雪櫻子石榴復(fù)合飲料研制及其抗運(yùn)動性疲勞作用

劉文靜

（天水師范學(xué)院，甘肅天水 741000）

雪櫻子（Amaranthus caudatusL.）為莧科莧屬草本植物，具有藥食兩用特性，因其富含多糖、皂苷、花青素等成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤和抗病毒等活性，而被廣泛用于保健食品[1?2]，目前國、內(nèi)外對其提取物的活性進(jìn)行了詳細(xì)研究，如Bruni 等[3]發(fā)現(xiàn)雪櫻子種子油內(nèi)維生素E、脂肪酸含量較高；Jo 等[4]發(fā)現(xiàn)其單寧提取物可清除氧自由基；Ashok Kumar 等[5]發(fā)現(xiàn)雪櫻子提取物可顯著降低體內(nèi)總膽固醇；而姚宏亮等[6]則發(fā)現(xiàn)雪櫻子多糖對羥自由基、DPPH 自由基的清除能力較強(qiáng)。

運(yùn)動性疲勞通常源于機(jī)體劇烈運(yùn)動后，產(chǎn)生的大量活性氧自由基，促使體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[7?8]，而體內(nèi)外源性補(bǔ)充運(yùn)動飲料，有助于緩解機(jī)體疲勞[9?10]。由于天然化合物的體、內(nèi)外活性高度相關(guān)[11]，而未有文獻(xiàn)公開探討雪櫻子的體內(nèi)抗疲勞活性，同時(shí)石榴汁常用于飲料調(diào)味[12?13]，為此本研究以雪櫻子多糖為原料，利用石榴汁改善風(fēng)味，研制雪櫻子石榴復(fù)合飲料，探討不同組分對飲料的品質(zhì)影響，并通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察其抗運(yùn)動性疲勞效果，從而為相關(guān)運(yùn)動食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪櫻子 南京繼紅農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；石榴、蔗糖 天水市羅峪果菜批發(fā)市場；檸檬酸 臨沂海星化工有限公司；羧甲基纖維素鈉 河北鴻韜生物工程有限公司；試驗(yàn)用水 蒸餾水；SPF 級健康雄性小鼠 80 只，體質(zhì)量15～25 g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供；血乳酸（BLA）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒 南京信帆生物有限公司。

TD-3002A 型電子天平 上海衡際科學(xué)儀器有限公司；PHS-3E 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；752 型紫外可見分光光度計(jì) 上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；YT-25 型高壓均質(zhì)機(jī) 浙江英拓機(jī)械科技有限公司；BKQ-B100II 型自動蒸汽滅菌器 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；ZX-2200DE 型超聲波器 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；BK-FD18P型真空冷凍干燥機(jī) 濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；TG16-WS 型高速臺式離心機(jī) 湖南湘儀檢測設(shè)備有限公司；動物恒溫游泳池 徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn) 參考文獻(xiàn)[6]操作，采用水提醇沉法制備雪櫻子多糖，具體如下：在質(zhì)量體積比1:20條件下，于95 ℃提取雪櫻子水溶液6 h 后，抽濾取濾液，加入80%乙醇溶液靜置12 h 后，離心（4000 r/min）10 min，沉淀經(jīng)冷凍干燥后，即得。

選取新鮮石榴取果后，加入至0.1% Vc 溶液護(hù)色，在質(zhì)量體積比1:4 下榨汁，經(jīng)過4 層紗布過濾即得石榴汁[14]。

10%雪櫻子多糖液與20%石榴汁按照一定體積比混合后，加入蔗糖、檸檬酸與羧甲基纖維素鈉，均質(zhì)（20 MPa、70 ℃）2 次，灌裝于玻璃瓶內(nèi)，于121 ℃滅菌5 min 即得[15]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察雪櫻子多糖液與石榴汁體積比、蔗糖量、檸檬酸量和羧甲基纖維素鈉量（相對雪櫻子多糖與石榴汁混合溶液）對復(fù)合飲料的感官品質(zhì)影響，具體如下：固定蔗糖量5%、檸檬酸量0.3%、羧甲基纖維素鈉量0.06%，分別考察雪櫻子多糖液與石榴汁體積比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）；固定雪櫻子多糖液與石榴汁體積比1:3、檸檬酸量0.3%、羧甲基纖維素鈉量0.06%，分別考察蔗糖量（1%、3%、5%、7%、9%）；固定雪櫻子多糖液與石榴汁1:3、蔗糖量5%、羧甲基纖維素鈉量0.06%，分別考察檸檬酸量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）；固定雪櫻子多糖液與石榴汁體積比1:3、蔗糖量5%、檸檬酸量0.3%，分別考察羧甲基纖維素鈉量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以雪櫻子多糖液與石榴汁體積比（A）、蔗糖量（B）、檸檬酸量（C）和羧甲基纖維素鈉量（D）為響應(yīng)因素，飲料的感官評分為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 軟件的Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)，確定復(fù)合飲料的各組分最佳參數(shù)，試驗(yàn)因素及水平見表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnken experimental

1.2.5 飲料感官品質(zhì)評價(jià) 根據(jù)雪櫻子石榴復(fù)合飲料的特性，并參考其它飲料的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，制定該復(fù)合飲料的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，見表2 所示，同時(shí)邀請10 位經(jīng)過食品感官技能培訓(xùn)人員，參照該標(biāo)準(zhǔn)，對飲料樣品進(jìn)行感官評價(jià)，最終評分取結(jié)果平均值。

表2 復(fù)合飲料感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of the composite beverage

1.2.6 理化與微生物指標(biāo)檢測

1.2.6.1 pH 采用pH 計(jì)檢測。

1.2.6.2 可溶性固形物 采用折光計(jì)檢測。

1.2.6.3 離心沉淀率 參考文獻(xiàn)[17]操作步驟，離心后檢測。

1.2.6.4 微生物指標(biāo) 參照GB 4789.1-2016 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)步驟[18]，分別檢測樣品的微生物菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌。

1.2.7 動物試驗(yàn)

1.2.7.1 動物分組與劑量設(shè)計(jì) 80 只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后（飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25 ℃，相對濕度：50%～70%），按體質(zhì)量隨機(jī)分為四組，即空白對照組和低、中、高劑量組，每組各20 只，根據(jù)《保健食品功能評價(jià)》要求，設(shè)計(jì)人體推薦攝入劑量的10、20、30 倍，作為低、中、高劑量組動物每日雪櫻子多糖攝入量，即0.10、0.20、0.30 mg/g?d，空白對照組則給予生理鹽水，各劑量組均按照0.2 mL/g 體重灌胃，全部動物每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[19?20]。

1.2.7.2 負(fù)重游泳試驗(yàn) 末次灌胃后，各組動物于鼠尾負(fù)重5%體重重物，置于（25±2）℃游泳池內(nèi)開展負(fù)重游泳試驗(yàn)，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時(shí)間[21]。

1.2.7.3 生化指標(biāo)檢測 末次灌胃結(jié)束后，各組剩余動物游泳30 min，取出擦凈，休息10 min 后，于眼底取血，離心，制備血清，照相關(guān)試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠血清中乳酸（BLA）與尿素氮（BUN）的含量[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，利用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05 判斷為差異顯著，P<0.01 判斷為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪櫻子多糖液與石榴汁體積比對飲料品質(zhì)影響

雪櫻子多糖液與石榴汁的不同體積比對飲料的感官評分影響，見圖1 所示。從圖1 可知，當(dāng)雪櫻子多糖液與石榴汁的體積比為1:3 時(shí)，飲料的感官得分最大，若比值過高，則樣品溶液中石榴香味不明顯，而石榴汁用量過多，又使得溶液光亮感不足，因此確定雪櫻子多糖液與石榴汁體積比1:2、1:3、1:4 作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖1 溶液體積比對飲料感官評分影響Fig.1 Effect of volume ratio of two solution on the sensory evaluation of beverage

2.2 蔗糖量對飲料品質(zhì)影響

不同蔗糖量對飲料的感官品質(zhì)影響，見圖2所示。從圖2 可知，隨著蔗糖用量的增多，樣品的感官得分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這歸因于蔗糖用量過少，樣品酸味過于突出，而用量過多又造成溶液甜度較高，因此選擇蔗糖用量3%、5%、7%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖2 蔗糖量對飲料感官評分影響Fig.2 Effect of sucrose amount on the sensory evaluation of beverage

2.3 檸檬酸量對飲料品質(zhì)影響

檸檬酸不僅作為矯味劑，可豐富飲料的口感，還起到抗氧化和調(diào)節(jié)溶液pH 的作用，有利于飲料長期穩(wěn)定存放[23]。不同檸檬酸用量對飲料的感官品質(zhì)影響，見圖3 所示。從圖3 可知，當(dāng)檸檬酸用量增至0.3%時(shí)，樣品的感官評分開始降低，這歸因于溶液的酸味過重，因此選擇檸檬酸的用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖3 檸檬酸量對飲料感官評分影響Fig.3 Effect of citric acid amounton the sensory evaluation of beverage

2.4 羧甲基纖維素鈉量對飲料品質(zhì)影響

雪櫻子多糖提取物和石榴汁中，仍存在部分纖維組織，使得飲料長期存放，可能出現(xiàn)明顯沉淀，甚至分層，因此利用羧甲基纖維素鈉，以提高溶液的穩(wěn)定

性[24]。不同羧甲基纖維素鈉用量對飲料的感官品質(zhì)影響，見圖4 所示。從圖4 可見，隨著羧甲基纖維素鈉用量的增多，樣品的感官評分逐漸增大，至0.06%后開始減小，這源于羧甲基纖維素鈉含量較多，將造成溶液黏度增大。因此選擇0.04%、0.06%、0.08%羧甲基纖維素鈉量作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖4 羧甲基纖維素鈉量對飲料感官評分影響Fig.4 Effect of sodium carboxymethyl cellulose amount on the sensory evaluation of beverage

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的RSM 分析試驗(yàn)，考察雪櫻子多糖液與石榴汁體積比（A）、蔗糖（B）、檸檬酸（C）及羧甲基纖維素鈉（D）用量對飲料的感官評分（Y）影響，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以感官評分為目標(biāo)函數(shù)，各參數(shù)編碼值的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=87.14+2.09A+1.84B+5.25C?1.40D?2.97AB+0.075AC+0.17AD?2.48BC+2.77BD+2.10CD?5.26A2?3.81B2?2.27C2?3.77D2，對該模型進(jìn)行顯著檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4。

從表4 可知，該回歸模型P<0.01，表明該模型回歸效果顯著，較好反映實(shí)際結(jié)果，R2=0.9295 顯示模型擬合值與實(shí)際結(jié)果高度相關(guān)，而失擬項(xiàng)P=0.3137>0.05 表明該模型方程不顯著，可準(zhǔn)確反映各因素與響應(yīng)值關(guān)系，一次項(xiàng)A、B、C 對飲料的感官得分影響均極顯著（P<0.01），D 影響顯著（P<0.05），二次項(xiàng)A2、B2、D2對飲料的感官得分影響也均極顯著（P<0.01），C2影響顯著（P<0.05），交互項(xiàng)AB、BC、BD 的影響均顯著（P<0.05），另從表4 中F值得到，各因素對飲料的感官得分影響順序?yàn)椋簷幟仕嵊昧浚–）>雪櫻子多糖液與石榴汁體積比（A）>蔗糖用量（B）>羧甲基纖維素鈉用量（D）。

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment

2.6 響應(yīng)曲面分析

圖5 為不同考察因素的交互作用對復(fù)合飲料的感官得分影響，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對感官評分影響越大[25]，當(dāng)圖5 中等高線橢圓度越大，表明兩個(gè)因素的交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著[26]，由方差分析與響應(yīng)面可知，溶液體積比與蔗糖量，蔗糖量與檸檬酸用量，檸檬酸用量與羧甲基纖維素鈉量和蔗糖量與羧甲基纖維素鈉量對飲料的感官評分影響顯著。

圖5 兩種因素交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of the interaction effect between two factors

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過對二次多項(xiàng)回歸擬合方程進(jìn)行極值分析，確定雪櫻子石榴復(fù)合飲料的組分最佳參數(shù)為：雪櫻子多糖液與石榴汁的體積比為2:5、蔗糖量4.5%、檸檬酸量0.4%、羧甲基纖維素鈉量0.06%。在該最佳條件下，復(fù)合飲料的感官評分為89.8 分，既與預(yù)測值90.5 分相近，也與實(shí)驗(yàn)9 結(jié)果相近，這歸因于單因素試驗(yàn)次數(shù)有限，表明該模型預(yù)測具有一定可靠性。

2.8 產(chǎn)品品質(zhì)結(jié)果

2.8.1 感官品質(zhì) 采用最佳組分參數(shù)制得的復(fù)合飲料呈紫紅色、色澤均一且光亮，口感酸甜適中，無異味，具有雪櫻子多糖與石榴果實(shí)的混合香味，靜置后未有明顯沉淀與分層。

2.8.2 理化與微生物指標(biāo) 在18 個(gè)月內(nèi)，該飲料的pH為4.8～5.9；可溶性固形物為8.2%～17.7%；離心沉淀率1.03%；菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，未檢出大腸桿菌和其它致病菌，符合運(yùn)動飲料國家標(biāo)準(zhǔn)[27]。

2.9 復(fù)合飲料對負(fù)重游泳時(shí)間影響

表5 為各組動物的力竭游泳時(shí)間，與空白對照組相比，各劑量組動物的力竭游泳時(shí)間，均明顯延長，其中低劑量組差異顯著（P<0.05），而中、高劑量組差異極顯著（P<0.01），表明雪櫻子石榴復(fù)合飲料有助于緩解機(jī)體疲勞，增強(qiáng)其運(yùn)動耐力，且在一定濃度范圍內(nèi)，與飲料的劑量呈正相關(guān)。

表5 復(fù)合飲料對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（n=10,x±SD）Table 5 Effect of composite beverage on exhaustive swimming time of mice (n=10,x±SD)

2.10 飲料對小鼠血清中乳酸與尿素氮含量影響

當(dāng)機(jī)體能量供給緊張時(shí)，血糖會發(fā)生無氧酵解，生成乳酸，而乳酸電離的氫離子使得肌肉與血液的pH 降低，從而阻礙神經(jīng)興奮的傳遞，產(chǎn)生機(jī)體疲勞[28]，同時(shí)體內(nèi)的蛋白質(zhì)與氨基酸也會加快分解，使得血清尿素氮含量急劇升高[29]，因此將動物運(yùn)動后血清中乳酸和尿素氮含量作為間接反映機(jī)體疲勞程度的指標(biāo)。

表6 為各組動物運(yùn)動后體內(nèi)的乳酸與尿素氮含量，從表6 可見，不同劑量組的動物體內(nèi)乳酸含量分別與空白對照組相較，分別下降7.8%、14.3%和28.4%，低劑量組差異顯著（P<0.05），而中、高劑量組差異極顯著（P<0.01）；同時(shí)不同劑量組的動物體內(nèi)尿素氮濃度分別與空白對照組相較，分別下降8.1%、18.1%和24.2%，低劑量組差異顯著（P<0.05），而中、高劑量組差異極顯著（P<0.01），因此可知，雪櫻子石榴復(fù)合飲料有助于加快運(yùn)動后體內(nèi)乳酸清除，并減少運(yùn)動時(shí)體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解。

表6 復(fù)合飲料對乳酸和尿素氮含量的影響（n=10， x±SD）Table 6 Effect of composite beverage on the content of BUN and BLA in mice (n=10,x±SD)

3 結(jié)論

本研究以雪櫻子多糖為原料，并與石榴汁復(fù)配，研制得到雪櫻子石榴復(fù)合飲料，發(fā)現(xiàn)其抗運(yùn)動性疲勞效果較好。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定雪櫻子石榴復(fù)合飲料的最佳配方參數(shù)，即雪櫻子多糖液與石榴汁的體積比為2:5、蔗糖量4.5%、檸檬酸量0.4%、羧甲基纖維素鈉量0.06%，制得飲料呈紫紅色、色澤均一且光亮，口感酸甜適中，無異味，具有雪櫻子多糖與石榴果實(shí)的混合香味，靜置后未有明顯沉淀與分層，感官評分89.8 分。從動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，雪櫻子石榴復(fù)合飲料可明顯延長動物的負(fù)重游泳時(shí)間，減少運(yùn)動時(shí)機(jī)體的乳酸累積，并減少體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解，可見其抗疲勞作用較好，有利于在相關(guān)食品領(lǐng)域推廣，但其在體內(nèi)的具體抗疲勞機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。