芽球菊苣根粗多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性和相對分子量分析

薛 山，鞏子童，林靖娟，鄭舒晨

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000；2.菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建漳州 363000）

菊苣（Cichorium intybusL.）是一種菊科菊苣屬多年生草本植物，其地上部分與根部已作為藥材收載于《中國藥典》2015版（一部）[1]。菊苣廣泛分布于我國的西北、華北、東北等地，其中新疆南部是最為主產(chǎn)的區(qū)域，都是維吾爾族與蒙古族常用的藥材。芽球菊苣（Cichorium intybusL.var.foliosumHegi）是菊苣屬菊苣中馴化選育出來的一個(gè)變種，原產(chǎn)于地中海、亞洲中北部和北非，現(xiàn)已在我國以及歐洲廣泛種植。研究顯示菊苣根富含多糖（菊糖[2-3]、糊精和淀粉[4]）、生物堿、萜烯[5-7]、多酚[8]、VD類似物[9]等多種生物學(xué)活性化學(xué)成分，尤其是菊苣多糖已在降血糖、降血脂、抗氧化[10-11]、保肝護(hù)肝[12-13]、提升免疫力[14-15]等功效方面都顯示出了較高的活性。可見，菊苣多糖的開發(fā)與應(yīng)用也已成為食品科學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要研究方向。

近年來，包括菊苣在內(nèi)的植物多糖提取已有熱水浸提、酸法、堿法、酶法、膜分離法、超臨界CO2萃取等方法，但是酸法與堿法容易造成糖苷鍵斷裂，酶法對于溫度、pH都有較高的要求，超濾膜過濾法對于多糖分子質(zhì)量的掌握有較高的要求，超臨界CO2萃取對儀器設(shè)備的要求較高[16]。在這些方法中，傳統(tǒng)的熱水浸提法得率雖然不是最高的，但是操作最便捷，對儀器設(shè)備要求不高，對環(huán)境污染較小，是一種非常經(jīng)典的提取方法[17]。然而，對于菊苣多糖的提取優(yōu)化基本都是正交[17]或響應(yīng)面法[16]，得到的是確定的工藝參數(shù)，而尚未有Box-Behnken結(jié)合Matlab分析法在菊苣多糖提取中的應(yīng)用。Matlab是國際上最優(yōu)秀的科技應(yīng)用軟件之一，具有強(qiáng)大的科學(xué)計(jì)算功能，并提供了專門的優(yōu)化工具箱，通過建立研究問題的數(shù)學(xué)模型，編寫程序代碼，有效計(jì)算出最優(yōu)解，廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域[18]，如化工油脂提取優(yōu)化[19]。Box-Behnken結(jié)合Matlab分析法不僅可以得到確切的菊苣根多糖提取工藝參數(shù)及影響因素三維交互效果圖，還可以得到最優(yōu)的參數(shù)范圍和四維交互效果圖。

基于此，本研究采用Box-Behnken Design結(jié)合Matlab分析法對菊苣根粗多糖進(jìn)行提取優(yōu)化，對其體外羥自由基清除能力和還原力進(jìn)行了測定，采用HPLC分析所提多糖純化后中性糖與酸性糖平均相對分子量，以期為菊苣多糖工業(yè)化提取應(yīng)用及其產(chǎn)品的研發(fā)推廣提供理論依據(jù)與創(chuàng)新動力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽球菊苣根干品 原產(chǎn)于印度，由大閩食品（漳州）有限公司提供；無水乙醇、苯酚、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、無水葡萄糖，鹽酸、濃硫酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；SephadexG-150葡萄糖凝膠 瑞典Pharmacia公司。

DGG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；Forma -86 ℃超低溫冰箱美國UNICO；ALPHA 1-2LD PLUS真空冷凍干燥機(jī) 美國CHRIST公司；Vivaflow 200vivascience超濾膜 美國Sartorius公司；easy-loadⅡ蠕動泵Bamant公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV5100B紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；RHB-32ATC手持折光儀 上海光學(xué)儀器廠；1200液相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將菊苣根干品放入60 ℃烘箱干燥至水分含量5%以下，中藥粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菊苣根粗多糖的提取工藝 稱取5.00 g菊苣根粉末，置于250 mL的三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，70 ℃水浴提取150 min，離心取上清液，將濾液減壓濃縮至約20 mL（大約），置于燒杯中冷卻至室溫，向濃縮液中緩慢地滴加無水乙醇80 mL并快速攪拌，4 ℃靜置冷藏12 h，棄去濾液，再次加入少量蒸餾水超聲溶解，減壓濃縮至質(zhì)量濃度為1.1～1.2 g/mL，置于燒杯中冷卻至室溫。預(yù)凍之后再真空冷凍干燥（-50 ℃，真空度＜15 Pa，干燥24 h）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同液料比對菊苣根粗多糖得率的影響固定提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間150 min?？疾觳煌弦罕龋?:100、3:100、5:100、7:100、9:100 g/mL對菊苣根粗多糖得率的影響。

1.2.3.2 水浴溫度對菊苣根粗多糖得率的影響 固定化料液比為3:100 g/mL，提取時(shí)間150 min?？疾觳煌囟龋?0、60、70、80、90 ℃對菊苣根粗多糖得率的影響。

1.2.3.3 水浴時(shí)間對菊苣根粗多糖得率的影響 固定料液比為3:100 g/mL，提取溫度70 ℃?？疾觳煌r(shí)間：90、120、150、180、210 min對菊苣根粗多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取次數(shù)對菊苣根粗多糖得率的影響 固定料液比為3:100 g/mL，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間150 min?？疾焯崛?次、2次、3次對菊苣根粗多糖得率的影響。

1.2.4 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 Matlab分析及驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Matlab軟件，采用優(yōu)化計(jì)算方法以及算法語言的圖形處理功能，通過編制程序M（程序代碼），計(jì)算出料液比（A）、水浴溫度（B）、水浴作用時(shí)間（C）對菊苣根粗多糖得率（y）的四維及三維交互影響結(jié)果。在最優(yōu)組合工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.6 菊苣根粗多糖得率的測定

1.2.6.1 菊苣根總糖的測定 采用苯酚-硫酸法測定菊苣根總糖含量。首先，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的1 mg/mL葡萄糖工作液，以蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入8%苯酚溶液1.0 mL，充分搖勻，再從試管液正面快速加入濃硫酸5 mL，立即充分搖勻，在室溫下靜置20 min后于490 nm波長下比色測定其吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得標(biāo)準(zhǔn)線性方程為：y=0.0079x+0.0243，R2=0.992。

菊苣根總糖含量的測定：取75 mg菊苣根粗多糖于250 mL容量瓶中，加水至刻度，吸取1 mL樣液，按上述操作步驟，測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

1.2.6.2 菊苣根還原糖含量的測定 采用DNS試劑法測定菊苣根還原糖含量。首先，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液，加蒸餾水補(bǔ)至1 mL，加入1 mL DNS試劑，沸水浴中加熱5 min，取出以自來水冷卻，再加入蒸餾水8 mL，充分搖勻，在520 nm波長下比色測定吸光值。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得標(biāo)準(zhǔn)線性方程為：y=0.0262x-0.0437，R2=0.999。

菊苣根還原糖含量的測定：取250 mg菊苣根粗多糖于250 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，吸取1 mL樣液，按上述操作步驟，測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。

1.2.6.3 菊苣根粗多糖得率的測定 菊苣根含有單糖（還原糖）、低聚糖（多為還原糖）和多糖（非還原糖），故菊苣根粗多糖的含量以總糖含量與還原糖含量的差值表示。菊苣根粗多糖的得率以下式計(jì)算[20]：

式中：H為粗多糖的重量（g），T為多糖含量（%），W為菊苣根粉末重量（g）。

1.2.7 菊苣根粗多糖體外抗氧化性測定

1.2.7.1 羥自由基清除率測定 取3 mg/mL的粗多糖溶液（1、2、3、5、7、9、10 mL）于試管中，加入適量水(反應(yīng)液總體積為15 mL)，然后各管分別加入1 mL的硫酸亞鐵（6 mmol/L）和1 mL水楊酸（6 mmol/L），搖勻后各管加入1 mL的H2O2（6 mmol/L）混勻，37 ℃水浴15 min，以蒸餾水為空白對照，以VC為陽性對照，在510 nm波長下測定各反應(yīng)溶液的吸光度并計(jì)算自由基清除率。

式中：A0為空白對照的吸光值，AX為加樣品的吸光值，AX0為不加顯色劑H2O2。

1.2.7.2 還原力的測定 參考Lee等[21]方法修改。方法向每支試管中依次加入1.0 mL不同濃度的粗多糖溶液（0.5～3.0 mg/mL）、2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）以及2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6L），于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后迅速冷卻，并加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸（TCA）溶液，以3000 r/min離心10 min后取上清液2.0 mL，并加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，于10 min后測定波長700 nm處的吸光值A(chǔ)1。用蒸餾水替代樣品液測得吸光值記為A0。反應(yīng)物的吸光度越大其還原力越強(qiáng)。再以VC為陽性對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

還原力=A1-A0

式中：A0為空白對照的吸光值，A1為加樣品的吸光值。

1.2.8 HPLC檢測菊苣根中性糖和酸性糖相對分子量

1.2.8.1 菊苣根粗多糖的分離純化 參考李婷婷等[22]方法略微修改：將處理好的SephadexG-150葡萄糖凝膠緩慢繞壁注入層析柱中，為了防止產(chǎn)生分層以及氣泡，裝到一定高度即可。裝柱后，用0.02 mol/L pH 7.20 Tris-HCl動態(tài)平衡4倍體積（約3000 mL）后，配制100 mg/mL菊苣根粗多糖上樣，等待樣品完全進(jìn)入界面，用0.02 mol/L pH7.20 Tris-HCl 溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為0.1 mL/min，洗脫至無糖下來即苯酚硫酸法測定值無顯色，收集洗脫的液體為中性糖部分。后用0.03～0.1 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集到的洗脫液為酸性糖。將收集到的中性糖和酸性糖洗脫液進(jìn)行超濾、真空冷凍干燥后得到中性糖和酸性糖。

1.2.8.2 相對分子量測定 HPLC測定右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品Mw50000、25000、12000、5000和1000 Da 的色譜峰保留時(shí)間t，以保留時(shí)間t對標(biāo)準(zhǔn)樣品Mw的對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用二次方程擬合得其方程為：lgMw=-2.405+1.827T-0.113T2。依據(jù)菊糖的保留時(shí)間計(jì)算其相對分子量。

HPLC 的條件：儀器Agient 1200；色譜柱（Shodex OHpak SB-804HQ）；柱溫30 ℃；流動相為超純水；流速0.6 mL/min；檢測器示差檢測器Agient 1260[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值表示，利用SPSS Statistics 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素顯著性分析，P＜0.05表示結(jié)果顯著，標(biāo)示為不同字母。采用Origin8.1軟件作圖分析結(jié)果。利用Matlab （MATrixLABoratory）軟件進(jìn)行交互試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算及四維、三維繪圖。按照Matlab實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行菊苣粗根多糖的提取，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對菊苣根粗多糖得率的影響 如圖1所示，在料液比1:100～9:100 g/mL范圍內(nèi)，菊苣根粗多糖的得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢（P＜0.05），當(dāng)料液比為3:100 g/mL時(shí)，得率有最大值。該結(jié)果與許芳等[16]研究基本一致，表明一定程度增加料液比，有利于水溶性菊苣根多糖的溶出，但是進(jìn)一步升高會引起得率下降。推測原因，可能是由于過高的料液比會導(dǎo)致包括還原糖在內(nèi)的水溶性成分大量溶出，從而導(dǎo)致粗多糖得率下降。

2.1.2 水浴溫度對菊苣根粗多糖得率的影響 如圖2所示，隨著水浴溫度的升高，菊苣根粗多糖的得率先升高后降低（P＜0.05），在70 ℃時(shí)取得最大值。推測原因可能是低溫時(shí)分子擴(kuò)散能力小，使超聲空化作用不完全，但溫度過高之后，部分多糖分子結(jié)構(gòu)破壞、以及其他非多糖組分過多溶出，從而導(dǎo)致得率呈現(xiàn)下降趨勢[23]。

圖1 料液比對菊苣根粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yieldof crude polysaccharide from chicory root

圖2 水浴溫度對菊苣根粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.1.3 水浴時(shí)間對菊苣根粗多糖得率的影響 如圖3所示，菊苣根粗多糖的得率在90～150 min范圍內(nèi)隨著水浴時(shí)間的延長而增大（P＜0.05），在150～210 min范圍內(nèi)逐漸降低。推測該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，一是加熱時(shí)間過長，部分多糖發(fā)生了熱降解，二是長時(shí)間的加熱導(dǎo)致非多糖成分的大量溶出，比如單糖和低聚糖成分。當(dāng)水浴150～180 min時(shí)，粗多糖的得率能夠取得較高值，鑒于水浴150和180 min條件下多糖得率差異不顯著，故選擇水浴時(shí)間150 min。

圖3 水浴時(shí)間對菊苣根粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of water bath time on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.1.4 提取次數(shù)對菊苣根粗多糖得率的影響 如圖4所示，隨著提取次數(shù)的增加，菊苣根粗多糖得率逐漸升高，其中，第2次得率顯著高于第1次（P＜0.05），但第2次與第3次差異不顯著，故選擇提取次數(shù)2次。

圖4 提取次數(shù)對菊苣根粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.2 Box-Benhnken優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 Box-Benhnken響應(yīng)面模型的建立 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design原理，以菊苣根粗多糖得率（%）為指標(biāo)，選擇料液比（g/mL）、水浴溫度（℃）、水浴時(shí)間（min）作為考察因素，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表2和表3。

表2 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface optimization of Box-Benhnken

采用Design-expert8.0軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到料液比（A）、水浴溫度（B）、水浴時(shí)間（C）的回歸方程模型如下：

2.2.2 Box-Benhnken響應(yīng)模型的顯著性檢驗(yàn) 對回歸模型進(jìn)行方差分析，對模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。方程可靠性由R2表示，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn)，影響因素的顯著性由模型系數(shù)的P值檢驗(yàn)。由表3可知：模型P=0.0001＜0.01（極顯著），失擬項(xiàng)P=0.0534＞0.05（不顯著），表明該回歸方程對試驗(yàn)的擬合度高，誤差小?？梢杂迷摲匠虒Σ煌瑮l件下的提取效果進(jìn)行分析、預(yù)測。通過F值可以得出，各因素對菊苣根粗多糖得率都有極顯著的影響（P＜0.01），且顯著性大小順序?yàn)椋毫弦罕龋ˋ）＞水浴溫度（B）＞水浴時(shí)間（C）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis result

分析回歸方程的可信度，R2值越接近1，說明回歸方程越可靠，表明該回歸方程可以描述該試驗(yàn)各因素與響應(yīng)值的關(guān)系?；貧w方程決定系數(shù)R2為0.9947，說明回歸方程的可靠性較高。R2Adj值為0.9879表明回歸方程校正后可以解釋98.79%響應(yīng)值的變化。得率方程信噪比Adeq Precision為45.113，說明該模型可用于預(yù)測。C.V.值為0.87，反映的是回歸方程的置信度，值越小，說明回歸方程的置信度越高。綜上，回歸方程具有較高的可信度。

2.2.3 Box-Benhnken響應(yīng)面最優(yōu)工藝預(yù)測及驗(yàn)證根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，得到最佳工藝參數(shù)的理論預(yù)測值為：料液比2.74:100 g/mL、水浴溫度72 ℃和水浴時(shí)間165 min，此時(shí)菊苣根粗多糖得率的理論值為40.32%，按照該工藝條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際值為39.99%±0.43%，與預(yù)測值差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 Matlab分析最佳工藝區(qū)間

通過編程，得到料液比（g/mL），水浴溫度（℃）和水浴時(shí)間（min）對菊苣根粗多糖得率影響的四維效果圖（圖5）。當(dāng)粗多糖得率（Y）取得理論最大值（40.3164%）時(shí)，通過矩陣計(jì)算得到料液比2.7347:100 g/mL，水浴溫度71.9388 ℃，水浴時(shí)間165 min。

為了更好的描述分析數(shù)據(jù)間的交互影響，分別繪制當(dāng)水浴時(shí)間短（135 min）、中（150 min）、長（165 min）時(shí)，料液比與水浴溫度對粗多糖得率交互影響的三維旋轉(zhuǎn)曲面與等高線投影圖（圖6）。

圖5 四維交互曲面Fig.5 4-D interactive surface

當(dāng)水浴時(shí)間取下限值（C=135 min）時(shí)，固定水浴溫度（B），隨著料液比（A）的升高，粗多糖得率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；固定A值，隨著B的升高，得率先升高后降低。此時(shí)，得率的取值范圍為27.5239%～39.9341%，當(dāng)A取3:100～4:100 g/mL，B取66～72 ℃區(qū)間時(shí)，得率能夠取得最大值。當(dāng)水浴時(shí)間取中間值（C=150 min）時(shí)，交互影響與C=135 ℃時(shí)較為類似。固定B值，隨著A值增大，得率先增大后減小，固定A值，隨著B值的增大，得率也呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。此時(shí)，得率的取值范圍為28.3738%～38.7017%，當(dāng)A取2.7:100～3.6:100 g/mL，B取66～73 ℃區(qū)間時(shí)，得率能夠取得最大值。當(dāng)水浴時(shí)間取上限值（C=165 min）時(shí)，得率的變化趨勢與C=135 min和C=150 min時(shí)也較為類似。此時(shí)，得率取值范圍為31.1117%～40.3164%。當(dāng)A取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴溫度70～74 ℃時(shí)，得率能夠取得最大值（約40.32%）。

綜上所述，當(dāng)提取時(shí)間取較高值（C=165 min），A取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴溫度70～74 ℃時(shí)，菊苣根粗多糖得率可以取得較高理論值，與2.2.3中最佳工藝參數(shù)結(jié)果一致。Chikkerur等[24]采用熱水浸提法提取菊苣根粗多糖，得率大約為42%，與本文結(jié)果類似，同時(shí)研究顯示，煙曲霉內(nèi)毒素酶進(jìn)一步酶解菊苣根中提取的多酚，可將其轉(zhuǎn)化為富含蔗果二糖和蔗果三糖等具有益生元作用的短鏈低聚果糖（SCFOS），這可以作為進(jìn)一步的研究方向。

圖6 水浴溫度和料液比交互作用對粗多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of the interaction of various factors on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.4 菊苣根粗多糖體外抗氧化性結(jié)果分析

2.4.1 菊苣根粗多糖清除羥自由基能力的測定 菊苣根多糖及陽性對照VC對羥自由基的清除作用如圖7A、7B所示。在0.25～2.50 mg/mL 范圍內(nèi)，菊苣根粗多糖隨著濃度的增大，體外羥自由基清除率顯著升高（P＜0.05），其IC50值為1.36 mg/mL，陽性對照VC在0.04～0.052 mg/mL范圍內(nèi)羥自由基清除率顯著升高，于0.44 mg/mL達(dá)到高點(diǎn)，其IC50值為0.013 mg/mL?？梢娋哲母侄嗵蔷哂忻黠@的羥自由基清除能力，但顯著低于VC的羥自由基清除力（P＜0.05）。諸多學(xué)者也證實(shí)了菊苣多糖的抗氧化活性，如付愛葉等[25]報(bào)道，湖北產(chǎn)菊苣多糖在0.1～2.4 mg/mL范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的羥自由基清除活性，且與多糖濃度呈正相關(guān)；張宏志等[26]熱水浸提法提得菊芋菊糖在0～15.0 mg/mL有著較高的抗氧化活性，并且在熱水浸提之前采用輔助酶法、超聲和微波處理能夠提升多糖的抗氧化活性，這為菊苣多糖抗氧化能力的提升提供了思路。

圖7 菊苣根粗多糖（A）和VC（B）對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of crude polysaccharides from chicory root (A) and VC (B) on hydroxyl free radicals

2.4.2 菊苣根粗多糖還原力的測定 多糖還原力機(jī)理主要為樣品中的還原酮通過電子給予能力，阻止自由基鏈形成，從而發(fā)揮抗氧化活性作用[27]。由圖8可知，在0.1～3 mg/mL范圍內(nèi)，隨著菊苣根粗多糖溶液濃度的升高，還原力也顯著升高（P＜0.05），在相同濃度下，VC的吸光值范圍為1.35～1.99。故菊苣根粗多糖具備一定的還原力，但也顯著低于VC（P＜0.05）。付愛葉等[25]研究也證實(shí)了菊苣根具有還原力活性，且呈現(xiàn)濃度效應(yīng)關(guān)系。

圖8 菊苣根粗多糖與VC對Fe3+的還原力Fig.8 Fe3+ reductive ability of crude polysaccharide from chicory root and VC

2.5 菊苣根中性糖和酸性糖相對分子量

由圖9和圖10可知，菊苣中性糖和酸性糖均呈一個(gè)單峰，且峰尖而窄，說明菊苣中性糖和菊苣酸性糖純度較高，其中酸性糖純度高于中性糖。在本實(shí)驗(yàn)條件下，由樣品的保留時(shí)間11.024和11.849 min，代入方程求得菊苣中性糖的平均相對分子量MW為10072.07 Da，菊苣酸性糖的平均相對分子量MW為2388.13 Da。研究顯示，不同多糖提取方法（熱水浸提、酶法、超聲和微波輔助熱水浸提）對菊糖的得率、聚合度、分子組成以及抗氧化能力都有顯著的影響[26]，因此，不同提取條件對菊苣根粗多糖分子組成及構(gòu)效關(guān)系的影響也將是日后深入探討的方向。

圖9 菊苣根中性糖的HPLC譜圖Fig.9 HPLC spectrum of neutral sugarfromchicory root

圖10 菊苣酸性糖的HPLC譜圖Fig.10 HPLC spectra of acidic sugar fromchicory root

3 結(jié)論

采用Box-Behnken優(yōu)化法結(jié)合Matlab分析法對芽球菊苣根粗多糖進(jìn)行熱水浸提法提取工藝優(yōu)化、體外抗氧化性測定以及中性糖、酸性糖相對分子量測定。最優(yōu)提取工藝參數(shù)：料液比2.74:100 g/mL，水浴溫度72 ℃和水浴時(shí)間165 min，此時(shí)菊苣根粗多糖得率的理論預(yù)測值為40.32%，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)際值為39.99%±0.43%；Matlab分析最佳工藝取值范圍：當(dāng)提取時(shí)間取較高值（C=165 min），料液比取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴溫度70～74 ℃，粗多糖得率可以取得較高得率。所提菊苣根粗多糖具備羥自由基清除能力及還原力，與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。HPLC測得菊苣根中性糖和酸性糖平均相對分子量分別為10072.07 和2388.13 Da。本研究不僅確定了菊苣根粗多糖的最佳提取工藝條件參數(shù)與波動范圍，還確定了所提多糖的體外抗氧化活性以及中性、酸性多糖分子量分布，為菊苣根多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及其產(chǎn)品的研發(fā)利用提供了理論依據(jù)與創(chuàng)新思路。