整個貯藏期間對POD 的活性研究表明，適宜濃度的Arg 處理（200 μmol/L）能誘導POD 活性上升。因此，PAL、GLU、CHI 三種酶均參與冬棗果實對A.alternata感染引發(fā)的黑斑病的防御反應。

黃酮、多酚、木質(zhì)素，是植物苯丙烷代謝的重要產(chǎn)物，它們可以保護植物免受病原菌的侵害。黃酮和多酚不但可以直接作為抗菌劑，還可以氧化成醌類物質(zhì)，進一步抑制病原菌的生長。木質(zhì)素可以加固細胞壁，形成阻礙病原菌入侵的屏障，阻止病原菌的入侵[31]。本實驗結(jié)果表明，Arg 處理可以明顯提高果實中黃酮、多酚、木質(zhì)素的含量，增加棗果實對黑斑病的抗性。這與前人在番茄上的研究結(jié)果相似。當然，Arg 在果實抗病中的分子作用機制以及具體的信號通路還有待進一步研究。

4 結(jié)論

不同濃度的Arg 處理均能有效抑制病原菌的擴展，提高冬棗果實的抗病能力，其中，200 μmol/L Arg 處理組的病斑直徑增長最慢，效果最顯著。進一步研究顯示，Arg 處理提高了棗果實中PAL、GLU、CHI 的活性，其中200 μmol/L Arg 處理組的效果最好，說明Arg 處理通過對棗果實中抗病相關酶活性的誘導，顯著增加了果實組織中黃酮、多酚、木質(zhì)素等抗病相關物質(zhì)的含量。因此，Arg 能有效提高棗果實對A.alternata感染引發(fā)的黑斑病的抵抗能力。