Box-Behnken 模型優(yōu)化水麻葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析

高林曉，馬文升，石慧麗，郭 蒙, ，楊再波

（1.黔南民族師范學院化學化工學院，貴州都勻 558000；2.貴州省高校民族藥用植物資源開發(fā)工程研究中心，貴州都勻 558000；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

水麻（Debregeasia orientalis）為蕁麻科苧麻屬落葉灌木，別名有柳莓、水麻桑、比滿、沙連泡等。水麻主要生長在山坡、溪谷、河流兩岸等潮濕地區(qū)，是我國西部與南部地區(qū)常見的一種藥食兩用的野生纖維植物，也是一種美麗的園林觀賞樹種[1?2]。其葉、根及根皮均可入藥，微苦、辛，平。有消積，解毒，祛風除濕、消腫活血、風濕痹痛、跌打骨折等功效[3]。葉還可做飼料，果子可供食用、釀酒等[4]。

王國良等[5]研究發(fā)現(xiàn)水麻果提取物經(jīng)純化后具有強抗腫瘤作用。水麻葉中含有黃酮類、酚酸類、萜類等化合物，具有抑制疼痛、腹瀉、抗腫瘤和抗菌等藥理活性[6?7]。黃酮類化合物是一些具有相似化學結構且廣泛存在于植物組織中的天然物質，常存在于植物的莖、葉、根、花和果實中，絕大多數(shù)黃酮類物質存在形式是與糖結合成苷類，其次是游離苷元，呈黃色或者淡黃色[8?10]。作為水麻葉中有效成分之一的黃酮類化合物，目前對其研究處于初步階段，尚未見有水麻葉中黃酮的提取報道。

作為現(xiàn)代提取法之一的超聲波提取法以其操作簡便、快速、提取率高、綠色環(huán)保等優(yōu)點，被廣泛用于黃酮類、酚酸類等物質的提取[11?13]。超聲波提取法是借助于超聲波的空化現(xiàn)象、熱效應和機械效應等作用破壞植物細胞組織，導致細胞壁破裂分解，另外超聲波提取樣品時，振動也會加速植物細胞內物質的擴散、釋放和溶解等，從而可提高黃酮類化合物的提取率[14]。本文采用超聲輔助提取水麻葉總黃酮，以總黃酮得率為考察指標，通過單因素和響應面試驗優(yōu)化水麻葉總黃酮提取工藝，同時對其抗氧化活性進行分析，以期為水麻自然資源的進一步研究和開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水麻葉 采自貴州省都勻市青云湖森林公園；蘆丁對照品（含量≥98%）、維生素C（VC，含量≥98%） 合肥博美生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ，含量≥99.0%） 阜陽曼林生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 合肥巴斯夫生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等 均為分析純。

T6 新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；KH2200DE 數(shù)控超聲波清洗器 上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水麻葉總黃酮提取工藝流程 水麻葉→曬干、粉碎、過篩→石油醚浸取→過濾→得濾渣→烘箱烘干（60 ℃）→稱樣0.5 g→超聲提取→離心→總黃酮提取液。

將曬干的水麻葉粉碎，過60 目篩，得水麻葉粉末，分別取10 g 水麻葉粉末5 份放入帶有具塞的250 mL 錐形瓶中，依次加200 mL 石油醚進行脫脂、脫色4 次，過濾，取水麻葉濾渣放置烘箱中烘干，常溫下冷卻后，混勻轉移到保鮮袋中備用[15]。稱取上述處理后的水麻葉粉末0.5 g 放置于25 mL 具塞比色管中。在一定乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度下（固定超聲功率為100 W）進行總黃酮的提取，待提取液冷卻到室溫，在4000 r/min 條件下離心5 min，上清液即為樣品提取液[16]。

1.2.2 單因素實驗設計 稱取0.5 g 水麻葉粉末5 份于具塞比色管中，固定液料比30:1 mL/g、超聲提取時間30 min、超聲溫度30 ℃，分別測定乙醇濃度在15%、30%、45%、60%、75%、90%時水麻葉中總黃酮得率。

稱取0.5 g 水麻葉粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇濃度45%、超聲提取時間30 min、超聲溫度30 ℃，分別測定液料比在10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 和60:1 mL/g 時水麻葉中總黃酮得率。

稱取0.5 g 水麻葉粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇濃度45%、液料比40:1 mL/g 和提取溫度30 ℃，分別測定超聲時間在15、30、45、60、75、90 min 時水麻葉中總黃酮得率。

稱取0.5 g 水麻葉粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇濃度45%、液料比40:1 mL/g 和超聲提取時間45 min，分別測定超聲溫度在20、30、40、50、60、70 ℃下時水麻葉中總黃酮得率。

1.2.3 響應面試驗設計 根據(jù)單因素實驗結果，以水麻葉總黃酮得率影響較大的水平作為參考。分別在乙醇濃度、液料比、超聲提取時間、超聲提取溫度4 因素的基礎上進行Box-Behnken 試驗設計，各因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 水麻葉總黃酮的測定

1.2.4.1 蘆丁標準曲線的制作 稱取真空干燥至恒重的蘆丁對照品0.0200 g，置100 mL 量瓶中，加3 mL 無水乙醇溶解，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL 蘆丁對照溶液。

分別取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0 mL 0.2 mg/mL 蘆丁對照溶液于25 mL具塞比色管中，分別加0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，后加4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻后靜置15 min后，在500 nm 測吸光度A[17?18]。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線回歸方程為：A=12.7856C?0.0291，R2=0.9987。

1.2.4.2 總黃酮得率的測定 向25 mL 具塞比色管中準確移取1.0 mL 樣品提取液，按照制作標準曲線的試驗方法測定其吸光度。依據(jù)下式計算樣品提取液中總黃酮提取率：

總黃酮得率（%）=（c×V×10?3）/m×100

式中：c：根據(jù)吸光度值和稀釋倍數(shù)計算出的樣品提取液中黃酮濃度，mg/mL；V：樣品提取液體積，mL；m：稱取水麻葉粉末質量，g。

1.2.5 總抗氧化性測定 取20 mmol/L FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ 鹽酸溶液和pH3.6 的300 mmol/L NaAc–HAc 緩沖溶液按照1:1:10 的體積比配制，得FRAP 工作液，后置于37 ℃水浴中備用。

將4 mmol/L FeSO4標準儲備液稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 等不同濃度FeSO4標準工作液。分別取200 μL FeSO4標準工作液、FRAP 工作液3.0 mL，蒸餾水1.9 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，混勻，37 ℃恒溫反應10 min。蒸餾水做空白對照，分別測定593 nm 處吸光度值[19]。

取最佳工藝條件下樣品提取液80 μL 于10 mL棕色容量瓶中，并加120 μL 蒸餾水稀釋，此時對應的水麻葉中總黃酮濃度為0.4 mg/mL。后按照上述方法測定，得到以FRAP 值表示的樣品總抗氧化能力，即由標準曲線算出對應的FeSO4濃度值后，換算為樣品的FeSO4當量（mmol/L）。1 FRAP 單位等于1 mmol/L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當于FeSO4的mmol/L 數(shù)。

1.2.6 DPPH 法抗氧化性測定 取0.75 mL 濃度為1.26×10?4mol/L 的DPPH 溶液與3.0 mL 無水乙醇混合、3.0 mL樣品提取液與0.75 mL 無水乙醇混合、3 mL 樣品提取液與0.75 mL 1.26×10?4mol/L DPPH溶液混合，分別在37 ℃下靜置30 min，并以無水乙醇為空白，在517 nm 波長處測吸光度值，記為A0、Aj、Ai[20]。

DPPH 自由基清除率計算公式為：DPPH 自由基清除率（%）=[1?(Ai?Aj)/A0]×100。

同時，用上述的方法測定不同濃度VC的DPPH清除能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)重復測定三次，取平均值，并采用Microsoft Office Excel 2007、Design Expert 11.0 及Origin 8.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)的處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對水麻葉中總黃酮得率的影響 圖1實驗結果可知，乙醇濃度在45%時，水麻葉中總黃酮的得率最高?？赡苁且驗橐掖紳舛仍?5%時，溶液極性與水麻葉中黃酮類化合物相似，適宜其黃酮類化合物的溶出，而其他乙醇濃度時，極性相差大，黃酮類化合物溶出量少，或者其他雜質成分溶出量大都會導致水麻葉中總黃酮的量減少，從而黃酮得率下降[21]。由此選擇乙醇濃度35%、45%、55%作為響應面分析的三個水平。

圖1 乙醇濃度對水麻葉中總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.2 液料比對水麻葉中總黃酮得率的影響 圖2實驗結果可知，液料比在10:1～40:1 mL/g 之間，水麻葉中總黃酮得率呈上升趨勢；液料比在40:1～60:1 mL/g 之間，水麻葉中黃酮得率反而下降；液料比40:1 mL/g 時水麻葉中總黃酮得率最高?？赡苁且驗殡S著45%乙醇溶液用量的增加，有利于水麻葉中黃酮類化合物的溶出，當液料比繼續(xù)增加大于40:1 mL/g 時，會導致其他醇溶類雜質的析出，所以水麻葉中黃酮類化合物的得率反而下降[21?22]。由此選擇液料比30:1、40:1、50:1 mL/g 作為響應面分析的三個水平。

圖2 液料比對水麻葉中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.3 超聲時間對水麻葉中總黃酮得率的影響 圖3實驗結果可知，超聲時間在15～90 min 范圍內，水麻葉中總黃酮得率呈先上升后下降趨勢，超聲時間45 min 時水麻葉中總黃酮得率出現(xiàn)峰值?？赡苁请S著超聲時間的延長，細胞內黃酮類物質充分與乙醇溶劑接觸，有利于黃酮類化合物溶出，黃酮得率增大，但超聲提取時間過長，則會導致其他非黃酮類活性物質溶出，或者部分黃酮類化合物發(fā)生分解，總黃酮得率下降[23]。由此選擇超聲提取時間35、45、55 min 作為響應面分析的三個水平。

圖3 超聲時間對水麻葉中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.4 超聲溫度對水麻葉中總黃酮得率的影響 圖4實驗結果可知，當超聲溫度從20 ℃上升到60 ℃時，水麻葉中總黃酮得率一直在增加，60 ℃時水麻葉中總黃酮得率最大；隨著溫度繼續(xù)升高水麻葉中總黃酮得率反而下降?？赡苁且驗槌暅囟冗m當提高可增強分子的滲透能力，有利于黃酮類化合物的溶出，但在溫度稍高的狀態(tài)下，一方面增大了反應體系中可溶性蛋白質的變性，使得整個體系的黏度增加，降低了黃酮類物質的溶出[24]；另一方面溫度過高會導致部分黃酮類化合物結構不穩(wěn)定分解，且溶液中雜質的溶出量也會增大，從而黃酮類物質的得率降低[25]。由此選擇超聲溫度50、60、70 ℃作為響應面分析的三個水平。

圖4 超聲溫度對水麻葉中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果 以水麻葉總黃酮的得率為評價指標的響應值，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）進行4 因素3 水平Box-Behnken 試驗的優(yōu)化設計，獲取最佳提取水麻葉總黃酮的條件。Box-Behnken 試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.2 Box-Behnken 試驗回歸模型的建立及方差分析 以水麻葉中總黃酮得率為響應值評價指標，采用軟件Design-Expert.V11 對表2 進行回歸擬合統(tǒng)計分析，得到總黃酮得率（Y）的回歸方程：Y（%）=?42.82196+0.37707A+0.37197B+0.47548C+0.53745D?2.5×10?5AB?4.0×10?4AC+4.0×10?4AD+7.5×10?5BC?7.5×10?5BD?4.0×10?4CD?4.46833×10?3A2?4.34333×10?3B2?4.64333×10?3C2?3.74333×10?3D2，方程中各項系數(shù)絕對值的大小表示此因素對總黃酮得率的影響，方程中各項系數(shù)的正負表示影響的方向[26]。

由表3 方差分析，模型的P值<0.0001，說明總黃酮得率與各自變量之間的回歸關系極顯著，回歸方程能較好地模擬真實曲面[27]。失擬項P=0.3996>0.05，影響不顯著，說明該試驗模型與回歸方程擬合度良好，試驗數(shù)據(jù)和模型相符合的程度顯著，可用此模型對水麻葉總黃酮得率試驗進行分析和預測，且真實可靠。且決定系數(shù)R2=0.9947，調整決定系數(shù)Radj2=0.9893，表明此模型可用來解釋98.93%總黃酮得率的變化，且兩系數(shù)相差不大，說明此模型擬合程度高，誤差小[28]，可用于水麻葉總黃酮得率的評價和分析。另外，A、B、C、D 一次項對總黃酮得率差異影響極顯著（P<0.01）；AB、AC、AD、BC、BD、CD 交互項對總黃酮得率差異影響不顯著（P>0.05）；A2、B2、C2、D2二次項對其影響極顯著（P<0.01）。F值大小可以判斷，四個因素對水麻葉總黃酮得率影響程度的大小為D（超聲溫度）>B（液料比）>A（乙醇濃度）>C（超聲時間）。

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis variance

2.2.3 響應面試驗中交互項作用分析 響應面試驗中兩因素交互項3D 圖曲面的變化和等高線的變化見圖5，3D 曲面圖弧度變化越陡峭，等高線越密集且呈橢圓形或馬鞍形時，且坡度、橢圓弧度越大，表示兩因素之間交互作用越顯著[29]。兩因素對水麻葉總黃酮得率影響越大。從圖5 可知，6 組等高線較密集且基本上呈圓形，6 組交互項3D 曲面坡度變化都比較平緩，說明總黃酮得率對該因素的變化不敏感，所以6 組因素對總黃酮得率的交互作用影響不顯著，這與表3 方差分析的結果相一致。

圖5 交互項對水麻葉總黃酮得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of interactive items on the yield of total flavonoids in the Debregeasia orientalis leaves

2.2.4 工藝優(yōu)化條件驗證 以水麻葉總黃酮得率為評價指標，通過Box-Behnken 模型優(yōu)化分析得到提取水麻葉總黃酮最佳工藝的乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度分別為35%、42.52 mL/g、47.03 min、70 ℃。相應的水麻葉總黃酮得率預測值為3.13%。但考慮到實際操作的方便可行性，把最佳工藝條件最終調整為乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度分別為35%、42 mL/g、47 min、70 ℃。且三次平行試驗驗證得到水麻葉總黃酮得率為3.15%±1.82%，試驗結果表明此提取工藝實測值與預測值相近，具有一定的實際應用價值。

2.3 總抗氧化性測定結果

FeSO4當量值大小可衡量樣品總抗氧化活性的高低。最佳工藝條件下樣品提取液的抗氧化性能換算為FeSO4當量值為1.969 mmol/L（據(jù)方程Y=0.7365X+0.0709（r=0.9982）），即此時樣品的抗氧化能力與1.969 mmol/L 的FeSO4是相當?shù)摹Ｒ虼?，提取物總黃酮展現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

2.4 DPPH 法抗氧化性測定結果

由圖6 可知，隨著總黃酮濃度從0.025 增加到0.10 mg/mL 時，其對應的DPPH 自由基的清除率從24.8%迅速地增加到64.2%，而濃度再繼續(xù)增加到0.20 mg/mL 時，其值緩慢地增大到71.4%。但是，隨著濃度繼續(xù)增加時，清除率的值的變化的幅度比較小，最終基本保持恒定到77.4%。VC和提取液DPPH自由基清除能力的IC50分別為0.036 和0.075 mg/mL。由此可見，提取物黃酮類化合物可展現(xiàn)出好的清除作用[30]。

圖6 DPPH 自由基清除作用Fig.6 Scavenging effect on DPPH free radical

3 結論

經(jīng)過單因素實驗優(yōu)化分析結果，確定了Box-Behnken 模型的四因素三水平組合。經(jīng)Box-Behnken模型試驗優(yōu)化，得到水麻葉總黃酮最佳提取條件的調整理論值，即乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度分別為35%、42 mL/g、47 min、70 ℃。FRAP 和DPPH 法測定結果表明水麻葉提取液中總黃酮具有較好的體外抗氧化活性及清除自由基能力。

本研究結果可為水麻質量標準建立提供理論上的數(shù)據(jù)支撐，還可為水麻這種野生植物資源的開發(fā)利用提供工藝方面的技術支持。此后還需對水麻葉中黃酮類化合物進行純化和結構鑒定，并進一步研究黃酮類物質結構與抗氧化活性的關系。