新橙皮苷對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制

郭莉霞，孔淑貞，殷鐘意，鄭旭煦

（天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室，重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067）

通常肥胖引發(fā)的代謝綜合征相關(guān)并發(fā)癥的集合會顯著增加心血管疾病和死亡的風(fēng)險[1?3]。肥胖在細(xì)胞水平上的特征是脂肪組織中從前脂肪細(xì)胞分化出的脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和脂肪細(xì)胞體積的增大，而抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化可以減少脂肪組織的質(zhì)量，從而減少肥胖的發(fā)生[4]。

脂肪細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的過程。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖激活受體家族（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族（CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs）是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子[5]，其中PPARγ具有脂肪組織特異性，通過與配體結(jié)合被激活后再與受體結(jié)合形成PPAR-RXR 異二聚體，進(jìn)一步同反應(yīng)元件結(jié)合后激活靶基因，最終導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化成熟，而C/EBPα與PPARγ能互相激活，促進(jìn)PPARγ高表達(dá)，保持分化細(xì)胞的表型。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB/Akt）在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。胰島素信號通過磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活A(yù)kt，誘導(dǎo)下游靶點糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase3β，GSK3β）的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而磷酸化C/EBPβ、C/EBPα和糖原合成酶（Glycogen synthase，GS），進(jìn)一步抑制脂肪細(xì)胞分化[6?7]。

新橙皮苷（Neohesperidin）是一種具有強烈苦味的黃酮類化合物，廣泛存在于酸橙（Citrus aurantium）、甜橙（Citrus Sinensis）、枳實（Fructus aurantii immaturus）、枳殼（Bitter OrangeFructus aurantii）等食藥蕓香科植物和茜草科植物中[8]。近年來越來越多的藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷能抑制心肌肥厚和重構(gòu)[9]，抑制過敏反應(yīng)[10]，減輕肺纖維化[11]，能抗衰老，延長釀酒酵母壽命[12]，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[13?14]，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[15]，改善骨質(zhì)疏松[16?17]等。另外在調(diào)節(jié)脂質(zhì)方面，新橙皮苷在加入游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）的肝細(xì)胞中表現(xiàn)出較強的降血脂作用，并逆轉(zhuǎn)急性或慢性血脂異常小鼠的脂質(zhì)病變[18]，新型新橙皮苷二氫查耳酮類似物還能通過Nrf2 途徑抑制人脂肪來源干細(xì)胞的成脂分化[19]。這些結(jié)果顯示，新橙皮苷具有潛在的抗高血脂的活性。本研究在此基礎(chǔ)之上，探討新橙皮苷對脂肪細(xì)胞脂肪形成的影響及其作用機(jī)制，為新橙皮苷的減重/減脂機(jī)制提供了理論上的支撐，并為膳食補充劑的實際應(yīng)用提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠胚胎成纖維3T3-L1 細(xì)胞株（前脂肪細(xì)胞） 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；新橙皮苷（純度≧90%）、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松、LiCl（純度≧99%） 美國Sigma‐Aldrich 公司；CellTiter 96 AQueous 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑（MTS） 美國Promega 公司；DMEM 培養(yǎng)基 美國Hycolon 公司；胎牛血清 以色列BI 公司；甘油三酯檢測試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PPARγ單克隆抗體、C/EBPα單克隆抗體、磷酸化Akt（Ser473）單克隆抗體、磷酸化GSK3β（Ser9）單克隆抗體、GS 單克隆抗體、磷酸化GS（Ser641）單克隆抗體 美國CST 公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 美國Invitrogen 公司；PCR 試劑盒 TIANGEN 公司。

HERAcell 二氧化碳培養(yǎng)箱 150i 美國Thermo Fisher 公司；Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；Bio-RadChemiDoc XRS 系統(tǒng)、BIO-RAD CFX96熒光定量PCR 儀 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞活力檢測 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞于高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，5% CO2、37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取對數(shù)生長期的3T3-L1 細(xì)胞（5×104個/mL）接入到96 孔板中，細(xì)胞過夜培養(yǎng)約16～20 h，加入終濃度為1、10、50、100、200 μmol/L 的新橙皮苷作用8 d 后[4]，根據(jù)CellTiter 96 AQueous 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑（MTS）說明書操作，每孔加入20 μL MTS 試劑，然后在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，最后于490 nm 波長處讀取吸光度值，測定細(xì)胞活力[20]。

1.2.2 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 根據(jù)實驗方案，共分為5 組，分別為對照組（正常DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、分化液組（含分化液的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、羅格列酮組（含分化液的DMEM 培養(yǎng)基+1.5 μmol/L 羅格列酮培養(yǎng)）、新橙皮苷組（含分化液的DMEM 培養(yǎng)基+1 或10 μmol/L 新橙皮苷培養(yǎng)）。

根據(jù)文獻(xiàn)[21]報道，具體方法為取對數(shù)生長期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞（5×105個/mL）接入到6 孔板中，待細(xì)胞完全融合2 d 后，換成分化液培養(yǎng)基（含5 μg/mL 胰島素、0.5 mmol/L IBMX 和1 mmol/L 地塞米松的DMEM 培養(yǎng)基），在5% CO2、37 ℃下孵育2 d，然后換用只含有5 μg/mL 胰島素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2 d，隨后再換用正常DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2 d 換培養(yǎng)基1 次，培養(yǎng)4 d，即共誘導(dǎo)分化8 d。在開始誘導(dǎo)細(xì)胞分化的同時，陽性藥物羅格列酮（1.5 μmol/L）和不同濃度的新橙皮苷（1、10 μmol/L）被加入到分化培養(yǎng)基中，直到實驗結(jié)束。

當(dāng)考察Akt/GSK3β信號通路在新橙皮苷抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化中的作用時，在加入新橙皮苷的同時加入GSK3β 抑制劑（20 mmol/L LiCl），其它培養(yǎng)步驟同上，共孵育8 d 后再進(jìn)行相關(guān)檢測[22]。

1.2.3 油紅O 染色 經(jīng)8 d 誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞用生理鹽水輕柔地漂洗2 次，空氣中晾干，用4%甲醛固定1 h，然后加入0.6%（w/v）油紅O 染液（60%異丙醇和40%水配制）繼續(xù)染色1 h，接著用60%異丙醇漂洗細(xì)胞3 次，洗掉未著色的染料后，顯微鏡下拍照。拍照完畢后，用4%的NP-40 溶解胞內(nèi)被油紅O 染色的脂肪滴，充分溶解后，于490 nm 波長處讀取吸光度值。

1.2.4 甘油三酯含量測定 經(jīng)8 d 誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞用冰生理鹽水輕柔地漂洗2 次，然后收集細(xì)胞，每孔加入200 μL 生理鹽水，50 W 超聲裂解1 min，在4 ℃轉(zhuǎn)速為13000×g 離心20 min，收集上清液。按照甘油三酯含量檢測試劑盒操作說明檢測。

1.2.5 RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) 參照文獻(xiàn)[23]報道，3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，收集細(xì)胞，用Trizol 提取細(xì)胞總RNA，取1 μg 總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列如下：PPARγ，forward 5′‐TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3′，reverse 5′-AATC CTT GGCCCTCTGAGAT-3′；C/EBPα，forward 5′-GAACAGCAACGAGTACCGGGTA-3′，reverse 5′-CCATGGCCTTGACCAAGGAG-3′；aP2，forward 5′-AACACCGAGATTTCCTTCAA-3′，reverse 5′-TCA CGCCTTTCATAACACAT-3′；β‐actin，forward 5′-G ACAACGGCTCCGGCATGTGCAAAG‐3′，reverse 5′-TTCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAG‐ 3′。循環(huán)參數(shù)為先在95 ℃時5 min，然后再按照以下條件進(jìn)行35 個循環(huán)，參數(shù)為95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃45 s，最后72 ℃延長5 min。

1.2.6 Western blot 蛋白印跡檢測蛋白表達(dá) 參照文獻(xiàn)[24]報道，3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，收集細(xì)胞，用pH 為7.4 的PBS 漂洗2 次，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解30 min，二喹啉甲酸法測定總蛋白質(zhì)濃度，每孔上樣總蛋白質(zhì)量為10～20 μg，經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白到PVDF 膜，封閉液封閉后，加入各蛋白一抗抗體（Akt、p-Akt、PPARγ、C/EBPα、p-GS、GS、p-GSK3β、GSK3β和aP2），室溫孵育2 h，漂洗3 次后，再加入HRP 標(biāo)記的二抗，繼續(xù)室溫孵育2 h，漂洗3 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯影，Quantity One 軟件分析蛋白印跡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析使用Origin 8.0 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用ANOVA 檢驗，實驗數(shù)據(jù)均以表示，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 新橙皮苷對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示，不同濃度新橙皮苷（1、10、50、100、200 μmol/L）作用3T3-L1 前脂肪細(xì)胞8 d 后，與對照組（新橙皮苷濃度為0 μmol/L 組）相比較，細(xì)胞活力均無顯著性改變（P>0.05），提示本實驗中直到新橙皮苷作用最大濃度為200 μmol/L 時，脂肪細(xì)胞的完整性仍未被損傷。因此，在后續(xù)實驗中，采用小于200 μmol/L 的新橙皮苷進(jìn)行脂肪細(xì)胞分化研究。

圖1 新橙皮苷對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞活力的影響（n=8）Fig.1 Effect of neohesperidin on 3T3-L1 cell viability（n=8）

2.2 新橙皮苷對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

按照實驗方法對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞進(jìn)行8 d分化誘導(dǎo)，考察新橙皮苷在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的影響。油紅O 染色結(jié)果如圖2A 所示，相對于無分化液組（對照組）比較，分化液組及陽性對照羅格列酮組的脂肪細(xì)胞變大，胞內(nèi)脂滴含量明顯增加。而加入了不同濃度（1 和10 μmol/L）的新橙皮苷組脂滴含量較分化液組明顯減少，脂肪細(xì)胞的分化呈劑量依賴性地明顯降低。通過對分化細(xì)胞油紅O 染色后進(jìn)行OD 值檢測，定量分析胞內(nèi)脂肪的含量，如圖2B 所示，可以看出，與分化液組相比較，10 μmol/L 新橙皮苷抑制分化率達(dá)到了25%。這些結(jié)果進(jìn)一步通過胞內(nèi)甘油三酯含量分析來證實，如圖2C 結(jié)果所示，與分化液組比較，10 μmol/L 新橙皮苷組內(nèi)甘油三酯的的含量減少了33%。提示新橙皮苷能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化并抑制胞內(nèi)脂質(zhì)積累。

圖2 新橙皮苷對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響（n=5）Fig.2 Neohesperidin inhibits adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells (n=5)

2.3 新橙皮苷對誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

為了研究新橙皮苷對脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，本研究檢測了Akt/GSK3β信號通路中Akt、GSK3β以及GS 磷酸化水平以及下游轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα和aP2 mRNA相對表達(dá)量變化。如圖3A 的RT-PCR 分析顯示，分化液組中3T3-L1 前脂肪細(xì)胞完全分化后PPARγ、C/EBPα及aP2 的mRNA 表達(dá)增加，而新橙皮苷極顯著降低了相應(yīng)基因的表達(dá)（P<0.01），相對于分化液組，1 和10 μmol/L 新橙皮苷對PPARγmRNA 的表達(dá)分別降低了22%和69%，對C/EBPαmRNA 的表達(dá)分別降低了15%和39%，同時對aP2 mRNA 的表達(dá)分別降低了27%和44%。

Akt 信號通路，在胰島素信號通路中，尤其是在脂肪細(xì)胞的分化過程中起到非常重要的作用[25]。為了闡明對新橙皮苷的作用及其抑制脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制，通過western blotting 方法檢測了Akt 及其底物GSK3β和GS 的磷酸化表達(dá)水平。從圖3B～圖3E中可以看出，新橙皮苷降低了GS 的磷酸化水平，但增加了Akt 和GSK3β 的磷酸化，說明新橙皮苷激活了Akt 通路，降低了GSK3β的活性。

2.4 Akt/GSK3β 信號通路在新橙皮苷抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化中的作用

圖3 顯示，新橙皮苷降低了脂肪分化相關(guān)蛋白PPARγ、C/EBPα以及aP2 的mRNA 的表達(dá)，也同時抑制了Akt 信號通路中GSK3β的活性。據(jù)此，進(jìn)一步探討新橙皮苷抑制脂肪細(xì)胞分化和PPARγ表達(dá)是否與影響了GSK3β活性有關(guān)。為了證實GSK3β的作用，將3T3-L1 細(xì)胞與新橙皮苷和GSK3β抑制劑（LiCl）共孵育8 d[22]。圖4A～圖4C 顯示，與LiCl共處理后，新橙皮苷介導(dǎo)的對脂肪細(xì)胞分化的抑制有拮抗作用。與這些結(jié)果一致的是，LiCl 也減少了新橙皮苷誘導(dǎo)的脂肪分化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的抑制作用，包括PPARγ、C/EBPα、aP2 以及p-GS（圖4D～圖4H）。以上結(jié)果提示，新橙皮苷對脂肪細(xì)胞分化的抑制作用部分是通過抑制GSK3β蛋白活性來調(diào)控的。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，新橙皮苷能抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化并抑制胞內(nèi)脂質(zhì)積累，這種抑制作用可能是通過激活A(yù)kt/GSK3β信號通路從而抑制脂肪分化相關(guān)蛋白表達(dá)而實現(xiàn)的。

有研究表明，新橙皮苷有較好的調(diào)節(jié)脂質(zhì)的能力，在加入游離脂肪酸（FFAs）的HepG2 肝細(xì)胞中表現(xiàn)出較強的降血脂作用，逆轉(zhuǎn)了由蛋黃誘導(dǎo)的急性或慢性血脂異常小鼠的脂質(zhì)病變，明顯改善肥胖模型DIO 小鼠血漿、肝臟和腓腸肌的脂質(zhì)含量，并顯著減輕了肥胖小鼠的體重[18]。但是新橙皮苷對脂肪細(xì)胞脂肪形成的影響及其作用機(jī)制還不清楚。本研究首先在3T3-L1 前脂肪細(xì)胞上檢測了新橙皮苷對前脂肪細(xì)胞分化的影響，結(jié)果證實新橙皮苷能夠部分抑制前脂肪細(xì)胞分化和胞內(nèi)脂質(zhì)積累，并且顯著降低與脂肪細(xì)胞分化和脂肪積累密切相關(guān)的PPARγ和C/EBPα的mRNA 的表達(dá)。另外，PPARγ能調(diào)節(jié)控制脂肪生成過程，上調(diào)下游脂肪生成和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因aP2[26]。研究了新橙皮苷對PPARγ的靶基因aP2 的調(diào)節(jié)作用。新橙皮苷劑量依賴性下調(diào)分化的3T3-L1 細(xì)胞中aP2 mRNA 表達(dá)。由此可見，新橙皮苷在3T3-L1 細(xì)胞中是通過抑制PPARγ表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)aP2 的表達(dá)來抑制脂肪形成的。

Akt 信號通路在調(diào)節(jié)脂肪形成中起重要作用[27?28]。GSK3β 蛋白是Akt 信號通路的下游蛋白，是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白。在Akt 信號通路中，脂肪形成的調(diào)控是通過減少GSK3β 蛋白磷酸化水平，增加GSK3β 的活性，從而導(dǎo)致PPARγ、C/EBPα蛋白表達(dá)增加促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[29]。有研究報道GSK3β蛋白激酶過度活躍與一些代謝紊亂有關(guān)，如2 型糖尿病和肥胖[30]。結(jié)合這些文獻(xiàn)報道及新橙皮苷對3T3-L1 細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的抑制作用，推測新橙皮苷通過靶向作用上游Akt/GSK3β及下游PPARγ信號通路來降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷級聯(lián)增加了p-Akt（活性形式）和p-GSK3β（非活性形式）的含量，抑制了下游PPARγ、C/EBPαmRNA 表達(dá)和p-GS 的含量。這個結(jié)果提示Akt/GSK3β信號通路有可能參與了新橙皮苷對脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。通過GSK3β特異性的抑制劑LiCl 證實了這個假設(shè)，新橙皮苷對脂肪細(xì)胞分化的抑制作用被與LiCl 共孵育得到部分逆轉(zhuǎn)，而且LiCl 也抑制了新橙皮苷降低脂肪分化相關(guān)蛋白的作用，包括PPARγ、C/EBPα、aP2 和p-GS。因此，Akt/GSK3β信號通路在新橙皮苷抑制脂肪形成中起重要作用。

圖3 新橙皮苷對誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of neohesperidin on the expression of mRNA and protein of adipogenic-specific genes during the differentiation of adipocyte

圖4 Akt/GSK3β 信號通路在新橙皮苷抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化中的作用（n=5）Fig.4 Akt/GSK3β is critical for the inhibition of neohesperidin-induced adipocyte differentiation (n=5)

綜上所述，新橙皮苷可通過激活A(yù)kt/GSK3β 信號通路，增加GSK3β磷酸化水平，抑制其活力，進(jìn)而減少下游脂肪分化相關(guān)蛋白PPARγ、C/EBPα、aP2的表達(dá)，減少脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)積累，抑制脂肪細(xì)胞分化（圖5）。本實驗在細(xì)胞水平初步評價了新橙皮苷的降脂效果，并探討了其作用機(jī)制，為研究新橙皮苷在功能食品中的作用提供了一定的依據(jù)，但存在一定的局限性。進(jìn)一步的實驗可在動物水平研究其降脂減脂的效果以及在功能食品中的劑量設(shè)計，為新橙皮苷的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

圖5 新橙皮苷抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖Fig.5 Schematic diagram showing the inhibitory effect of neohesperidin on 3T3-L1 adipocyte differentiation