NaCl 脅迫對(duì)西蘭花芽苗葉黃素積累及抗氧化能力的影響

周芷亦，何偉偉，李大婧, ，符 群, ，包怡紅，肖亞冬，羅 浩，徐 昊，宋江峰，張鐘元

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

西蘭花（Brassica oleraceaL.var.italicaPlenck）又名西藍(lán)花、青花菜、綠花菜等，作為十字花科蕓薹屬類(lèi)甘藍(lán)種的一個(gè)變種，富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及抗壞血酸、總酚、類(lèi)胡蘿卜素、硫代葡萄糖苷等生物活性物質(zhì)，其在預(yù)防癌癥方面具有積極的作用[1]，被譽(yù)為“蔬菜皇后”[2]，因而近年來(lái)被廣泛開(kāi)發(fā)研究。葉黃素隸屬于類(lèi)胡蘿卜素，是一種天然的色素，人類(lèi)無(wú)法自身合成，需通過(guò)食物供給滿(mǎn)足機(jī)體需要。它是一種重要的膳食抗氧化劑，具有保護(hù)眼睛、預(yù)防疾病、抗癌等多種生理功能，也可作為著色劑應(yīng)用于醫(yī)療及生產(chǎn)行業(yè)[3?4]。

綠色蔬菜是葉黃素的一大重要來(lái)源，有研究報(bào)道西蘭花中主要類(lèi)胡蘿卜素有葉黃素、β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)[5]，其中葉黃素含量占總類(lèi)胡蘿卜素的50%以上[6]。此外葉黃素與高等植物的抗氧化系統(tǒng)也存在著聯(lián)系，李諾等[7]從黃秋葵葉中提取的葉黃素具有較好的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力。同時(shí)，種子發(fā)芽是一種有效積累植物體內(nèi)活性物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的重要手段，發(fā)芽不僅會(huì)改變種子的形態(tài)，還會(huì)在其內(nèi)部不斷合成新的物質(zhì)，這在豆類(lèi)、谷物、蔬果、花卉中均被得到證實(shí)[8?9]。研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫作為最常見(jiàn)的非生物脅迫方式，可以有效促進(jìn)植物發(fā)芽過(guò)程中化合物的合成和積累[10]。逆境下種子的生長(zhǎng)會(huì)首先受到延緩或抑制，進(jìn)而產(chǎn)生應(yīng)激效應(yīng)，導(dǎo)致其內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生變化，田璐等[11]發(fā)現(xiàn)160 mmol/L NaCl 處理會(huì)顯著抑制西蘭花芽苗生長(zhǎng)，但其硫苷和異硫氰酸鹽含量均顯著提高，在甘藍(lán)芽苗中160 mmol/L NaCl 也有效促進(jìn)了抗壞血酸和類(lèi)胡蘿卜素的積累[12]，據(jù)Ariviani 等[13]報(bào)道，NaCl 濃度越大對(duì)豇豆芽苗生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)，然而其總酚含量、DPPH 自由基清除力及鐵還原能力呈逐漸升高的趨勢(shì)。蕎麥芽苗雖在50 mmol/L 的低鹽脅迫下被延緩生長(zhǎng)，但其內(nèi)部類(lèi)胡蘿卜素和酚類(lèi)物質(zhì)含量得到顯著提高[14]。以上研究說(shuō)明適宜濃度的NaCl 脅迫處理有助于芽苗中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集和抗氧化活性的提高。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)葉黃素等類(lèi)胡蘿卜素的需求明顯增加，而西蘭花芽苗中含有豐富的葉黃素等生物活性物質(zhì)。因此探索一種可以提高西蘭花芽苗中葉黃素含量的新途徑變得至關(guān)重要。目前有關(guān)西蘭花的研究多集中于硫苷及蘿卜硫素的積累鑒定與功能分析，但鮮有關(guān)于其芽苗期葉黃素的富集研究，因此本研究通過(guò)向西蘭花種子外源施用不同濃度的NaCl 溶液，以探究鹽脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗的生長(zhǎng)狀況、重量、含水率、可溶性蛋白、還原糖、丙二醛、脯氨酸、葉黃素含量及抗氧化能力的影響，為通過(guò)NaCl 脅迫西蘭花種子萌發(fā)來(lái)提高葉黃素含量提供了新的方式，為開(kāi)發(fā)功能性西蘭花芽苗食品提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

西蘭花種子 品種為“青峰”，2018 年10 月由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，并已經(jīng)過(guò)西蘭花育種專(zhuān)家嚴(yán)繼勇研究員監(jiān)定，種子用錫箔袋包裝并儲(chǔ)藏于4 ℃?zhèn)溆?；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品 生化試劑，Sigma 公司；黃嘌呤氧化酶 生化試劑，南京建成生物研究所；甲醇、甲基叔丁基醚 色譜純，Tedia 公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、亮氨酸 分析純，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽 分析純，阿拉丁（上海）有限公司；正己烷、丙酮、甲苯、愈創(chuàng)木酚、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、鹽酸羥胺、氯化亞錫 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LBI-150 生化培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；微孔板分光光度計(jì)Epoch BioTek Instruments；BS-224-S 電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；UV-6300 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；B-220 恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；D10 氮?dú)獯祾邇x 杭州奧盛儀器有限公司；FW100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇顆粒飽滿(mǎn)、大小均勻、具有發(fā)芽能力的西蘭花種子為原料。除雜、篩選后用蒸餾水沖洗后，置于0.5% NaClO 溶液中浸泡15 min，用蒸餾水沖洗5 次至溶液pH 呈中性，最后浸泡于蒸餾水中，在30 ℃下放置4 h。將浸泡后的西蘭花種子濾干后均勻散落在鋪有蛭石的發(fā)芽盤(pán)上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，在光周期為16 h 光照/ 8 h 黑暗條件下發(fā)芽。用蒸餾水噴施催芽1 d 后開(kāi)始計(jì)時(shí)，樣品組每隔12 h 噴施20 mL 不同濃度的NaCl 溶液（50、100、150、200、250、300 mmol/L），對(duì)照組每隔12 h噴施20 mL 蒸餾水，分別于第2、4 d 收獲芽苗（預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得第6 d 收獲的芽苗中葉黃素含量較第4 d 差異不大，為了短時(shí)高效提高芽苗產(chǎn)量及葉黃素含量，故選擇發(fā)芽2、4 d 繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），沖洗干凈并用濾紙吸干水分，一部分樣品保存于?80 ℃冰箱中用于測(cè)定干重、鮮重、含水率、丙二醛含量及抗氧化活性，另一部分樣品經(jīng)真空冷凍干燥，研磨成粉末并過(guò)60 目篩后干燥保存，用于測(cè)定脯氨酸、可溶性蛋白、還原糖及葉黃素含量。

1.2.2 芽長(zhǎng)測(cè)定 隨機(jī)選取30 株西蘭花芽苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其芽長(zhǎng)，取平均值。

1.2.3 鮮重測(cè)定 隨機(jī)選取30 株西蘭花芽苗，準(zhǔn)確測(cè)定其鮮重并取平均值。

1.2.4 干重測(cè)定 采用烘干恒重法[15]測(cè)定。隨機(jī)選取10 株西蘭花芽苗，在105 ℃烘箱干燥30 min 后，于80 ℃烘干至恒重，測(cè)定重量并取平均值。

1.2.5 含水率測(cè)定 含水率測(cè)定參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》。

1.2.6 葉黃素含量測(cè)定 葉黃素的提取方法參考Luo 等[16]方法并稍加修改。稱(chēng)取3.0 g 凍干西蘭花粉末，加入35 mL 混合萃取液（正己烷-乙醇-丙酮-甲苯，10:6:7:7，v/v）暗處?kù)o置4 h，加入2 mL 40% 氫氧化鉀-甲醇溶液充分搖勻，移至室溫環(huán)境避光皂化16～18 h。將皂化液倒入分液漏斗中，依次加入30 mL正己烷、38 mL 10%硫酸鈉溶液，搖勻后靜置片刻，收集上層溶液，重復(fù)上述操作兩次并合并所有上層溶液，于25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液全干，加入2 mL 正己烷溶解、氮?dú)獯蹈桑詈笥? mL 甲醇復(fù)溶過(guò)膜后待液相色譜測(cè)定。

HPLC 分析條件：YMC-C30色譜柱（4.6 mmol/L×250 mmol/L，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：DAD；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。流動(dòng)相A 由水:MTBE:甲醇=5:25:70（v/v/v）配比混合；流動(dòng)相B 由水:MTBE:甲醇=5:85:10（v/v/v）配比混合。梯度洗脫時(shí)間為0 min（95% A）～4.5 min（80% A）～12.5 min（50% A）～18 min（25% A）～24 min（5% A）～30 min（5% A）。

1.2.7 丙二醛含量測(cè)定 取5 株西蘭花芽苗，加入5 mL 5%三氯乙酸冰浴研磨，于10000 r/min 離心20 min。取2 mL 上清液加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混勻后于沸水浴加熱30 min，冷卻后于5000×g 離心10 min，取上清液分別于450、532、600 nm 處測(cè)定吸光值。計(jì)算公式如下，式中W 為樣品鮮重（g）。

MDA 含 量（nmol/g FW）=5×[6.45×（A532nm?A600nm）?0.56×A450nm]/ W

可見(jiàn)當(dāng)時(shí)的勞動(dòng)管理是非常精細(xì)的，隊(duì)干要進(jìn)行私自加減工分幾乎不可能。因?yàn)樵谑展r(shí)或次日，記分員便會(huì)向大家聲報(bào)各人的工分?jǐn)?shù)，同時(shí)兩名記分員均保存一份工分表，總記工員每月還會(huì)按時(shí)張榜公布。所以，隊(duì)干暗箱操作的可能性不大，即便有，社員也會(huì)很快察覺(jué)。

1.2.8 脯氨酸含量測(cè)定 稱(chēng)取0.1 g 凍干西蘭花粉末，加入5 mL 3%磺基水楊酸，混勻后置于沸水浴10 min，取出后冷卻至室溫，10000×g 離心10 min。吸取2 mL 上清液，依次加入2 mL 冰醋酸、2 mL 2.5%酸性茚三酮，振蕩搖勻，再置于沸水中加熱30 min，取出后冷卻至室溫，加入4 mL 甲苯充分渦旋混勻，取出上清液于8000×g 離心5 min，取上層紅色溶液于520 nm 處測(cè)定吸光值。

1.2.9 可溶性蛋白含量測(cè)定 稱(chēng)取2.0 g 凍干西蘭花粉末，加少量水在室溫下振蕩浸提1 h，8000×g 離心20 min 后取上清液，沉淀再次水提，操作同上，合并兩次濾液，定容到50 mL。吸取3 mL 濾液于具塞試管中，加入15 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑搖勻，靜置10 min 后在595 nm 處測(cè)定吸光值。

1.2.10 還原糖含量測(cè)定 稱(chēng)取3.0 g 凍干西蘭花粉末，加入50 mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?0 ℃恒溫水浴中放置20 min，離心取出上清液，再向沉淀中加入20 mL 蒸餾水，搖勻離心取出上清液并合并所有上清液，定容于100 mL 容量瓶，此溶液即為待測(cè)液。將待測(cè)液適度稀釋?zhuān)? mL 待測(cè)液于試管中，依次加入1 mL 50%乙醇、1.5 mL DNS 試劑，搖勻后置于沸水中加熱5 min，取出立即冷卻，加蒸餾水至10 mL，靜置20 min 后在496 nm 處測(cè)定吸光值。

1.2.11 抗氧化酶活性測(cè)定 取5 株西蘭花芽苗，加入預(yù)冷的5 mL 0.05 mol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖液于冰浴中研磨。在4 ℃條件下10000×g 離心10 min，上清液即為粗酶提取液。

SOD 活性：參考徐東等[17]方法并加以修改。取粗酶提取液50 μL 于試管中，依次加入1 mL 66.7 mmol/L pH7.8 磷酸緩沖液，100 μL mmol/L 鹽酸羥胺、200 μL 7.5 mol/L 黃嘌呤、200 μL 0.2 mg/mL 黃嘌呤氧化酶、490 μL 雙蒸水，充分混勻后在37 °C 下靜置反應(yīng)30 min，再加入2 mL 0.33%對(duì)氨基苯磺酸、2 mL 0.1%甲萘胺，在25 °C 下靜置反應(yīng)10 min，于550 nm處測(cè)定吸光值。以抑制 NBT 光還原50%所需的酶量為1 個(gè)酶活性單位（U），最終酶活性以U/g FW表示。

POD 活性：采用愈創(chuàng)木酚氧化法[18]。取75 μL粗酶提取液于試管中，加10 mL 1%愈創(chuàng)木酚、10 mL 0.3% H2O2和100 mL 50 mmol/L pH6.5 的磷酸緩沖液配制的混合液3 mL，隨后每隔1 min 記錄470 nm 處的吸光值。以每分鐘吸光度增加0.01 為1 個(gè)酶活性單位（U），最終酶活性以U/g FW 表示。

CAT：參考Bai 等方法并加以修改[19]。取粗酶提取液50 μL，加入2 mL 由100 mmol/L pH7.0 的磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L EDTA 溶液，混勻后在25 ℃恒溫水浴鍋中放置5 min，隨后加入1 mL 20 mmol/L H2O2溶液，每隔30 s 記錄470 nm 處的吸光值。以每分鐘吸光度減少0.01 為1 個(gè)酶活性單位（U），最終酶活性以U/g FW 表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗形態(tài)和重量的影響

逆境脅迫下，芽苗的生長(zhǎng)情況是反映其對(duì)脅迫響應(yīng)最直觀的指標(biāo)。圖1 為不同濃度NaCl 脅迫處理下西蘭花芽苗的生長(zhǎng)情況，數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，低濃度NaCl 處理對(duì)芽苗生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，NaCl 濃度為50 和100 mmol/L 時(shí)芽長(zhǎng)較長(zhǎng)且顯著（P<0.05）長(zhǎng)于對(duì)照組，增長(zhǎng)最為顯著，100 mmol/L處理第2、4 d 收獲的芽苗長(zhǎng)度分別較對(duì)照組高20.24%和20.89%。隨著NaCl 濃度進(jìn)一步增大，芽長(zhǎng)逐漸降低，芽苗生長(zhǎng)受到抑制。在西蘭花芽苗生長(zhǎng)期間，鮮重隨NaCl 濃度增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，尤其在50～150 mmol/L NaCl 處理下鮮重增長(zhǎng)最多，盡管300 mmol/L NaCl 抑制了芽苗根莖的伸長(zhǎng)，但其根莖和子葉均發(fā)育明顯，因此芽苗鮮重仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。第4 d 收獲的芽苗干重均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），第2 d 收獲的芽苗在200、250 mmol/L NaCl 脅迫下其干重并無(wú)明顯變化。綜上所述，50、100 mmol/L NaCl 可有效促進(jìn)西蘭花芽苗的生長(zhǎng)，NaCl 脅迫濃度大于200 mmol/L 處理時(shí)雖然抑制了芽苗的伸長(zhǎng)，但鮮重和干重仍有顯著增加（P<0.05）。

圖1 不同NaCl 濃度脅迫處理下西蘭花芽苗的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

表1 不同NaCl 濃度脅迫處理下西蘭花芽苗芽長(zhǎng)、鮮重、干重變化Table 1 Changes in sprouts length,fresh weight and dry weight of broccoli under different NaCl concentration stress

2.2 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗含水率的影響

水分是保障芽苗自身生長(zhǎng)及新陳代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，西蘭花種子吸收水分開(kāi)始萌發(fā)生長(zhǎng)。圖2 顯示，第2 d 收獲的芽苗含水率在200 mmol/L NaCl 處理下顯著下降，而其他處理組中芽苗含水率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化（P>0.05），含水率總體在86%左右浮動(dòng)。相比之下第4 d 收獲的芽苗含水率與對(duì)照組相比上升明顯，100 mmol/L NaCl 處理下含水率最高，為94.36%，而后隨NaCl 濃度增大至300 mmol/L時(shí)，含水率又下降至92.69%，這可能是高濃度鹽對(duì)芽苗產(chǎn)生滲透脅迫所致。

圖2 不同NaCl 濃度脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗含水率的影響Fig.2 Moisture content in broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

2.3 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗葉黃素含量的影響

非生物脅迫通常會(huì)對(duì)植株造成不同程度的迫害作用，為抵御外界環(huán)境的影響，植株內(nèi)通常會(huì)誘導(dǎo)釋放一些次生代謝物質(zhì)，葉黃素是綠葉蔬菜中一類(lèi)豐富的次生代謝產(chǎn)物。由圖3 可知，隨著NaCl 濃度增大，第2、4 d 收獲的芽苗中葉黃素含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，可見(jiàn)中低濃度鹽脅迫對(duì)西蘭花芽苗中葉黃素的積累具有促進(jìn)作用，以50 和100 mmol/L NaCl 處理的效果最好，在第2 d 收獲的芽苗中分別比對(duì)照組高13.53%、17.49%。第4 d 收獲的芽苗在100 mmol/L NaCl 處理下測(cè)得葉黃素含量達(dá)546.25 μg/g，較對(duì)照組提高了37.54%。Guo 等[20]對(duì)西蘭花種子噴施NaCl 后測(cè)得芽苗中酚類(lèi)物質(zhì)的含量顯著升高，Wang 等[21]在發(fā)芽的玉米籽粒中測(cè)得葉黃素含量隨NaCl 脅迫濃度增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并在300 mmol/L 處理下得到最大值，這與本文研究結(jié)果趨為一致。NaCl 脅迫濃度不變時(shí)，第4 d 收獲的芽苗中葉黃素含量與第2 d 相比有明顯增加（P>0.05），不同處理組兩天間葉黃素含量積累了85.20～302.73 μg/g，隨著NaCl 濃度由50 mmol/L 增大至300 mmol/L，第4 d 收獲的芽苗中葉黃素含量分別是第2 d 的2.25、2.18、2.21、2.21、1.99 和1.72倍。以上結(jié)果說(shuō)明在西蘭花發(fā)芽初期其體內(nèi)葉黃素含量是逐漸增加的，且適宜濃度的鹽脅迫能夠有效促進(jìn)葉黃素含量的積累。

圖3 不同NaCl 濃度脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗葉黃素含量的影響Fig.3 Lutein content in broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

2.4 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗生理指標(biāo)的影響

2.4.1 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗可溶性蛋白和還原糖含量的影響 鹽脅迫對(duì)植株造成最直接的迫害作用即為滲透脅迫，此時(shí)植株內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在抵御逆境的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用?？扇苄缘鞍资侵参矬w內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它能夠有效貯存細(xì)胞水分，保護(hù)生物膜的完整性[22]，同時(shí)它也是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠合成大分子蛋白質(zhì)[23]。由圖4A可知，在第2 d 收獲的芽苗中，可溶性蛋白含量隨NaCl 濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，100 mmol/L NaCl 處理下可溶性蛋白含量顯著增加了59.37%，而300 mmol/L NaCl 對(duì)可溶性蛋白的合成具有顯著抑制作用（P<0.05）。隨著芽苗繼續(xù)生長(zhǎng)，第4 d 收獲的芽苗在100 mmol/L NaCl 處理下可溶性蛋白含量最高，比對(duì)照組高約65.00%，此時(shí)芽苗細(xì)胞具有較高的保水性，有效提高了芽苗細(xì)胞抵御鹽脅迫的能力。當(dāng)NaCl 濃度為200 mmol/L 時(shí)，可溶性蛋白含量降至為對(duì)照組的58.45%，隨后芽苗中可溶性蛋白含量隨NaCl 濃度增大再次逐漸積累。以上表明，芽苗組織在鹽脅迫下會(huì)通過(guò)釋放和積累可溶性蛋白提高自身的代謝，此外其含量變化與植株內(nèi)部物質(zhì)的生成轉(zhuǎn)化也有重要的聯(lián)系，種子萌發(fā)時(shí)內(nèi)部的淀粉、蛋白質(zhì)等成分會(huì)在內(nèi)源酶的作用下降解促進(jìn)其他營(yíng)養(yǎng)成分的積累[24?25]。

圖4 不同NaCl 濃度脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗可溶性蛋白（A）、還原糖（B）含量的影響Fig.4 Soluble protein (A) and reducing sugar (B) content of broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

還原糖作為植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)劑，它能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，保持胞內(nèi)水分，保護(hù)膜的完整性以維持細(xì)胞正常的生理代謝。圖4B 為NaCl脅迫處理下西蘭花芽苗中還原糖含量的變化，第2、4 d收獲的芽苗均在50 mmol/L NaCl 處理下出現(xiàn)首個(gè)峰值，分別達(dá)到5.54、4.96 mg/g DW，此結(jié)果與卞紫秀等[26]對(duì)蕎麥芽苗的研究相一致。第2 d 收獲的芽苗在250 mmol/L NaCl 處理下出現(xiàn)第二個(gè)峰值，較對(duì)照組增加了59.90%，許寅生等[27]研究干旱脅迫金蓮花幼苗生長(zhǎng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)相似變化，高濃度鹽脅迫促使還原糖積累以緩解芽苗細(xì)胞受到的損傷，此前楊涓等[28]研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫還會(huì)影響植株體內(nèi)糖代謝過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)中高濃度NaCl 脅迫延緩了芽苗的生長(zhǎng)，此時(shí)還原糖消耗量相對(duì)減少，可能也是還原糖積累的原因之一。隨著NaCl 的濃度繼增加，還原糖含量出現(xiàn)下降，可能是由于鹽脅迫濃度過(guò)高使細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，導(dǎo)致還原糖被分解消耗[29]。此外，第4 d 收獲的芽苗還原糖含量均高于對(duì)照組，50～300 mmol/L NaCl 處理后分別提高了52.45%、40.05%、7.26%、3.38%、25.25%和13.01%，隨脅迫天數(shù)的延長(zhǎng)，還原糖含量出現(xiàn)下降，這可能是種子發(fā)芽初期對(duì)脅迫做出應(yīng)激反應(yīng)時(shí)被消耗過(guò)多，以及隨芽苗生長(zhǎng)需消耗還原糖等物質(zhì)維持正常的光合作用和呼吸作用[26]，因此導(dǎo)致還原糖含量有所減少。

2.4.2 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗丙二醛和脯氨酸含量的影響 植物細(xì)胞在正常環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，其體內(nèi)活性氧的代謝處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，然而在鹽脅迫下活性氧的產(chǎn)生速度快于清除速度，過(guò)度積累的活性氧最終導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷，MDA 即為膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，因此常用作判定細(xì)胞膜氧化受損程度和植株耐鹽性的重要指標(biāo)[30]。圖5A 結(jié)果顯示，MDA 含量隨NaCl 脅迫程度加劇先升高后下降。100、150 mmol/L 中低鹽濃度下，第2 d 收獲的芽苗MDA 含量與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P>0.05），當(dāng)濃度增至200 mmol/L 時(shí)MDA 出現(xiàn)大量積累，并在250 mmol/L 處理下達(dá)到峰值，較對(duì)照組增加了33.76%。MDA 含量還與組織的自我保護(hù)能力存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系[31]，第4 d 收獲的芽苗MDA 含量變化與第2 d 基本一致，在低鹽濃度處理下MDA 含量從4.79 nmol/g 下降至3.50 nmol/g，較對(duì)照組顯著降低了36.86%（P<0.05），此時(shí)芽苗中產(chǎn)生大量的可溶性蛋白、還原糖及脯氨酸等物質(zhì)，它們可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，有效保護(hù)芽苗細(xì)胞免受鹽脅迫的損害。NaCl 濃度為200 mmol/L 時(shí)，MDA含量達(dá)對(duì)照組的1.46 倍，此時(shí)芽苗損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)出相對(duì)較弱的抗逆性。隨后MDA 含量出現(xiàn)下降，相似的變化趨勢(shì)在白楊幼苗中也被觀察到[32]，這可能由于鹽濃度過(guò)高加劇細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重，也有學(xué)者將這種現(xiàn)象歸因于高濃度NaCl 脅迫致使植株細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致MDA 被分解[33]。在相同的NaCl 濃度下，第4 d 收獲的芽苗較第2 d 的MDA含量有所下降，這可能是由于隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)植株內(nèi)部產(chǎn)生了相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制[34]。以上結(jié)果表明，芽苗在萌發(fā)初期對(duì)脅迫處理最為敏感，這一時(shí)期芽苗細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度最高，隨鹽脅迫程度加劇細(xì)胞膜損傷逐漸加重，過(guò)高鹽濃度下丙二醛含量出現(xiàn)下降可能與細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有關(guān)。

脯氨酸是植物體內(nèi)存在的一種可以自身合成的小分子物質(zhì)，通常情況其含量很低，但在逆境條件下會(huì)被迅速激活，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)的作用[35]，其含量變化可作為芽苗響應(yīng)鹽脅迫程度的一項(xiàng)指標(biāo)[36]。圖5B 結(jié)果顯示，NaCl 脅迫處理能夠顯著促進(jìn)芽苗中脯氨酸積累（P<0.05），尤其以高濃度鹽處理最顯著，200～300 mmol/L NaCl 處理下，第4 d 收獲的芽苗中脯氨酸含量分別是對(duì)照組的1.22、1.71和4.11 倍，第2 d 收獲的芽苗中脯氨酸含量分別是對(duì)照組的1.61、1.80 和2.59 倍，此外100 mmol/L 和150 mmol/L NaCl 處理也使2 d 收獲的芽苗中脯氨酸含量有顯著提高（P<0.05）。此前Bai 等[37]在馬鈴薯幼苗中發(fā)現(xiàn)脯氨酸的含量與NaCl 脅迫程度呈正相關(guān)分布，穆旦等[22]也在研究中發(fā)現(xiàn)隨鹽脅迫濃度的增加溪蓀和黃菖蒲葉片中脯氨酸含量總體呈上升的趨勢(shì)，本研究中脯氨酸含量也呈現(xiàn)隨NaCl 脅迫濃度增加逐漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明芽苗受到滲透脅迫作用逐漸加劇，因此芽苗大量合成脯氨酸來(lái)增加植株對(duì)滲透脅迫的耐受性，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞恢復(fù)到正常水平。

圖5 不同NaCl 濃度脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗丙二醛（A）、脯氨酸（B）含量的影響Fig.5 Malondialdehyde (A) and proline (B) content in broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

2.4.3 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗抗氧化酶活性的影響 鹽脅迫下Na+和Cl?在植物體內(nèi)大量積累，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，對(duì)細(xì)胞造成損害，為此芽苗細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成一種酶促保護(hù)系統(tǒng)以保護(hù)自身免受傷害[38]。SOD 是其中重要的金屬酶，它能夠?qū)⒊趸镪庪x子自由基分解成為過(guò)氧化氫和分子氧，修復(fù)由活性氧引起的氧化損傷[39]，此外作為植物抗氧化的第一道防線(xiàn)，SOD 被認(rèn)為是維持細(xì)胞正常生理?xiàng)l件和應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶。圖6A 結(jié)果顯示，第2 d 收獲的芽苗SOD 活性受鹽脅迫濃度影響較小，僅在NaCl 濃度為100 mmol/L 較對(duì)照組顯著增加了4.72%%（P<0.05），隨后SOD 活性逐漸增強(qiáng)，在300 mmol/L高濃度鹽處理下達(dá)到最大值。第4 d 收獲的芽苗SOD 活性隨NaCl 濃度增加總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且依次在100、250 mmol/L NaCl 處理下表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，與對(duì)照組相比分別顯著增加了36.14%和28.72%（P<0.05），300 mmol/L 處理下SOD 活性又再次降至與對(duì)照組相當(dāng)。

圖6 不同NaCl 濃度脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗SOD（A）、POD（B）、CAT（C）活性的影響Fig.6 SOD (A),POD (B) and CAT (C) activity of broccoli sprouts under different NaCl concentration stress

POD 和CAT 進(jìn)一步催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解以防止氧化，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡[40]。由圖6B 可知，POD 活性與SOD 活性變化趨勢(shì)相似，在100、150 mmol/L NaCl 處理下，第2 d 收獲的芽苗POD 活性分別是對(duì)照組的1.12 和1.17 倍，第4 d收獲的芽苗POD 活性分別是對(duì)照組的1.15 和1.14 倍。隨著NaCl 濃度由200 mmol/L 增大至300 mmol/L，第4 d 收獲的芽苗POD 活性略微減弱但并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。西蘭花芽苗中CAT活性在不同處理?xiàng)l件下也存在差異（圖6C），第2d 收獲的芽苗CAT活性隨NaCl 濃度增加逐漸增強(qiáng)，50～300 mmol/L NaCl 處理下分別比對(duì)照組顯著增加6.53%、20.11%、14.44%、20.19%、26.91%和35.39%（P<0.05），而在第4 d 收獲的芽苗中，CAT 活性則隨NaCl 脅迫程度加劇先升高后降低，100 mmol/L NaCl 處理下CAT 活性最強(qiáng)，是對(duì)照組的1.32 倍，此外150 mmol/L和200 mmol/L NaCl 處理下CAT 活性也顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但100、150 和200 mmol/L 這三組間差異并不明顯（P>0.05）。

由此可見(jiàn)，NaCl 脅迫處理有效提高了抗氧化酶的活性，SOD 與CAT、POD 相互協(xié)作，提升了西蘭花芽苗細(xì)胞氧化防御能力，尤其在中度鹽脅迫下，抗氧化酶活性均顯著增強(qiáng)（P<0.05），芽苗中MDA 含量顯著降低（P<0.05），緩解了鹽脅迫對(duì)芽苗細(xì)胞造成的損害。但同時(shí)高鹽濃度下觀察到抗氧化酶活性減弱，可能是其結(jié)構(gòu)被破壞而導(dǎo)致防御能力下降，也有學(xué)者認(rèn)為植物細(xì)胞在鹽脅迫下的耐受性存在一個(gè)閾值，在一定范圍內(nèi)提高抗氧化酶活性能夠有效緩解鹽脅迫下細(xì)胞受損程度，但當(dāng)超過(guò)該臨界時(shí)抗氧化酶活性會(huì)受到抑制，無(wú)法發(fā)揮清除作用[32]。綜合本研究各項(xiàng)指標(biāo)，盡管鹽脅迫增加了抗氧化酶活性和具有滲透調(diào)節(jié)功能的小分子物質(zhì)的含量，但MDA 含量仍處于較高水平，說(shuō)明高濃度鹽脅迫給西蘭花芽苗細(xì)胞帶來(lái)的損傷較為嚴(yán)重且難以恢復(fù)，在提高抗性方面，應(yīng)結(jié)合多種氧化清除劑的功效，相互協(xié)同作用以增強(qiáng)芽苗細(xì)胞的抗逆性。

2.5 NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗葉黃素含量與相關(guān)生理指標(biāo)、抗氧化酶活性的相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)NaCl 脅迫處理下西蘭花芽苗葉黃素含量與相關(guān)生理指標(biāo)、抗氧化酶活性的相關(guān)性分析，如表2 和表3 所示，第2 d 收獲的芽苗葉黃素含量與可溶性蛋白含量和CAT 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與脯氨酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與SOD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），同時(shí)POD 和CAT 兩種抗氧化酶之間也呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。在第4 d收獲的芽苗中，葉黃素含量與SOD、CAT活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與脯氨酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），此外，丙二醛含量與還原糖和可溶性蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與POD 活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），脯氨酸含量分別與SOD、POD 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)和極顯著正相關(guān)（P<0.01），綜上，葉黃素含量與抗氧化酶活性及氧化損傷程度之間有密切的聯(lián)系，可以推斷，芽苗通過(guò)脯氨酸的釋放與積累調(diào)節(jié)抗氧化酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而保護(hù)鹽脅迫下芽苗細(xì)胞生理生化正常代謝進(jìn)程。

表2 NaCl 脅迫處理2 d 的西蘭花芽苗葉黃素積累與相關(guān)生理指標(biāo)、抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of lutein accumulation,related physiological indexes and antioxidant enzyme activity of broccoli sprouts harvested 2 d after NaCl stress treatment

表3 NaCl 脅迫處理4 d 的西蘭花芽苗葉黃素積累與相關(guān)生理指標(biāo)、抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of lutein accumulation,related physiological indexes and antioxidant enzyme activity of broccoli sprouts harvested 4 d after NaCl stress treatment

3 結(jié)論

本文研究了不同濃度NaCl 脅迫處理對(duì)西蘭花芽苗生理生化指標(biāo)、葉黃素含量及抗氧化能力的影響，結(jié)果表明，隨著NaCl 處理濃度的增大，芽苗的芽長(zhǎng)、重量先增大后減小，高濃度鹽脅迫下芽苗生長(zhǎng)受到顯著抑制作用。芽苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白、還原糖、脯氨酸等均隨NaCl 脅迫濃度變化而變化，以維持芽苗細(xì)胞正常的代謝功能。研究發(fā)現(xiàn)中低濃度的NaCl 是西蘭花芽苗富集葉黃素的最佳脅迫條件，當(dāng)濃度為100 mmol/L 時(shí)，第4 d 收獲的芽苗中葉黃素含量最高，達(dá)到546.25 μg/g，比對(duì)照組增加了37.54%，該條件下SOD、POD、CAT 抗氧化酶活性較對(duì)照組分別增加了36.26%、14.62%、32.34%。此外芽苗的鮮重、可溶性蛋白、還原糖含量較對(duì)照組也均顯著提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)葉黃素與脯氨酸共同協(xié)作能夠有效應(yīng)對(duì)鹽脅迫環(huán)境，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酸含量可以提高芽苗在鹽分脅迫下的適應(yīng)程度。綜上所述，通過(guò)100 mmol/L NaCl 脅迫處理西蘭花種子發(fā)芽4 d 可作為提高西蘭花芽苗葉黃素含量的一種方式，并為開(kāi)發(fā)功能性西蘭花芽苗食品提供理論參考。