小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料研制及其對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

李 奕

（中國戲曲學(xué)院體育部，北京 100073）

小球藻屬于綠藻門小球藻科的單細(xì)胞綠藻，含有多糖、蛋白質(zhì)、維生素、食用纖維及多種礦物元素。有研究顯示[1-2]，其主要成分多糖的體外抗氧化作用較好，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，Okada等[3]指出該多糖緩解機(jī)體疲勞的活性較乳糖有顯著性差異，因此被大量用于保健食品的研究開發(fā)。由于藻類食品通常存在特殊腥味，受歡迎程度較低，龐庭才等將其制備成相關(guān)發(fā)酵乳及復(fù)合飲料，以改善口感[4-5]；而史瑞琴等[6]則利用小球藻多糖制備相應(yīng)口服液，使得口感提升。紫果西番蓮是西番蓮科多年木質(zhì)藤本植物的果實(shí)，氣味芬香濃郁，被贊譽(yù)為“果汁之王”，富含多糖、有機(jī)酸、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[7-8]，賀銀菊等[9]通過超聲輔助提取其果肉多糖，發(fā)現(xiàn)其對(duì)活性氧自由基的清除作用較好。

由于運(yùn)動(dòng)性疲勞通常源于機(jī)體運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，促使體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，造成組織損傷和肌肉收縮能力下降、出現(xiàn)“身心俱?！爆F(xiàn)象[10-11]。而一般天然化合物的體內(nèi)外活性高度相關(guān)[12]，且目前尚未有文獻(xiàn)公開探討小球藻與紫果西番蓮相關(guān)食品的體內(nèi)抗疲勞活性，因此本研究以上述兩種物質(zhì)的多糖為原料，利用紫果西番蓮抑制小球藻異味，研制小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料，通過相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的影響，從而為相關(guān)運(yùn)動(dòng)食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康雄性小鼠 150只，體質(zhì)量19～25 g，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SYXK（京） 2015-0046），生長環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%；小球藻粉

西安瑞爾麗生物工程有限公司；紫果西番蓮、蔗糖

北京明光寺水果批發(fā)市場；西洋參口服液 山東鶴王生物工程有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院；苯酚、硫酸均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸 濟(jì)南鑫越化工有限公司；羧甲基纖維素鈉 河北百優(yōu)生物科技有限公司；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

YP-1000型電子天平 上海越平儀器有限公司；TL-150Y型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 江蘇天翎儀器有限公司；PHS-3C型雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；X5型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；FB-110Q型高壓均質(zhì)機(jī) 上海勵(lì)途超高壓設(shè)備有限公司；BKQ-B75II型立式壓力蒸汽滅菌器 愛來寶（濟(jì)南）醫(yī)療科技有限公司；ZX-2200DE型超聲波器 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；FD-1A-80型真空冷凍干燥機(jī) 上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司；H1850R型臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀檢測設(shè)備有限公司；動(dòng)物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 小球藻多糖提取 以蒸餾水為提取溶劑，小球藻粉以1:20質(zhì)量體積比，于100 W超聲破碎，97 ℃熱水浸提3 h后，在8000 r/min下離心10 min，取上清液，加入4%三氯乙酸，4 ℃靜置過夜離心（8000 r/min、10 min），取上清液加入95%乙醇，4 ℃靜置過夜離心（8000 r/min、10 min）取沉淀，冷凍干燥即得小球藻粗多糖[6]。

1.2.2.2 紫果西番蓮多糖提取 以蒸餾水作提取溶劑，紫果西番蓮果肉以1:5質(zhì)量體積比，于330 W超聲破碎，70 ℃熱水浸提30 min后離心（5000 r/min、10 min），濾液冷凍干燥即得紫果西番蓮粗多糖[8]。

1.2.2.3 調(diào)配 50%小球藻多糖水溶液和50%紫果西番蓮多糖水溶液以固定比例混合后，加入一定劑量食品添加劑（相對(duì)多糖混合液的百分比）調(diào)配。

1.2.2.4 均質(zhì)、灌裝與滅菌 調(diào)配后的料液均質(zhì)攪拌2次后灌裝（溫度：60～70 ℃，壓力：20～25 MPa），于121 ℃滅菌10 min，冷卻，即得小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料[13]。

1.2.3 復(fù)合飲料配方優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比、蔗糖用量、檸檬酸用量及羧甲基纖維素鈉用量對(duì)小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料的感官評(píng)分和離心沉降率的影響，具體如下：（1）固定蔗糖用量3%、檸檬酸用量0.2%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）的影響；（2）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、檸檬酸用量0.2%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察蔗糖用量（1%、3%、5%、7%、9%）影響；（3）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖用量3%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察檸檬酸用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的影響；（4）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖用量3%、檸檬酸用量0.2%，考察羧甲基纖維素鈉（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）用量的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以兩種物質(zhì)多糖溶液體積比（A）、蔗糖（B）、檸檬酸（C）和羧甲基纖維素鈉（D）的用量為響應(yīng)因素，感官得分為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化各組分配比，試驗(yàn)因素水平見表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 飲料感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

1.2.4.1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參考相關(guān)飲料評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]，并結(jié)合小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料特性，制定該復(fù)合飲料的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，具體見表2所示，同時(shí)邀請(qǐng)10位食品專業(yè)人員，分別按照該標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同組分配比制得的飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，最終評(píng)分取結(jié)果的平均值。

表2 飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of the beverage

1.2.4.2 離心沉淀率 稱取復(fù)合飲料m0，置于離心管中，以3000 r/min，離心10 min后，對(duì)管內(nèi)上清液稱重記為m，照公式W（%）=（m0- m）/m0計(jì)算飲料的離心沉淀率W（%），平行測定六次[16]。

1.2.5 理化指標(biāo)檢測

1.2.5.1 pH值測定 利用pH計(jì)檢測復(fù)合飲料的pH值。

1.2.5.2 多糖含量測定 葡萄糖對(duì)照品經(jīng)120 ℃干燥恒重后，按照文獻(xiàn)操作步驟[17]，分別加入苯酚與濃硫酸預(yù)處理樣品后，于490 nm波長測定吸光度值，另作空白對(duì)照，隨后以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.026x+0.052 （r=0.9989），另于相同波長下測定該復(fù)合飲料的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算其多糖含量。

1.2.6 微生物指標(biāo)檢測 按照國家標(biāo)準(zhǔn)操作步驟[18]，分別檢測小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料的微生物菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌。

1.2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 分組與給藥設(shè)計(jì) 150只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為五組，即空白對(duì)照組，陽性對(duì)照組，復(fù)合飲料低、中、高劑量組，每組各30只，陽性對(duì)照組給予西洋參口服液灌胃0.20 mL/（g·d），低、中、高劑量組則分別灌胃復(fù)合飲料0.10、0.20、0.30 mL/（g·d），而空白對(duì)照組則以0.85%生理鹽水替代飲料灌胃，全部動(dòng)物每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[19]。

1.2.7.2 負(fù)重游泳試驗(yàn) 末次灌胃后，各組動(dòng)物于鼠尾負(fù)重5%體重重物，置于25 ℃游泳池內(nèi)開展負(fù)重游泳試驗(yàn)，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時(shí)間，即為動(dòng)物力竭游泳時(shí)間[20]。

1.2.7.3 體內(nèi)生化指標(biāo)檢測 負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)束后，快速切除動(dòng)物肝臟，制成10%肝臟勻漿，按照相關(guān)試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠體內(nèi)的丙二醛（MDA）濃度及總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物歧化酶（GSH-Px）活力[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)均采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比對(duì)飲料品質(zhì)影響 不同小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比對(duì)飲料的品質(zhì)影響，結(jié)果見圖1。當(dāng)小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比為1:2時(shí)，復(fù)合飲料的感官得分最高，此時(shí)溶液為淺黃綠色、透亮，且酸甜適中。若紫果西番蓮多糖用量過多，溶液澄清度下降，離心沉淀率超過1%，而小球藻多糖用量過多，則飲料又異味明顯，為便于響應(yīng)面試驗(yàn)條件考察，因此確定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1.5:1、1:1、1:2作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖1 溶液體積比對(duì)飲料感官評(píng)價(jià)的影響Fig.1 Effect of volume ratios on the sensory evaluation of beverage

2.1.2 蔗糖用量對(duì)飲料品質(zhì)的影響 不同蔗糖用量對(duì)飲料的品質(zhì)影響，結(jié)果見圖2。從圖2可見，隨著蔗糖用量增多，飲料的感官評(píng)分先增大后減小，離心沉淀率基本不變，這可能歸因于蔗糖用量較少，溶液澀味較重，但過多又甜味突出，因此選擇蔗糖用量1%、3%、5%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖2 蔗糖用量對(duì)飲料感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effect of sucrose amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.3 檸檬酸用量對(duì)飲料品質(zhì)的影響 檸檬酸的添加不僅豐富飲料的口感，同時(shí)可調(diào)節(jié)溶液的酸堿性質(zhì)，使得飲料品質(zhì)長期穩(wěn)定，因此考察不同檸檬酸用量對(duì)飲料的品質(zhì)影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，當(dāng)檸檬酸用量達(dá)到0.2%再增加時(shí)，飲料的感官評(píng)分開始下降，且離心沉淀率不斷升高，這可能源于檸檬酸用量過多，會(huì)導(dǎo)致飲料的酸味明顯，口感變差，而兩種多糖在弱酸性條件溶解性較好，因此選擇檸檬酸的用量0.1%、0.2%、0.3%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖3 檸檬酸用量對(duì)飲料感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Effect of citric acid amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.4 羧甲基纖維素鈉對(duì)飲料品質(zhì)的影響 由于小球藻和紫果西番蓮的多糖提取物中仍含有蛋白質(zhì)、氨基酸等高分子雜質(zhì)，致使飲料長期存放時(shí)，容易出現(xiàn)分層，因此采用羧甲基纖維素鈉改善飲料的長期穩(wěn)定性，考察不同羧甲基纖維素鈉用量對(duì)飲料的品質(zhì)影響，結(jié)果見圖4。從圖4可知，隨著羧甲基纖維素鈉用量遞增，感官評(píng)分逐漸升高，至0.3%后才下降。這歸因于羧甲基纖維素鈉的添加，有助于溶液的離心沉淀率下降，但用量過多會(huì)造成溶液黏稠，進(jìn)而影響口感，因此選擇羧甲基纖維素鈉用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應(yīng)面因素考察水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

圖4 羧甲基纖維素鈉用量對(duì)飲料感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of sodium carboxymethylcellulose amount on the sensory evaluation of beverage

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 按照Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，分別以小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比（A）、蔗糖（B）、檸檬酸（C）及羧甲基纖維素鈉（D）用量為響應(yīng)面考察因素，感官評(píng)分為（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以感官得分為目標(biāo)函數(shù)，各參數(shù)編碼值的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=84.97+2.64A+0.78B+1.20C+0.23D+0.14AB-0.56AC+0.45AD-0.082BC-0.22BD-0.22CD-0.40A2-0.73B2-0.79C2-0.16D2，對(duì)該模型進(jìn)行顯著檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4所示。

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

從表4可知，該回歸模型P＜0.01，表明該模型回歸效果顯著，較好反映實(shí)際結(jié)果，R2=0.9222顯示模型擬合值與實(shí)際結(jié)果高度相關(guān)，而失擬項(xiàng)P=0.7752表明該模型方程不顯著（P＞0.05）可準(zhǔn)確反映各因素與響應(yīng)值關(guān)系，一次項(xiàng)A、B、C對(duì)飲料的感官得分影響均極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)B2、C2對(duì)感官得分影響也均顯著（P＜0.05），但交互項(xiàng)AB、AC、BC、CD、AD、BD的影響均不顯著（P＞0.05），另從表中F值得到，各因素對(duì)飲料的感官得分影響順序?yàn)椋盒∏蛟迮c紫果西番蓮的多糖溶液體積比（A）＞檸檬酸用量（C）＞蔗糖用量（B）＞羧甲基纖維素鈉用量（D）。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 圖5為不同考察因素的交互作用對(duì)飲料的感官得分影響，響應(yīng)曲面越陡峭，感官得分(Y)受不同因素的交互作用影響越大[22-23]，從圖5可知，兩兩因素交互響應(yīng)面坡面陡峭順序?yàn)椋篈C＞AD＞CD＞BD＞AB＞BC，即兩種物質(zhì)多糖溶液體積比和檸檬酸用量的交互作用響應(yīng)面最陡峭，表明二者交互作用對(duì)飲料的感官品質(zhì)影響最大，另對(duì)二次多項(xiàng)回歸擬合方程進(jìn)行極值分析，確定小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料的最佳配方為：小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖2.35%、檸檬酸0.14%、羧甲基纖維素鈉0.4%，最高預(yù)測值為87.94分，按照1.2.4.1步驟評(píng)價(jià)，實(shí)際得分為（88.71±0.87）分，表明該回歸模型可較好預(yù)測復(fù)合飲料的最佳配方。

2.3 復(fù)合飲料的質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果

采用上述最佳配方制得的復(fù)合飲料呈淺黃綠色、色澤均一，紫果西番蓮香味濃郁，酸甜適中，室溫靜置6個(gè)月未有明顯沉淀與分層。該復(fù)合飲料的pH值為5.7；離心沉淀率為0.59%；多糖含量為5.62%；微生物菌落總數(shù)≤100 CFU/100 mL，未有大腸桿菌和其它致病菌檢出。

2.4 復(fù)合飲料對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

負(fù)重游泳試驗(yàn)常被用于考察動(dòng)物力竭游泳時(shí)間，以客觀反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力，利用該試驗(yàn)分別考察各組小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，結(jié)果見表5所示。從表5可見，與空白對(duì)照組相較，中劑量組小鼠的力竭游泳時(shí)間顯著延長（P＜0.05），高劑量組小鼠的力竭游泳時(shí)間極顯著延長 （P＜0.01），而低劑量組力竭游泳時(shí)間雖有一定延長，但無顯著性差異（P＞0.05），另外高劑量組與陽性對(duì)照組的力竭游泳時(shí)間差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），表明一定劑量的復(fù)合飲料有助于提高動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力，但相同劑量的作用效果弱于西洋參。

2.5 復(fù)合飲料對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致機(jī)體耗氧量增加，出現(xiàn)大量活性氧與自由基，進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成丙二醛（MDA），損傷細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA[24]。總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物歧化酶（GSH-Px）是體內(nèi)重要的抗氧化酶，其中T-SOD可有效清除超氧陰離子自由基，使其轉(zhuǎn)化為過氧化氫，隨后被GSH-Px還原成H2O和醇代謝[25]，使得體內(nèi)過氧化作用被減輕，不同組別小鼠運(yùn)動(dòng)后的體內(nèi)MDA含量和T-SOD、GSH-Px活力，見表6所示。

從表6可知，與空白對(duì)照組相較，中、高劑量復(fù)合飲料有助于明顯增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)T-SOD、和GSHPx活力(P＜0.01)，其中T-SOD活力增強(qiáng)率為9.33%、13.95%，GSH-Px活力增強(qiáng)率為10.07%、16.69%，并極顯著降低體內(nèi)生成的MDA含量（P＜0.01），下降率分別為18.18%、41.18%，而低劑量組的T-SOD、GSH-Px活力雖有一定增加，且MDA含量輕微下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），另外高劑量組的T-SOD、GSH-Px與MDA含量與陽性對(duì)照組相較，具有顯著性差異（P＜0.05）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料既能減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，又可提高體內(nèi)抗氧化酶活性，從而增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力。

3 結(jié)論

本研究以小球藻和紫果西番蓮多糖為原料，輔以蔗糖、羧甲基纖維素鈉研制小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料。通過單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到飲料的最佳配方為：小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖2.35%、檸檬酸0.14%、羧甲基纖維素鈉0.4%，感官評(píng)分為（88.71±0.87）分，制得飲料呈淺黃綠色、色澤均一，紫果西番蓮香味濃郁，酸甜適中，靜置后未有明顯沉淀與分層。中、高劑量的小球藻紫果西番蓮多糖復(fù)合飲料可顯著提高動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，既能減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，又可增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，因而具有一定體內(nèi)抗疲勞活性，從而在體育運(yùn)動(dòng)食品領(lǐng)域具有較好推廣前景，但對(duì)該飲料在體內(nèi)抗疲勞活性的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

圖5 兩因素交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of effect interaction between two factors

表5 復(fù)合飲料對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table 5 Effect of compound beverage on exhaustive swimming time of mice

表6 復(fù)合飲料對(duì)MDA含量、T-SOD和GSH-Px活力的影響Table 6 Effect of compound beverage on MDA content and T-SOD,GSH-Px activity of mice