氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定茶葉包裝紙中9, 10-蒽醌含量

梁劍鋒，李 亞，魏詩(shī)琴，喬如穎，陳美伴

（梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西梧州 543002）

中國(guó)茶葉歷史悠久、種類繁多，深受國(guó)人喜愛。近年來中國(guó)的茶葉為更多世界各地人們所接受，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球160 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)30 多億人有飲茶的習(xí)慣[1]。茶葉的飲用安全一直以來是消費(fèi)者和茶葉生產(chǎn)加工者共同關(guān)注的問題，其關(guān)鍵是確保飲用茶葉不會(huì)對(duì)人體構(gòu)成任何的健康風(fēng)險(xiǎn)[2]。相關(guān)研究表明茶葉飲用是否安全主要受農(nóng)藥殘留、重金屬殘留和真菌毒素等方面的影響[3]，而隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)茶葉中含有新型的污染物如蒽醌、高氯酸鹽、鄰苯二甲酸酯類化合物[4?5]。2014年10月歐盟發(fā)布NO1146/2014 規(guī)定：茶葉中蒽醌最高限量為20 μg/kg[6]，這一規(guī)定出臺(tái)導(dǎo)致2014 年我國(guó)出口茶葉出現(xiàn)同比下降，其中輸出歐盟茶葉中不符合限量要求的27 批次茶葉中，因蒽醌超標(biāo)多達(dá)8 批次而居首位[7]，蒽醌超標(biāo)問題給我國(guó)茶葉出口帶來一定沖擊。

9,10-蒽醌是一種醌類化合物，容易溶解于苯、甲苯、乙醇、乙醚和氯仿等有機(jī)溶液，不溶于水，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為“對(duì)人類可能致癌”（2B 組）物質(zhì)，對(duì)人體有一定毒性[8]；其常存在于高等植物和低等植物地衣類、真菌類代謝物中；9,10-蒽醌也可人工合成，主要用于染料生產(chǎn)的中間體，還是做紙制品印花的導(dǎo)氧劑[9]。目前，許多造紙企業(yè)將蒽醌作為添加劑在造紙過程中使用，有研究表明蒽醌可以通過包裝紙和硬紙板等纖維制品遷移到相應(yīng)食品中而造成污染[10?11]。已報(bào)道的蒽醌檢測(cè)方法主要有紫外-可見分光光度法[12?15]、高效毛細(xì)管電泳法[16?17]、高效液相法[18?20]、氣相色譜-質(zhì)譜法[21]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22?25]及比色定量法[26?27]，尚無適用于茶葉包裝紙中蒽醌檢測(cè)方法。目前檢測(cè)包裝紙中蒽醌主要參考國(guó)標(biāo)GB/T 230204-2008《茶葉中519 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》中蒽醌的檢測(cè)方法[28]，但該方法為定性方法，且不適合包裝紙等富含植物纖維的復(fù)雜基質(zhì)中微量蒽醌的測(cè)定。因此，基于對(duì)樣品前處理、優(yōu)化色譜條件等手段，建立一種快速、準(zhǔn)確、適合常見茶葉包裝紙基質(zhì)的蒽醌氣相色譜-質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定量分析方法，對(duì)研究茶葉中蒽醌來源，從而控制蒽醌污染物由包裝紙遷移至茶葉，保障茶葉消費(fèi)者飲用安全，消除歐盟技術(shù)壁壘具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉包裝紙樣品 市場(chǎng)上購(gòu)買的袋裝、紙籮裝、盒裝等紙質(zhì)包裝茶葉，取其中的包裝紙（?？?、銅版紙、特種紙、白紙板）作為分析研究樣品；9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)物品CAS 號(hào)：84-65-1，純度99.0% 德國(guó)DrEhrenstorfer 公司；D8-蒽醌CAS 號(hào)：10439-39-1，純度99.0% 美國(guó)TRC 公司；丙酮，色譜純 美國(guó)Honeywell 公司；正己烷，色譜純 德國(guó)Merck 公司；無水硫酸鎂，分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SPE 小柱1000 mg/6 mL，弗羅里硅土 美國(guó)安捷倫公司。

Agilent Intuvo9000-7000D 三重四極桿氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀配電子轟擊離子化源及Masshunter 色譜處理軟件 美國(guó)安捷倫公司；Multi reax 渦旋混合器 德國(guó)heidolph 公司；X-30R離心機(jī) 德國(guó)Beckman公司；NAI-DCY-12G 氮吹儀 上海那艾精密儀器有限公司；CPA225D 型電子天平 德國(guó)Sartoriu 公司；Million Q 超純水器 美國(guó)Milli-pore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 樣品提取 將包裝紙樣品裁剪成小碎紙，混勻后分成兩份，一份用于檢測(cè)，另外一份保存在棕色樣品瓶中備用。取樣品0.50 g 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入5.0 mL 超純水浸泡30 min，加入內(nèi)標(biāo)D8-蒽醌儲(chǔ)備液16.7 μL 和15.0 mL 丙酮-正己烷混合提取溶液（V+V=1+4），超聲提取30 min，加入3.0 g 無水硫酸鈉鎂，立即搖勻，然后置于冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速4000 r/min，溫度4 ℃）離心10 min。移取6.0 mL 上清液于15mL 離心管中，35 ℃氮?dú)獯蹈伞?.0 mL 丙酮-正己烷洗脫液（V+V=1+39）溶解殘?jiān)齼艋痆29]。

1.2.1.2 樣品凈化 首先用5.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液淋洗SPE 小柱，棄去流出液，然后上樣待凈化液，加入10.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液洗脫目標(biāo)分析物，收集所有流出液于35 ℃氮?dú)獯蹈桑?.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液溶解殘?jiān)?，過0.22 μm 有機(jī)濾膜于進(jìn)樣小瓶，濾液供上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：美國(guó)安捷倫科技有限公司DB-5MS 柱（20 m×0.18 mm×0.18 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫箱升溫程序：初始溫度120 ℃，以30 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 電離模式：電子轟擊（EI），70 eV；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)和其他參數(shù)見表1；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：高純氮?dú)?，流量?.0 mL/min；溶劑延遲：3 min。

表1 質(zhì)譜儀檢測(cè)參數(shù)Table 1 Detection parameters of mass spectrometer

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品25.3 mg于25 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，然后用丙酮稀釋成 1.00 μg/mL 的9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中避光保存。

稱取D8-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg 于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，然后用丙酮稀釋成 100 μg/mL的D8-蒽醌內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中避光保存。

臨用前，吸取10、20、50、100、200 μL 的9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.00 μg/mL）于1.0 mL 容量瓶中，分別各加入5 μL 的 D8-蒽醌內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 μg/mL），用丙酮逐級(jí)稀釋成的濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL 的9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)使用液，D8-蒽醌內(nèi)標(biāo)濃度為0.50 μg/mL。以9,10-蒽醌濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)（208.0>180.0）的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以保留時(shí)間和定性離子對(duì)定性，以定量離子對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、圖譜處理采用安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀自帶分析軟件MassHunter GC/MS Acquisition（版本B.07.06.2704，18-Jul-2017），圖表制作采用Origin7.5，試樣中9,10-蒽醌含量計(jì)算公式為

式中：w 為試樣中9,10-蒽醌的含量，mg/kg；A 為樣品溶液中9,10-蒽醌和D8-蒽醌的峰面積比；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液中9,10-蒽醌和D8-蒽醌的峰面積比；ρs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中9,10-蒽醌的質(zhì)量濃度，μg/mL；V 為樣品提取溶液體積，mL；m 為試樣的質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)條件下獲得2 次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇 由于包裝紙富含植物纖維，基質(zhì)較復(fù)雜，必須采用能夠把目標(biāo)物與基質(zhì)干擾物很好的分離的氣相色譜柱[30]。試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)分析物9,10-蒽醌為弱極性物質(zhì)，根據(jù)被分析物質(zhì)的物化性質(zhì)及相似相溶原理，本文試驗(yàn)考察DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS、DB-1701P 四種不同型號(hào)弱極性氣相色譜柱分離檢測(cè)效果。通過檢測(cè)加標(biāo)茶葉包裝紙（加標(biāo)量：100 ng/mL）及改變色譜條件觀察目標(biāo)物與干擾物分離情況評(píng)價(jià)色譜柱效果，不同色譜柱對(duì)目標(biāo)物分離情況見圖1～圖4。

圖1 DB-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of DB-5MS column

試驗(yàn)考察的DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS、DB-1701P 四款色譜分離柱均屬于弱極分離柱，其中DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS 三款色譜柱在分離性能上近似等同于以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為填充物的色譜柱。四款色譜柱在具體填充料上有所區(qū)別：DB-5MS 色譜柱填充料為5%苯基和95%二甲基亞芳基硅氧烷，HP-5MS 色譜柱填充料為5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷，VF-5MS 色譜柱填充料為高惰性5%苯基甲基聚硅氧烷，DB-1701P 色譜柱填充料為（14%-氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷。四款色譜柱由于在填充料方面組成不同，導(dǎo)致它們?cè)趯?duì)目標(biāo)分析物9,10-蒽醌進(jìn)行分離時(shí)，在出峰時(shí)間、響應(yīng)值、基線分離等關(guān)鍵性能指標(biāo)上存在一定差別。對(duì)比上面四個(gè)不同色譜柱的總離子流圖可以發(fā)現(xiàn)：DB-5MS色譜柱的出峰時(shí)間比其他兩款色譜柱明顯要快，在響應(yīng)值、基線分離方面與其他三款色譜柱差別不大，而且由于DB-5MS 色譜柱具有極低柱流失特性，更適合在GC/MS/MS 上檢測(cè)目標(biāo)物9,10-蒽醌，因此試驗(yàn)采用DB-5MS 色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)。

圖2 HP-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of HP-5MS column

圖3 VF-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.3 Total ion flow diagram of VF-5MS column

圖4 DB-1701P 色譜柱總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of DB-1701P column

2.1.2 進(jìn)樣口溫度選擇 氣相色譜進(jìn)樣口溫度選擇過高，會(huì)導(dǎo)致樣品中目標(biāo)分析物9,10-蒽醌在進(jìn)樣口分解，降低回收率而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度；而進(jìn)樣口溫度選擇過低，則導(dǎo)致樣品中目標(biāo)分析物9,10-蒽醌未完全汽化，同樣影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。本文實(shí)驗(yàn)考查240～300 ℃之間的進(jìn)樣口溫度，以目標(biāo)分析物9,10-蒽醌的質(zhì)譜響應(yīng)值大小為考核指標(biāo)（每個(gè)溫度重復(fù)測(cè)定2 次取平均值），結(jié)果見圖5。

圖5 不同進(jìn)樣口溫度對(duì)9,10-蒽醌響應(yīng)值影響Fig.5 Effect of different inlet temperature on 9,10 anthraquinone response values

從圖5 可以發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)樣口溫度從240 ℃開始升高，9,10-蒽醌在質(zhì)譜的響應(yīng)值持續(xù)增大，說明在一定的溫度范圍內(nèi)，增加進(jìn)樣口溫度能夠提高樣品中9,10-蒽醌目標(biāo)分析物的汽化率，同時(shí)增加檢測(cè)響應(yīng)值；進(jìn)樣口溫度超過270 ℃后，隨著溫度升高，9,10-蒽醌在質(zhì)譜中的響應(yīng)值出現(xiàn)下降的趨向，原因可能是由于進(jìn)樣口溫度過高，樣品中的部分9,10-蒽醌在進(jìn)樣口部分被分解，導(dǎo)致響應(yīng)值出現(xiàn)下降。綜合分析，采用270 ℃作為進(jìn)樣口溫度比較合適[31]。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在色譜條件優(yōu)化后進(jìn)行全掃描（Scan）得到目標(biāo)分析物9,10-蒽醌的質(zhì)譜圖（見圖6），選擇質(zhì)核比大，相對(duì)豐度比較高的作為目標(biāo)產(chǎn)物離子，然后采用多反應(yīng)檢測(cè)方式掃描（MRM）。根據(jù)目標(biāo)物離子信息，結(jié)合檢測(cè)靈敏度，最終選擇208.0>152.0 為定性離子對(duì)，208.0>180.0 為定量離子對(duì)，選取10 eV、22 eV 分別作為定量和定性離子對(duì)的碰撞能量。

圖6 9,10-蒽醌離子流圖和質(zhì)譜圖Fig.6 Ion flow and mass spectra of 9,10-anthraquinone

2.3 線性范圍及方法檢出限

按照本文1.3 的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以9,10-蒽醌的濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子對(duì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比（S/N）計(jì)算出檢出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比計(jì)算出定量限（limit of quantity，LOQ）。

結(jié)果表明，9,10-蒽醌在10～200 ng/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.23249X+0.001203，擬合度R2為0.9989，方法檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)考查

選擇氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定樣品，包裝紙樣品的某些基質(zhì)可能會(huì)對(duì)目標(biāo)物的離子具有較強(qiáng)的增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，因此選擇內(nèi)標(biāo)法定量分析目標(biāo)物具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。制備四種不同空白基質(zhì)樣品溶液，對(duì)空白樣品進(jìn)行10、50、100 ng/mL 3 個(gè)濃度的添加水平實(shí)驗(yàn)，樣品不添加蒽醌D8內(nèi)標(biāo)采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.564516x+0.001421，擬合度R2為0.9950，具體結(jié)果見表2。

在采用外標(biāo)曲線定量情況下，分別考察采用丙酮、空白基質(zhì)溶液配制9,10-蒽醌加標(biāo)濃度為10、50、100 ng/mL 的樣品，從表2 結(jié)果可以看出，它們?cè)诩訕?biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差方面相差不大，試驗(yàn)說明可以采用丙酮作為9,10-蒽醌標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制溶劑，其效果與采用空白基質(zhì)樣品配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不存在明顯差異。

2.5 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率和精密度

選取未檢出9,10-蒽醌的?？垺~版紙、特種紙、白紙板4 種茶葉包裝紙樣品，各稱取0.5 g 于500 mL 離心管中，分別添加質(zhì)量濃度為10、50、100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平取6 份平行樣，充分混勻后，按照最佳前處理和色譜分析條件進(jìn)行測(cè)定，回收率處于89.3%～98.7%范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.01%～4.42%，具體結(jié)果見表3；由于目前茶葉包裝紙中9,10-蒽醌檢測(cè)尚未有相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，參考茶葉中蒽醌檢測(cè)的進(jìn)口檢測(cè)方法SN/T 4777-2017,與試驗(yàn)方法做同樣的加標(biāo)回收試驗(yàn)，具體結(jié)果見表4。

表3 9,10-蒽醌加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation of 9,10-anthraquinone

表4 方法SN/T 4777-2017 試驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation of method SN/T 4777-2017 (n=6)

從以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，本文試驗(yàn)方法與參考方法SN/T 4777-2017 在加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差方面結(jié)果接近，表明該試驗(yàn)方法符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中回收率和精密度的要求[32]。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)采集市場(chǎng)銷售茶葉包裝紙20 份，其中牛卡紙、銅版紙、特種紙、白紙板各5 份。其中蒽醌檢出率9 份，檢出率45%。牛卡紙檢出率最高為60%，銅版紙檢出率最低為20%。通過實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果可以看出，茶葉包裝紙確實(shí)含有9,10-蒽醌污染物，存在遷移到茶葉的安全風(fēng)險(xiǎn)。本文的試驗(yàn)方法適用于茶葉包裝紙中9,10-蒽醌的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)四種常見茶葉包裝材質(zhì)?？垺~版紙、特種紙、白紙板進(jìn)行樣品前處理和色譜條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶葉常見四種包裝材料中9,10-蒽醌的測(cè)定。該方法在10～200 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.23249X+0.001203，擬合度R2為0.9989，方法檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，加標(biāo)回收率在89.3%～98.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.01%～4.42%，達(dá)到較好檢測(cè)效果。方法具有簡(jiǎn)單易操作、線性范圍寬、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足對(duì)茶葉中蒽醌污染源包裝紙中9,10-蒽醌的分析檢測(cè)要求，適用于茶葉包裝紙中蒽醌污染的監(jiān)測(cè)與控制。