5種金屬離子對(duì)紫色紅曲霉主要次生代謝物譜的調(diào)節(jié)作用

黃勝男，高夢(mèng)祥，劉應(yīng)保

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025）

紅曲霉（Monascus）可以產(chǎn)生多種次生代謝物，其中研究最多的是紅曲色素（Monascuspigment，MP）、莫納克林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和麥角固醇等有益代謝物[1]。紅曲霉的有益代謝物主要用于食品著色和醫(yī)療保健等領(lǐng)域，比如紅曲色素具有著色和抗氧化、抗炎癥、抗癌等功能，莫納克林K、γ-氨基丁酸具有降血脂、降血壓、降血糖和抗癌等功效[2]。此外，紅曲霉還產(chǎn)生一種真菌毒素桔霉素（Citrinin，CTN），因其具有腎毒性而嚴(yán)重影響了紅曲霉上述代謝物的開發(fā)應(yīng)用。不過學(xué)術(shù)界從菌種培育和改造、優(yōu)化發(fā)酵環(huán)境等方面，輔以理化和分子生物學(xué)手段可將其在發(fā)酵過程中控制在安全范圍內(nèi)[3-6]。其中，培養(yǎng)基的化學(xué)組成，尤其是金屬離子不僅能顯著影響次生代謝物的合成，而且還能激活沉默的或隱蔽的次生代謝物的合成[7-9]。

除了作為營養(yǎng)成分，金屬離子還對(duì)微生物的次生代謝合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。關(guān)于金屬離子對(duì)紅曲霉次生代謝物的調(diào)節(jié)作用，已有不少報(bào)道。在紅曲霉（Monascussp.ZK、ZH、S、M.anka、M.purpureusNIIS）的研究中發(fā)現(xiàn)，Zn2+可以顯著提升紅曲色素的合成[10-13]。相反，Zn2+則抑制M.purpureusATCC 16365紅曲色素的合成[14]。適量的Mn2+、Mg2+均能促進(jìn)M.sp S和M.anka黃色素的合成[11-12]，而Fe2+則抑制M.sp S紅曲色素的合成[12]。然而，在M.rubber和M.purpureusATCC 16365中，F(xiàn)e2+則可以促進(jìn)紅曲色素的合成[14-16]。在M.FJ3中Na+、Fe2+、Cu2+和Mn2+可以協(xié)同促進(jìn)黃色素的產(chǎn)量，而對(duì)桔霉素沒有影響[17]。相反，Cu2+則抑制M.anka、M.rubber紅曲色素的合成[15-16,18]。對(duì)于MK而言，適量的Zn2+可以促進(jìn)紅曲霉MK的合成[19-21]。Mg2+能促進(jìn)紅曲霉桔霉素的合成[4]，而Na+則抑制桔霉素的合成[22]。而金屬離子對(duì)紅曲霉其他次生代謝產(chǎn)物的研究則鮮有報(bào)道。

從上述的研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，一些研究結(jié)論截然相反?？赡茉蛟谟冢饘匐x子對(duì)紅曲色素的調(diào)控作用存在菌種特異性和菌株特異性，同時(shí)存在劑量效應(yīng)，不當(dāng)?shù)膭┝縿t對(duì)次生代謝物合成不具有正調(diào)節(jié)作用，甚至是負(fù)效應(yīng)[9]。此外，在不同的培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)容器和培養(yǎng)環(huán)境等）下，金屬離子對(duì)次生代謝物的調(diào)節(jié)作用不同[9,23]。而且，多數(shù)研究僅關(guān)注于金屬離子對(duì)紅曲霉的某個(gè)代謝物的效應(yīng)，而很少對(duì)多個(gè)代謝物同時(shí)進(jìn)行觀察?；诖?，本研究以紫色紅曲霉為研究對(duì)象，采用實(shí)驗(yàn)室常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，通過5種金屬離子處理，結(jié)合金屬離子螯合實(shí)驗(yàn)，揭示不同離子對(duì)紫色紅曲霉主要次生代謝物譜的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉（Monascus purpureus） 本實(shí)驗(yàn)菌種；乙醇、甲酸、甲苯、乙酸乙酯、苯、8-羥基喹啉和金屬離子等試劑 均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth，PDB）：200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，加去離子水煮沸20～30 min，經(jīng)紗布過濾后濾液補(bǔ)加去離子水至1000 mL，121 ℃滅菌20 min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：在PDB基礎(chǔ)上加15 g瓊脂粉；查氏酵母膏瓊脂（Czapek yeast exatract agar，CYA）：1.0 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，3.0 g NaNO3，0.01 g FeSO4·7H2O，30 g蔗糖，5.0 g酵母粉，15 g瓊脂，加去離子水?dāng)嚢?，煮沸后加去離子水至1000 mL，分裝至錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

MJ-54A高壓自動(dòng)滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-II系列生化培養(yǎng)箱 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀 北京京科瑞達(dá)科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺(tái) 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；FSH-II型高速電動(dòng)勻漿機(jī) 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉孢子培養(yǎng) 將保存的菌種接到CYA培養(yǎng)基斜面上，30 ℃培養(yǎng)5～7 d，用適量去離子無菌水洗斜面，將液體過濾到含玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩打散孢子液后，采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子數(shù)。

1.2.2 金屬離子處理方法 固體培養(yǎng)：取PDA培養(yǎng)基，高溫融化后，分別添加不同濃度的ZnSO4、MnCl2、MgSO4、CuSO4、CoCl2等金屬離子，制作固體平板，待其凝固后，點(diǎn)接紫色紅曲霉孢子。倒置放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)8 d后，拍照。

液體培養(yǎng)：取PDB培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的ZnSO4、MnCl2、MgSO4、CuSO4、CoCl2等金屬離子，不加金屬離子的為對(duì)照，然后分別接種紫色紅曲霉孢子（1×104個(gè)/mL），放于30 ℃，200 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

1.2.3 金屬離子螯合實(shí)驗(yàn) 固體培養(yǎng)：方法同1.2.2，制備含不同濃度的8-羥基喹啉（0、10、20 μmol/L）的固體平板，培養(yǎng)后觀察、拍照。

液體培養(yǎng)：方法同1.2.2，不同濃度的8-羥基喹啉（0、10、20 μmol/L），然后分別接種紫色紅曲霉孢子恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

1.2.4 次生代謝產(chǎn)物的測(cè)定 紅曲色素的測(cè)定：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，將發(fā)酵液連同菌體一起勻漿，取適量的勻漿液于60 ℃萃取1 h后，離心取上清即為水溶總色素；取300 μL勻漿液，加入700 μL無水乙醇，于60 ℃萃取1 h后，離心取上清即為醇溶總色素。然后用紫外分光光度計(jì)在410、46、500 nm下測(cè)得OD值，色素含量（U/g）=OD×稀釋倍數(shù)（U）/生物量（g）。

莫納克林K的測(cè)定：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，將發(fā)酵液連同菌絲體用高速勻漿機(jī)搗碎后取500 μL勻漿液，加入等體積的乙酸乙酯劇烈震蕩后高速冷凍離心，取上清放真空干燥箱中干燥，加入0.5 mL苯除雜，放置60 ℃烘箱烘干，加入1 mL 95%乙醇溶解，用紫外分光光度計(jì)在238 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.051x+0.003，計(jì)算其含量（mg/L）。

桔霉素的測(cè)定：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，取發(fā)酵液上清，加入等體積萃取劑（甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:1，V:V:V），劇烈震蕩后，離心取最上層，用0.45 μm有機(jī)溶劑濾膜過濾后采用HLPC測(cè)其濃度。使用的柱子為C18（5 μm，250 mmol/L×4.6 mmol/L）。檢測(cè)條件：流動(dòng)相為乙腈（色譜純加入0.05%的三氟乙酸）：超純水（加入0.05%三氟乙酸）=3:1，使用二極管陣列檢測(cè)器（Agilent），流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，在330 nm波長下檢測(cè)桔霉素含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=66.456x+45.782，計(jì)算其含量（mg/L）。

γ-GABA的測(cè)定：測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[24]，將發(fā)酵好的菌體烘干，充分研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取一定量的粉末溶解于適量的蒸餾水，搖勻后超聲提取1 h（20 kHz、90 W、30 ℃），2400×g，離心15 min，取上清1 mL，用紫外分光光度計(jì)在640 nm處測(cè)定其吸光值，并代入回歸方程算出濃度，計(jì)算菌體γ-GABA的產(chǎn)量（mg/g）。產(chǎn)量（mg/g）=濃度×稀釋倍數(shù)/菌體質(zhì)量。

生物量的測(cè)定：測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，將發(fā)酵液收集到離心管中離心（9600×g，10 min），收集沉淀，用去離子水洗滌沉淀3遍后，將其置于60 ℃烘箱烘至恒重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件Graphpad prism 8.01進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析，以mean±SD表示計(jì)量資料，組間分析采用multiple t tests-one per row方法。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)操作三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝的影響

固態(tài)培養(yǎng)條件下，隨著CuSO4濃度（1、2、5 mmol/L）的增加，紫色紅曲霉的生長逐漸受到抑制（圖1），5 mmol/L時(shí)對(duì)菌體生長抑制最明顯，氣生菌絲明顯減少。而不同濃度的CuSO4均能明顯改變紫色紅曲霉的色素合成（圖1），與對(duì)照相比，CuSO4處理的菌體顏色明顯加深，表明色素含量高。即CuSO4能顯著刺激紫色紅曲霉色素合成，且高濃度情況下明顯抑制菌體生長。

圖1 不同濃度的CuSO4對(duì)紫色紅曲霉固態(tài)培養(yǎng)時(shí)生長和色素合成的影響Fig.1 Influence of CuSO4 on growth and pigments of M.purpureus in solid-state fermentation(SSF)

在液體培養(yǎng)條件下，CuSO4（0.5、1、2、5 mmol/L）對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝的影響與固態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果差異懸殊（圖2）。在低濃度下，CuSO4對(duì)紫色紅曲霉的生長無影響（圖2a），而在高濃度（2、5 mmol/L）時(shí)，則完全抑制菌體生長。低濃度的CuSO4（0.5 mmol/L）能顯著刺激紅曲色素的合成（圖2b、圖2c），其中水溶紅（OD500）、橙（OD465）、黃（OD410）色素產(chǎn)量分別提高了2.01、2.07和1.73倍，差異極顯著（P＜0.01）；醇溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別提高了2.83、1.74和1.95倍，差異顯著（P＜0.05）。相對(duì)于對(duì)照，CuSO4（0.5、1 mmol/L）處理，導(dǎo)致莫納克林K產(chǎn)量分別提升了1.78和1.58倍（圖2d），差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于真菌毒素桔霉素而言，CuSO4（0.5、1 mmol/L）對(duì)其合成的促進(jìn)效果最為顯著，相較于對(duì)照，處理組的桔霉素含量分別提高了5.53和2.61倍（圖2e）。然而，與上述代謝物相反的是，γ-氨基丁酸（GABA）的合成則被CuSO4（0.5、1 mmol/L）嚴(yán)重抑制，其產(chǎn)量分別下降了81.5%和62.7%（圖2f）。上述結(jié)果表明，Cu2+對(duì)紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成具有明顯刺激作用，而對(duì)GABA合成則存在強(qiáng)烈抑制效應(yīng)。

2.2 Zn2+對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝的作用

與CuSO4的效應(yīng)類似，隨著ZnSO4濃度（0.5、1、5 mmol/L）的增加，紫色紅曲霉的生長逐漸受到抑制（圖3），5 mmol/L時(shí)對(duì)菌體生長抑制最明顯。對(duì)于次生代謝物紅曲色素的合成，ZnSO4具有明顯的促進(jìn)效應(yīng)。

ZnSO4（0.25、0.5 mmol/L）對(duì)液態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和次生代謝合成的作用也類似于CuSO4，低濃度下對(duì)菌體生長無顯著影響（圖4a）。對(duì)于次生代謝物而言，高濃度ZnSO4（0.5 mmol/L）對(duì)紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成具有強(qiáng)烈的刺激作用。其中，水溶紅、橙、黃色素的產(chǎn)量較對(duì)照菌分別提高了93.3%、78.6%、57.6%，差異顯著（P＜0.05）（圖4b）；醇溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別提高了3.9、2.54和1.54倍（圖4c）。相對(duì)于對(duì)照，ZnSO4（0.5 mmol/L）處理導(dǎo)致莫納克林K和桔霉素的產(chǎn)量分別提升了92.2%和6.91倍（圖4d、圖4e），差異顯著（P＜0.05）。同樣，ZnSO4也顯著（P＜0.05）抑制GABA的合成，高濃度條件下抑制效應(yīng)更明顯（圖4f）。綜上所述，高濃度Zn2+顯著（P＜0.05）促進(jìn)紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成，嚴(yán)重抑制GABA的合成。

圖2 CuSO4（mmol/L）對(duì)紫色紅曲霉液態(tài)培養(yǎng)時(shí)生長和次生代謝物合成的影響Fig.2 Influence of CuSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in submerged fermentation (SMF)

圖3 ZnSO4對(duì)固態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.3 Influence of ZnSO4 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

2.3 Mg2+調(diào)控紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成

MgSO4處理的結(jié)果表明，0.25 mmol/L濃度可以促進(jìn)紅曲霉的氣生菌絲生長，而高濃度（0.5 mmol/L）條件對(duì)菌絲生長具有一定抑制作用（圖5，正面）。同時(shí)，MgSO4處理能加深菌體顏色（圖5，反面），相對(duì)于對(duì)照菌，處理的菌體呈深紅色，表明MgSO4促進(jìn)了紅曲色素的合成。

MgSO4（0.25、0.5 mmol/L）對(duì)液態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長無顯著影響（圖6a）。對(duì)于次生代謝物而言，MgSO4（0.5 mmol/L）對(duì)紅曲色素、莫納克林K合成具有強(qiáng)烈的刺激作用。其中，水溶紅、橙、黃色素的產(chǎn)量較對(duì)照菌分別提高了2.68、2.25和2.02倍，差異顯著（圖6b）（P＜0.05）；醇溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別提高了1.26、1.23和1.82倍（圖6c）。低濃度MgSO4（0.25 mmol/L）可顯著促進(jìn)水溶色素的合成，分別提高了1.04、1.05和1.01倍。相對(duì)于對(duì)照，MgSO4（0.5 mmol/L）處理導(dǎo)致莫納克林K產(chǎn)量提升了51.8%（圖6d），差異顯著（P＜0.05）。低濃度MgSO4能顯著提升桔霉素的產(chǎn)量，相對(duì)于對(duì)照，其產(chǎn)量增加了1.79倍（圖6e）。同樣，MgSO4也明顯抑制GABA的合成，高濃度條件下抑制效應(yīng)更明顯（圖6f）。綜上所述，適宜濃度的Mg2+能顯著（P＜0.05）促進(jìn)紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成，而高濃度Mg2+則嚴(yán)重抑制GABA的合成。

圖4 ZnSO4（mmol/L）對(duì)態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.4 Influence of ZnSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖5 MgSO4對(duì)固態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.5 Influence of MgSO4on growth and pigments of M.purpureus in SSF

2.4 Mn2+對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的調(diào)控作用

從圖7可以看出，相對(duì)于對(duì)照菌，MnCl2可以促進(jìn)紅曲霉的氣生菌絲生長，高濃度MnCl2（5 mmol/L）對(duì)菌絲生長無抑制作用（圖5，正面）。同時(shí)，MnCl2處理導(dǎo)致紅曲色素產(chǎn)量增加（圖5，反面）。

圖8的數(shù)據(jù)表明，MnCl2（0.5、1 mmol/L）對(duì)紫色紅曲霉生長無明顯抑制作用（圖8a）。對(duì)于水溶紅曲色素有一定的刺激作用（圖8b），但不顯著（P＞0.05），而MnCl2（0.5 mmol/L）可以顯著刺激醇溶色素的合成，相對(duì)于對(duì)照組，醇溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別提高了131.1%、83.6%和49.2%（圖8c）。而MnCl2（0.5、1 mmol/L）處理則顯著促進(jìn)莫納克林K和桔霉素的合成。其中，0.5 mmol/L的MnCl2導(dǎo)致莫納克林產(chǎn)量較對(duì)照組提高了2.01倍（圖8d）；MnCl2（0.5、1 mmol/L）使桔霉素的產(chǎn)量則分別增加了39.6%和92.3%（圖8e）。高濃度MnCl2處理則導(dǎo)致GABA的產(chǎn)量降低，相對(duì)于對(duì)照降低了61.1%，而僅在高濃度MnCl2處理時(shí)，差異顯著（P＜0.05）。即MnCl2處理的數(shù)據(jù)表明，低濃度Mn2+（0.5 mmol/L）顯著促進(jìn)醇溶紅曲色素的合成，高濃度Mn2+（1 mmol/L）導(dǎo)致GABA產(chǎn)量顯著（P＜0.05）降低；而Mn2+（0.5、1 mmol/L）則顯著（P＜0.05）刺激莫納克林K和桔霉素的合成。

圖6 MgSO4（mmol/L）對(duì)態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.6 Influence of MgSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖7 MnCl2對(duì)固態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.7 Influence of MnCl2 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

2.5 Co2+對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的影響

與上述金屬離子的效應(yīng)不同的是，CoCl2（0.5、1、5 mmol/L）嚴(yán)重抑制固態(tài)培養(yǎng)時(shí)的紫色紅曲霉的生長，該抑制效應(yīng)具有明顯的劑量效應(yīng)，5 mmol/L時(shí)紅曲霉無法生長（圖9，正面）。同時(shí)，CoCl2也抑制紅曲色素的產(chǎn)量（圖5，反面）。

同固態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果相似，CoCl2（0.5、1 mmol/L）顯著（P＜0.05）抑制液態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉生長（圖10a），生物量分別降低了47.9%和53.7%。次生代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CoCl2（0.5、1 mmol/L）可以顯著刺激醇溶色素的合成，相對(duì)于對(duì)照，醇溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別提高了4.04、5.04、2.63倍和3.08、3.41、2.7倍（圖10c），差異顯著（P＜0.05）。而高濃度CoCl2（1 mmol/L）顯著抑制水溶色素和莫納克林K的合成，相對(duì)于對(duì)照組，水溶紅、橙、黃色素產(chǎn)量分別降低了69.7%、65.7%和64.4%（圖8b）；而莫納克林K產(chǎn)量降低不顯著。CoCl2（0.5、1 mmol/L）則幾乎完全抑制桔霉素合成，從峰面積可以看出，桔霉素合成嚴(yán)重受阻（圖10e）。同樣，CoCl2（0.5、1 mmol/L）也嚴(yán)重抑制GABA的合成，相對(duì)于對(duì)照，其產(chǎn)量分別降低了92.7%和74.5%。這些表明，Co2+對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成具有強(qiáng)烈的負(fù)調(diào)控效應(yīng)。

2.6 金屬離子螯合劑對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝物的作用

圖8 MnCl2對(duì)態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.8 Influence of MnCl2on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖9 CoCl2顯著抑制固態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和色素合成Fig.9 Inhibitory effect of MnCl2 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

固態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬離子螯合劑8-羥基喹啉在高濃度下（60 μmol/L）可以完全抑制紫色紅曲霉的生長（圖片未顯示），而在低濃度（10、20 μmol/L）下，對(duì)菌體生長無明顯影響，且對(duì)色素合成有一定的抑制作用（圖11）。

液態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果表明，HQ對(duì)紫色紅曲霉生長具有抑制效應(yīng)，相對(duì)于對(duì)照，20 μmol/L條件下迫使紫色紅曲霉生物量下降了26.9%，差異顯著（P＜0.05）。其次，HQ（10、20 μmol/L）對(duì)于次生代謝物的合成具有不同的效應(yīng)。高濃度HQ（20 μmol/L）顯著（P＜0.05）抑制水溶色素合成，與對(duì)照相比，其水溶紅、橙、黃色素分別降低了40.6%、34.3%和26%（圖12b）。而醇溶色素合成則被HQ刺激（圖12c），HQ（10、20 μmol/L）處理導(dǎo)致醇溶紅、橙、黃色素分別提高了1.72、1.19、0.8倍，和1.91、1.59、0.76倍。對(duì)于莫納克林K而言，低濃度HQ具有促進(jìn)效應(yīng)，高濃度無影響。低濃度HQ使得莫納克林K的產(chǎn)量升高了1倍（圖12d）。HQ對(duì)桔霉素和GABA的合成具有顯著的抑制作用，其中高濃度HQ的抑制作用最強(qiáng)（圖12e、圖12f）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度HQ對(duì)紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成具有抑制作用。

2.7 金屬離子及螯合劑對(duì)紫色紅曲霉次生代謝物譜的影響

紫外分光光度計(jì)波譜掃描（200～600 nm）的結(jié)果顯示（圖13），相對(duì)于對(duì)照，金屬離子顯著改變了紫色紅曲霉的主要次生代謝物譜，未見其他新代謝物。表明金屬離子處理調(diào)節(jié)紫色紅曲霉主要次生代謝物產(chǎn)量的變化，未改變代謝物種類。

圖10 CoCl2抑制液態(tài)培養(yǎng)時(shí)紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成Fig.10 Inhibitory effect of CoCl2 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖11 8-羥基喹啉對(duì)固態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的影響Fig.11 Influence of 8-Hydroxyquinoline(HQ) on growth and pigments of M.purpureusin SSF

3 討論

金屬離子作為必要的營養(yǎng)元素，參與微生物的生長和代謝，而金屬離子調(diào)節(jié)微生物次生代謝合成的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面[9]：作為輔因子或激活劑調(diào)控次生代謝物關(guān)鍵酶的活性或合成基因的表達(dá)。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+是次生代謝合成關(guān)鍵酶（氧化酶、加氧酶、抗氧化酶等）的輔因子，在細(xì)胞水平和分子水平對(duì)真菌生長及真菌毒素的合成具有調(diào)節(jié)效應(yīng)。Cu2+對(duì)于青霉素的合成、白色念珠菌（Canidia albicans）等真菌的形態(tài)發(fā)育至關(guān)重要，同時(shí)還能促進(jìn)內(nèi)生真菌（Paraphaeosphaeriaquadriseptata）莫納克林I的合成。Cu2+和Mn2+、Zn2+等離子能刺激串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）萘醌的合成。Mn2+抑制畸形素和白霉素的合成，促進(jìn)棒曲霉素的合成。真菌毒素的合成高度依賴于可用的Zn2+濃度。鐮刀菌酸、黃曲霉毒素、赭曲霉素和桔霉素等真菌毒素的合成受Zn2+井然有序的調(diào)控。Zn2+還通過調(diào)控關(guān)鍵酶LovD、LoV活性刺激洛伐他?。{克林K）的合成；刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，誘發(fā)氧化脅迫，進(jìn)而刺激具有抗氧化功能的次生代謝物（色素、類胡蘿卜素、真菌毒素及其他聚酮化合物等）合成，維持氧化還原平衡。Co2+和其他金屬離子一樣，可以導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生，反而會(huì)刺激抗氧化功能的次生代謝物比如色素、真菌毒素的合成，以發(fā)揮自由基清除能力，這種策略在產(chǎn)色素霉菌中屢見不鮮；作為信號(hào)分子，啟動(dòng)或激活次生代謝物合成。Cu2+還可以作為信號(hào)分子激活尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumZZF51）的鐮刀菌酸的合成。真菌次生代謝物合成的啟動(dòng)和調(diào)控依賴于精確的Zn2+濃度，比如雜色曲霉素A、交鏈孢酚、棒曲霉素等聚酮化合物的合成啟動(dòng)需要精準(zhǔn)的微摩爾級(jí)Zn2+調(diào)控；參與初級(jí)代謝進(jìn)而影響次生代謝合成。

圖12 8-羥基喹啉（μmol/L）對(duì)固態(tài)培養(yǎng)條件下紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的影響Fig.12 Influence of 8-hydroxyquinoline(HQ) on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SSF

圖13 紫色紅曲霉發(fā)酵液波譜掃描圖Fig.13 Spectral scanning of fermented broth of M.purpureus

紫色紅曲霉產(chǎn)生的紅曲色素、莫納克林K和桔霉素都是聚酮化合物，三者具有相同的合成前體單元，比如乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A等。乙酰輔酶A在羧化酶作用下產(chǎn)生丙二酰輔酶A，而Mg2+正是乙酰輔酶A羧化酶的輔因子，參與調(diào)控各種次生代謝物的合成[9,25]。Mg2+可能通過影響此酶活性進(jìn)而對(duì)紫色紅曲霉的上述代謝物的合成進(jìn)行調(diào)控。上述中間體在各自代謝物生物合成酶催化下依次合成，其中，上述2種前體和中鏈脂肪酸在聚酮合酶等酶催化下最終合成各種紅曲色素[5]。而Mn2+對(duì)脂肪酸的合成具有重要的調(diào)控作用[9]，這可能是Mn2+促進(jìn)紅曲色素合成的一個(gè)原因。上述3種聚酮化合物利用相同的合成前體，利用各自的合成基因簇編碼各種酶，有序地催化每一個(gè)合成步驟。在每個(gè)基因簇內(nèi)都有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，比如PigR、MoH和CtnR分別負(fù)責(zé)調(diào)控各自簇內(nèi)基因的表達(dá)，最終控制紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的產(chǎn)量。而PigR、MoH和CtnR3個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上都存在Zn2Cys6鋅指簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[26-28]。Zn2+則是這些鋅指蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵，因此，Zn2+刺激3種聚酮化合物的合成，可能與此有關(guān)。此外，金屬離子超載，都會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平激增，進(jìn)而誘發(fā)氧化脅迫[9]，而過多的ROS會(huì)刺激包括紅曲色素、莫納克林K及毒素桔霉素在內(nèi)的具有抗氧化功能的代謝物合成，進(jìn)而清除ROS，維持胞內(nèi)氧化還原平衡。本研究所用離子均具有氧化還原平衡功能，其中Mg2+、Zn2+、Mn2+和Mn2+還是超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）等抗氧化酶的輔因子。因此，金屬離子可能通過影響抗氧化酶活性介入氧化還原平衡，并以此對(duì)紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成進(jìn)行調(diào)控。Co2+通過間接作用負(fù)責(zé)能量物質(zhì)的合成，通常對(duì)色素合成發(fā)揮負(fù)調(diào)控效應(yīng)，當(dāng)然還與其濃度過高有關(guān)[9]。對(duì)于GABA而言，高濃度的金屬離子都具有抑制效應(yīng)，或許過量的金屬離子破壞了其合成酶谷氨酸脫羧酶的活性[29]，進(jìn)而導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。關(guān)于上述金屬離子對(duì)紫色紅曲霉的主要次生代謝合成的調(diào)控機(jī)制，有待下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+）脅迫，結(jié)合金屬離子螯合實(shí)驗(yàn)，考察了不同金屬離子對(duì)紅曲霉生長和主要次生代謝物譜的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)高濃度的金屬離子對(duì)紫色紅曲霉生長具有不同程度的抑制作用，而且液體培養(yǎng)的抑制效果遠(yuǎn)超過固體培養(yǎng)，其中Co2+的抑制效應(yīng)最顯著。金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+）在適宜濃度下均能刺激MP、MK和CTN的合成，而Co2+則普遍抑制上述次生代謝物的合成。其次，高濃度的金屬離子均對(duì)GABA的合成具有抑制效應(yīng)。金屬離子螯合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HQ處理導(dǎo)致水溶MP、MK、CTN、GABA產(chǎn)量發(fā)生不同程度的降低，并對(duì)菌體生長具有明顯的抑制效應(yīng)，佐證了金屬離子對(duì)上述代謝物的調(diào)控作用。發(fā)酵液的波譜掃描表明，金屬離子對(duì)代謝物種類并無顯著影響。研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示金屬離子調(diào)控紅曲霉次生代謝合成的內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。