ICP-MS 法同時(shí)測(cè)定辣木籽中22 種無(wú)機(jī)元素及主成分分析和聚類(lèi)分析

牛延菲，曹紅云，徐 怡，張曉南，吳春華

（1.西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650224；2.云南省藥物研究所，云南昆明 650111）

辣木（Moringa oleiferaLam.）原產(chǎn)于印度及非洲的熱帶地區(qū)，為辣木科（Moringaceae）辣木屬（MoringaAdans.）的植物，是一種多年生熱帶落葉喬木，19 世紀(jì)初引種至我國(guó)，目前廣西、云南等地均有大面積種植[1]。辣木除栽培用于觀賞外，還有廣泛的食用和藥用價(jià)值[2?4]，2012 年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品。辣木籽為辣木的干燥成熟種子，種子近球形，除含有豐富的油脂、維生素、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[5?7]，還含有黃酮類(lèi)、酚苷類(lèi)、多糖、維生素、生物堿、甾醇等多種活性物質(zhì)[8?10]，具有抗氧化[11]、抗炎[12]、抗腫瘤[12]、降血糖血脂[13]、護(hù)肝[14]等藥理作用，在食品、保健品、藥品、醫(yī)美等領(lǐng)域得到廣泛研究和開(kāi)發(fā)。

植物無(wú)機(jī)元素與其功效、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)，研究其無(wú)機(jī)元素含量與分布，對(duì)于闡明傳統(tǒng)的藥理、毒理，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)藥用資源具有重要的價(jià)值[15]。目前辣木籽研究大多針對(duì)其中化學(xué)成分的分離與鑒定，而對(duì)其無(wú)機(jī)元素的研究較少[16]，無(wú)機(jī)元素測(cè)定主要采用原子吸收光譜和電感耦合等離子發(fā)射光譜法，其中ICP-MS 法因其檢出限低、精密度高、準(zhǔn)確性好及同時(shí)分析多元素等優(yōu)勢(shì)，在食品、藥學(xué)、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[17]。本文建立了微波消解法和ICP-MS 內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定辣木籽（紅河州元陽(yáng)、紅河州紅河、紅河州開(kāi)遠(yuǎn)、楚雄州元謀、德宏州芒市、楚雄州雙柏、昭通市巧家、昆明市東川、玉溪市元江、麗江市華坪10 個(gè)產(chǎn)地）中Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb22 種無(wú)機(jī)元素，同時(shí)從元素組學(xué)的角度建立無(wú)機(jī)元素特征圖譜，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類(lèi)分析，以期探索辣木籽中無(wú)機(jī)元素的組成，為該植物的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木籽 采集紅河州元陽(yáng)、紅河州紅河、紅河州開(kāi)遠(yuǎn)、楚雄州元謀、德宏州芒市、楚雄州雙柏、昭通市巧家、昆明市東川、玉溪市元江、麗江市華坪10 個(gè)產(chǎn)地的樣品，分別編號(hào)為S1～S10，由云南省藥物所究所正高級(jí)工程師蘇鈦鑒定為辣木科辣木屬植物辣木（Moringa oleiferaLam.）的干燥成熟種子；Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 單元素和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL） 美國(guó)Agilent 公司；Hg、Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/mL） 國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；Sc、Ge、In、Bi 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L） 美國(guó)Agilent 公司；Li、Y、Co、Bi 調(diào)諧液（1 mg/L） 美國(guó)Agilent 公司；硝酸 UPS 級(jí)，蘇州晶瑞。

CEM Mars 6 高通量密閉微波消解儀 美國(guó)CEM 公司；Agilent 7700X 電感耦合等離子質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent 公司；AG285 電子天平 梅特勒-托利多公司；Advantage 10 Milli-Q 超純水發(fā)生器 美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密量取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品適量，用10%硝酸進(jìn)行稀釋?zhuān)渲贸上盗袠?biāo)準(zhǔn)混合溶液，其中Na、Mg、K、Ca 和Fe 元素的質(zhì)量濃度為8000、16000、24000、32000、40000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se 和Mo 元素的質(zhì)量濃度為80、160、240、320、400 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 和Hg 元素的質(zhì)量濃度為8、16、24、32、40 μg/L。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取Sc、Ge、In 和Bi 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水分別稀釋成1 μg/mL 的混合溶液，即得。

1.2.3 樣品消解 稱(chēng)取本品粉末約0.3 g，置消解罐內(nèi)，加優(yōu)級(jí)純硝酸8 mL，加入100 μL Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度：10 μg/L），混勻，過(guò)夜。置于高通量密閉微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解，消解程序?yàn)椋汗β?00 W，以5 ℃/min 速率自室溫加熱至90 ℃，保持10 min；功率1800 W，以3 ℃/min 速率加熱至125 ℃，保持15 min；以100%的功率，以3 ℃/min 速率加熱至180 ℃，保持30 min。待消解結(jié)束，冷卻，放氣，藥液由消解罐轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。使用同法制備空白溶液。

1.2.4 儀器條件 使用濃度為1 mg/L 的調(diào)諧液Li、Y、Co、Bi 調(diào)諧，使ICP-MS 的各項(xiàng)參數(shù)均達(dá)到要求，即儀器射頻的功率為1500～1700 W、等離子體氣流速15.0 L/min、輔助氣的流速1.0 L/min、載氣的流速為0.8～1.1 L/min、耐鹽型霧化器溫度2 ℃、蠕動(dòng)泵穩(wěn)定時(shí)間35 s。

1.2.5 測(cè)定法 測(cè)定時(shí)選取的同位素為23Na、24Mg、27Al、39K、40Ca、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、78Se、95Mo、107Ag、111Cd、121Sb、137Ba、202Hg、205Tl 和208Pb，其 中23Na、24Mg、27Al、39K、40Ca、52Cr、55Mn 和56Fe，以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)；59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As 和78Se，以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)；95Mo、107Ag、111Cd、121Sb 和137Ba，以115In 作為內(nèi)標(biāo)；202Hg、205Tl 和208Pb，以209Bi 作為內(nèi)標(biāo)。以各元素與內(nèi)標(biāo)元素計(jì)數(shù)值的比率值為縱坐標(biāo)，元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)曲計(jì)算得各元素相應(yīng)的濃度，同時(shí)扣除空白溶液的干擾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究利用Excel 2010、SPSS 22.0 軟件進(jìn)行了數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 線性關(guān)系考察 取“1.2.1”項(xiàng)下多元素系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在“1.2.4”儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，以10%硝酸溶液為空白，依次測(cè)定，以多元素的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)、待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)溶液檢測(cè)器響應(yīng)值比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)，Na、Mg、K、Ca、Fe 元素在0～40000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo 元素的質(zhì)量濃度為0～400 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 元素的質(zhì)量濃度為0～40 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

2.1.2 檢出限實(shí)驗(yàn) 將空白溶液在“1.2.4”條件下連續(xù)測(cè)定11 次，以測(cè)定結(jié)果的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度值為22 種元素的儀器檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1 檢出限在0.04～78.44 μg/L，滿足分析要求。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取配制好的混合對(duì)照品溶液（Na、Mg、K、Ca、Fe 元素的質(zhì)量濃度為16000 μg/L；Al、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo 元素的質(zhì)量濃度為80 μg/L；Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 元素的質(zhì)量濃度為24 μg/L），在“1.2.4”儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定7 針，RSD 值均小于5.0%，表明本法具有良好的精密度。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批號(hào)的樣品6 份，按照“1.2.3”前處理，在“1.2.4”儀器條件下進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)計(jì)算，檢出限以上元素的含量RSD%均小于5.0%，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品0.3 g，平行制備6 份，分別加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法前處理，在“1.2.4”儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)計(jì)算22 種無(wú)機(jī)元素的回收率在80.13%～113.66%之間，RSD<10%，符合規(guī)定。

2.1.6 樣品測(cè)定 取10 個(gè)產(chǎn)地樣品，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法前處理，在“1.2.4”儀器條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)結(jié)果分析，辣木籽中無(wú)機(jī)元素種類(lèi)豐富，其中K、Mg、Ca、Zn、Fe、Na、Mn 等元素含量較高，尤以K、Mg 和Ca 含量最高，這提示辣木籽可作為補(bǔ)充K、Mg 和Ca 元素的食物來(lái)源。同時(shí)所采集的10 個(gè)不同產(chǎn)地的辣木籽As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 有害元素含量較低，說(shuō)明辣木籽中上述有害元素污染風(fēng)險(xiǎn)較低。

2.2 辣木籽無(wú)機(jī)元素指紋圖譜建立

表3 中含量數(shù)據(jù)表明，不同產(chǎn)地辣木籽均含有豐富的K、Mg、Ca 人體必需常量元素（>1000 mg/kg）；較高的Fe、Zn、Mn、微量元素（>10 mg/kg）；較低的As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 有害元素（<0.2 ppm）。根據(jù)表3 辣木籽22 種無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果，按照無(wú)機(jī)元素原子序號(hào)的順序繪制含量分布曲線，為便于同時(shí)呈現(xiàn)所有元素，參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]把含量懸殊的元素縮小相同倍數(shù)（K、Mg、Ca 含量各縮小10 倍），詳見(jiàn)圖1。由元素指紋圖譜可見(jiàn)，10 個(gè)產(chǎn)地樣品中無(wú)機(jī)元素指紋圖譜具有相似的峰形，即各無(wú)機(jī)元素含量按原子序號(hào)順序在一定程度上呈現(xiàn)出有規(guī)律的高低分布，生成的共性無(wú)機(jī)元素譜可用于鑒別辣木籽。

2.3 主成分分析

剔除未檢出的元素，將14 種元素（Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Mo、Ba）含量測(cè)定結(jié)果用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，得到各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率（見(jiàn)表4），由結(jié)果可知，前4 個(gè)主成分的特征值均大于1，分別為4.66、3.22、2.26、1.19，對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.94%，能夠反映出大部分信息，故選擇前4 個(gè)成分進(jìn)行分析。

表1 22 種元素回歸方程Table 1 Regression equation of 22 elements

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Accuracy measurement results (n=6)

旋轉(zhuǎn)成分矩陣圖見(jiàn)表5，其中第1 個(gè)主成分與Zn、Ca、Cu 呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)均>0.8），第2 個(gè)主成分與Fe 呈正相關(guān)，第3 個(gè)主成分與Cr 呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)>0.7），第4 個(gè)主成分與Ba、Al 呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)>0.8），并且第1、第2、第3、第4 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.94%，超過(guò)總方差的80%，所以推斷Zn、Ca、Cu、Fe、Cr、Ba、Al 是辣木籽的特征無(wú)機(jī)元素。

2.4 聚類(lèi)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用組間聯(lián)接方法、系統(tǒng)聚類(lèi)分析法對(duì)10 批辣木籽樣品中22 種無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，當(dāng)歐式距離平方和為5 時(shí)，10 個(gè)樣品可分為兩大類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，S5（德宏州芒市）單獨(dú)聚為一類(lèi)，其余樣品為一類(lèi)。對(duì)其余樣品進(jìn)行細(xì)分，S4（楚雄州元謀）、S6（楚雄州雙柏）、S7（昭通市巧家）、S8（昆明市東川）、S10（麗江市華坪）可聚為一類(lèi)，上述5 個(gè)產(chǎn)地均為金沙江干熱河谷區(qū)域；S2（紅河州紅河）、S3（紅河州開(kāi)遠(yuǎn)）、S9（玉溪市元江）可聚為一類(lèi)，上述3 個(gè)產(chǎn)地均為紅河（元江）干熱河谷區(qū)域。聚類(lèi)分析的結(jié)果表明，辣木籽無(wú)機(jī)元素的含量與環(huán)境、地域等因素具有相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

本研究開(kāi)發(fā)建立了密閉微波消解、ICP-MS 內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定辣木籽中的Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb22 種無(wú)機(jī)元素的檢測(cè)方法。其中，為排除Hg 元素的記憶和吸附效應(yīng)，加入Au 元素成功抑制該效應(yīng)；同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償法[17]，排除基體效應(yīng)對(duì)多元素產(chǎn)生的抑制作用；最后，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果表明，本方法中的22 種元素的方程系數(shù)均大于0.999，儀器精密度RSD 均在5%以內(nèi)，加樣回收率在80.13%～113.66%之間，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可行。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（mg/kg，n=3）Table 3 Test results of samples (mg/kg,n=3)

圖1 無(wú)機(jī)元素指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of inorganic elements

表4 各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率Table 4 The characteristic value,contribution rate and cumulative contribution rate of each principal component

表5 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 5 Rotating component matrix

無(wú)機(jī)元素尤其是某些微量元素在中藥材發(fā)揮藥效的過(guò)程中也具有重要的作用[18?19]。本研究中采用ICP-MS 法對(duì)辣木籽中22 種無(wú)機(jī)元素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，10 個(gè)產(chǎn)地的辣木籽中含有較豐富K、Mg、Ca、Na 人體必須的常量元素；較高的Fe、Zn、Mn、Cu 微量元素；檢出Al、Ni、Cr、Mo、Co 微量元素；很低的As、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb 重金屬及有害元素。符合《中國(guó)藥典》四部（2020 年版）9302“中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則”中規(guī)定的重金屬及有害元素一致性限量指導(dǎo)值：藥材及飲片（植物類(lèi)）Pb 不得超過(guò)5 mg/kg，Cd 不得超過(guò)1 mg/kg，As 不得超過(guò)2 mg/kg，Hg 不得超過(guò)0.2 mg/kg。

圖2 辣木籽聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.2 The cluster analysis results

綜合分析辣木籽無(wú)機(jī)元素指紋圖譜，云南10 個(gè)產(chǎn)地的辣木籽中含有較豐富K、Mg、Ca、Na 人體必須的常量元素；較高的Fe、Zn、Mn、Cu 微量元素；且均呈高鉀低鈉特征。K 有助于增強(qiáng)心臟動(dòng)力、降低血壓，高鉀低鈉食物可促使鈉鹽排泄，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)鉀鈉的比值，有益于高血壓防治[20]；Mg 是酶反應(yīng)的重要配體之一，具有舒張血管而使血壓下降的作用，缺乏時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡被破壞，引起高血壓和其它病變；Ca 是構(gòu)成骨骼及牙齒的主要成分，還有抗炎、消腫等作用[21]；Fe 在人體內(nèi)主要參與氧的運(yùn)輸和造血過(guò)程，保持細(xì)胞的正常功能；Cu 參與鐵的代謝和紅細(xì)胞生成，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[22]；體內(nèi)缺乏Zn 影響人體的衰老；Mn 是超氧化物歧化酶的活性組分，改善脂質(zhì)代謝，維持血糖、血脂和血壓水平，對(duì)急性心肌缺血具有保護(hù)作用[23]。ICP-MS 作為一種準(zhǔn)確、便捷的技術(shù)手段可用于藥材的有害重金屬元素[24?26]、有益微量元素[27]的質(zhì)量控制，不同產(chǎn)地辣木籽所含的無(wú)機(jī)元素與辣木籽具有治療心腦血管疾病、抗氧化等作用是相符合的[28?30]。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示辣木籽中富含的有益微量元素與治療心血管疾病的關(guān)系提供了有利數(shù)據(jù)。