不同滅菌方式人參粉的皂苷含量、指紋圖譜分析及滅菌效果評(píng)價(jià)

白羽辛，王玥玥，貢濟(jì)宇，何文媛，李 妍，蔡廣知

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué), 吉林長(zhǎng)春130000）

人參的藥用部位是根及根莖[1]，具有抗氧化[2-3]、改善記憶力[4]、保護(hù)肝臟[5]、調(diào)節(jié)免疫功能[6-7]、抗腫瘤[8]、抗抑郁[9]等作用。2015版《中國(guó)藥典》中對(duì)人參的用法用量有記載[1]，臨床應(yīng)用中人參粉可輔助治療病毒性心肌炎，提高心臟造血能力，提升機(jī)體免疫力[10]，減輕早搏癥狀[11]。人參粉膠囊還用于治療心絞痛[12]，服用方便的粉類飲片是產(chǎn)業(yè)和消費(fèi)者的共同訴求。因此人參粉的炮制關(guān)鍵技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)研究對(duì)建立科學(xué)全面的人參粉品質(zhì)評(píng)價(jià)體系具有深遠(yuǎn)的意義。

由于口服飲片對(duì)微生物有嚴(yán)格的控制要求，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，人參粉滅菌環(huán)節(jié)至關(guān)重要。中藥滅菌方式有多種，包括60Co輻照滅菌[13]、臭氧法[14]、微波干燥滅菌[15]、紫外滅菌[16]和濕熱滅菌[17-18]等。近年來(lái)藥品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中藥微生物限度要求越來(lái)越嚴(yán)格，隨著中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平與中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的全面提升，如何因藥制宜選擇合適的滅菌方式顯得極其重要[19]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)三七超微粉[20]、天麻、川芎、制何首烏等生藥粉[21]等均有研究。對(duì)于人參粉滅菌方式的相關(guān)研究報(bào)道較少，因此有必要對(duì)人參粉滅菌工藝進(jìn)行考察。

本研究采用HPLC法建立14批不同滅菌方式人參粉樣品指紋圖譜[22]，結(jié)合聚類分析法、偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）[23]以及模型變量投影（VIP）參數(shù)有效區(qū)分不同滅菌方式的人參粉樣品，通過(guò)比較不同滅菌方式對(duì)人參粉皂苷含量及微生物數(shù)量的影響，為選擇和確定人參粉滅菌工藝以及人參粉質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人 參 皂 苷Rf（98.0%）、Rb1（91.1%）、Rg2（93.8%）、Rb2（93.8%）、Rd（92.1%）、Re（97.4%）、Rg1（93.6%） 批號(hào)分別為111719-201505、110704-201726、111779-200801、11715-201203、111818-201603、110754-201626、110703-201731，中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb3（97.6%）、Rc（98.0%）、Ro（98.0%） 批號(hào)分別為68406-26-81、11021-14-0、P15A6F2403，上海源葉科技有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水 超純水。

LC-2030型高效液相色譜儀 日本島津公司；KQ3200DB超聲清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；XFB-500型粉碎機(jī) 上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL204萬(wàn)分之一電子天平、AB135-S十萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；GB 19258紫外殺菌燈 東莞市毅萬(wàn)光源有限公司；LS-35HJ濕熱滅菌鍋 上海精若科學(xué)儀器有限公司；臭氧滅菌器 大連博斯特科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滅菌樣品制備 輻照滅菌樣品按不同劑量3、6、9 kGy制備，紫外滅菌樣品在紫外燈下照射2 h，濕熱滅菌樣品在121 ℃下滅菌10 min，臭氧滅菌樣品濃度為20 g/m3，滅菌時(shí)間為60 min，共14批人參粉樣品，見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2.2 色譜條件 Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；柱溫40 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；梯度洗脫（0～23 min，18%～21% A；23～35 min，21%～28% A；35～80 min，28%～32% A）。

1.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱量對(duì)照品，加甲醇制成含人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd質(zhì)量濃度分別為0.81、0.78、0.41、0.21、0.82、0.80、0.81、0.79、0.18、0.34 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 精密稱定人參粉樣品約1 g，加入20 mL 70%甲醇，稱重，超聲（500 Hz）提取30 min，放冷，以70%甲醇補(bǔ)足至超聲前質(zhì)量，過(guò)0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

1.2.5 人參粉微生物數(shù)量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2015版附錄“微生物限度檢查法”[24]進(jìn)行微生物限度檢查，陰性組為空白培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS23.0進(jìn)行方差分析和聚類分析，SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行PLSDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參粉的殺菌效果評(píng)價(jià)

2.1.1 微生物測(cè)定結(jié)果 2020版《中國(guó)藥典》非無(wú)菌藥品微生物限定標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）規(guī)定含需氧菌總數(shù)≤105cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)≤103cfu/g、不得檢出大腸埃希菌（1 g）；不得檢出沙門菌（1 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于104cfu（1 g）[25]。按照不同稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，可知輻照滅菌劑量高效果好，輻照強(qiáng)度越大，殺菌效果越好。由表2可知，輻照強(qiáng)度為6和9 kGy時(shí)，滅菌效果最佳。紫外滅菌能減少一定的微生物數(shù)量，但效果不佳。濕熱滅菌也能在一定程度上減少微生物的數(shù)量，但不適用于人參粉滅菌，會(huì)導(dǎo)致表面變色、結(jié)塊。

表2 滅菌人參粉微生物結(jié)果Table 2 Microbial results of sterilized ginseng powder

2.1.2 穩(wěn)定性考察 人參粉樣品放置6個(gè)月后，對(duì)樣品（S1～S14）微生物數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，放置6個(gè)月后，人參粉微生物數(shù)量有所上升，但與0個(gè)月（表2）差異不大，表明人參粉陰涼處密封放置時(shí)，微生物數(shù)量較穩(wěn)定。

2.2 HPLC檢測(cè)皂苷

2.2.1 樣品的測(cè)定 按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，混合對(duì)照品和人參粉供試品溶液（編號(hào)S1）色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

表3 滅菌人參粉6個(gè)月后微生物結(jié)果Table 3 Microbial results of sterilized ginseng powder

2.2.2 HPLC指紋圖譜的生成 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004版），以編號(hào)S1為參照譜，因人參皂苷Rb1的峰型較好面積大且穩(wěn)定，因此選擇其為參照峰。14批人參粉供試品溶液色譜圖如圖3所示，共確認(rèn)出30個(gè)共有峰，指認(rèn)出10個(gè)共有峰，本次實(shí)驗(yàn)所建立的指紋圖譜能夠較全面的反映人參粉的指紋圖譜信息。共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表4、表5。

圖1 混合對(duì)照品圖譜Fig.1 Chromatograms of mixed control

圖2 人參粉指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of ginseng powder

圖3 14 批人參粉指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of 14 batches of ginseng powder

表4 共有峰相對(duì)保留時(shí)間（S1～S14）Table 4 Relative retention time of common peaks (S1～S14)

表5 共有峰相對(duì)峰面積（S1～S14）Table 5 Relative peak of common peaks (S1～S14)

表6 人參粉相似度結(jié)果Table 6 Similarity results of ginseng powder

2.2.3 相似度評(píng)價(jià) 整體相似度評(píng)價(jià)14批樣品見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，未滅菌、濕熱滅菌樣品S1、S8、S6、S13的相似度為0.981～0.995，分為一類。輻照滅菌、紫外滅菌S2～S5、S9～S12相似度為0.971～0.977，為一類，臭氧滅菌樣品S7和S14相似度為0.784和0.863，為一類。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性及范圍 精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mL，并稀釋至1 mL，分別吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)（x），色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表7，結(jié)果可知，方程線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)S1），按“1.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，參照峰為人參皂苷Rb1。共有峰相對(duì)峰面積的RSD＜1.62%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.48%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一人參粉供試品溶液（編號(hào)S1），分別于0、4、6、8、12、24h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。共有峰相對(duì)峰面積的RSD＜1.87%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.51%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批人參粉供試品（S12），按“1.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。共有峰相對(duì)峰面積的RSD＜2.74%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.37%，表明重復(fù)性良好。

表7 線性范圍結(jié)果Table 7 Results of linear range

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的人參粉0.5 g，精密稱定9份，按樣品皂苷含有量的50%、100%、150%精密加入對(duì)照品溶液，依色譜條件測(cè)定，計(jì)算得出人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的平均回收率依次為98.68%、98.22%、99.20%、98.67%、98.75%、99.87%、98.63%、99.75%、98.47%、98.95%，RSD依次為0.46%、1.25%、1.23%、1.02%、1.48%、1.20%、1.44%、1.43%、1.37%、1.12%，結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 人參粉滅菌前后皂苷含量測(cè)定結(jié)果

將14批人參粉按“1.2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表8。濕熱滅菌人參皂苷Rg1、Re、Rf的含量升高，人參皂苷Ro、Rc、Rb1、Rb2含量下降，隨著輻照滅菌劑量的升高人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf的含量均明顯升高。臭氧滅菌Rg1、Re、Rb1、Rf、Ro、Rc、Rb2含量均明顯下降。使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析見(jiàn)表9。結(jié)果表明，不同滅菌方式對(duì)人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc含量差異的影響極顯著（P＜0.01），對(duì)人參皂苷Ro、Rb2、Rd含量差異的影響也具有顯著性（P＜0.05）。

2.5 不同滅菌方式人參粉化學(xué)模式分析

2.5.1 聚類分析 以歐式距離為測(cè)度，選用平均連接法，指標(biāo)確定為各共有峰的峰面積，用SPSS 23.0分析，見(jiàn)圖4。歐式距離為7.5～10時(shí)，14批樣品可聚為4類：未滅菌、紫外滅菌、低劑量輻照滅菌樣品（S1、S2、S5、S8、S9、S12）聚為一類，臭氧滅菌樣品（S7、S14）聚為一類，高劑量輻照滅菌樣品（S3、S4、S10、S11）聚為一類，濕熱滅菌樣品（S6、S13）為一類，由聚類分析可知高劑量輻照滅菌、濕熱滅菌、臭氧滅菌對(duì)人參粉皂苷含量影響較明顯。

2.5.2 PLS-DA分析 對(duì)14批樣品進(jìn)行PLS-DA分析，自變量（X）和因變量（Y）確定為共有峰的峰面積和樣品，繪制PLS-DA模型得分圖，詳見(jiàn)圖5。可知，濕熱滅菌、臭氧滅菌樣品（S6、S7、S13、S14）為一類，分布在右側(cè)；未滅菌、紫外滅菌和輻照滅菌人參粉（S1～S5、S8～S12）分布在左側(cè)，聚為一類。相似度評(píng)價(jià)、聚類分析與PLS-DA結(jié)果大體一致。Q2=0.524，R2Y=0.518，均大于0.5，表示所建模型成立。由圖6可知，人參皂苷、Ro、Rc、Rb1的VIP值分別為1.620、1.463、1.099。這3個(gè)峰的VIP值均大于1，可知3個(gè)變量貢獻(xiàn)相對(duì)較大。

表8 人參粉皂苷相對(duì)含量（%）Table 8 Contents determination results of ginseng powder (%)

表9 人參粉皂苷含量的方差分析Table 9 Variance analysis of ginsenoside content in ginseng powder

2.6 滅菌前后穩(wěn)定性考察

圖4 聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram

圖5 PLS-DA模型得分圖Fig.5 PLS-DA score plot

圖6 共有峰的VIP值Fig.6 VIP value of common peaks

人參粉樣品放置6個(gè)月后，采用“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品（S1～S7）測(cè)定，對(duì)比放置6個(gè)月樣品（S1～S7）滅菌前與滅菌后含量變化見(jiàn)表10。結(jié)果可知，放置6個(gè)月過(guò)程中皂苷變化較小，含量相對(duì)穩(wěn)定。

表10 皂苷含量穩(wěn)定性考察Table 10 Stability of content of saponins

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC指紋圖譜能較好的反映人參粉的整體特征，紫外滅菌對(duì)樣品皂苷含量影響不大，能有效減少微生物數(shù)量，但不能達(dá)到藥典要求。濕熱滅菌人參皂苷Rg1、Re的含量升高，人參皂苷Ro、Rc、Rb1、Rb2含量下降，會(huì)使人參粉變色、結(jié)塊，故不能用于人參粉滅菌。由滅菌樣品（S2～S4、S9～S11）可知，隨著輻照滅菌劑量的升高人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf、Ro的含量均明顯升高，其余皂苷含量無(wú)明顯變化。臭氧滅菌指紋圖譜的相似度較低，分析原因臭氧滅菌后的人參粉可能發(fā)生了皂苷轉(zhuǎn)化。CFDA 2015年版本的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》建議中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過(guò)10 kGy，且滅菌放置6個(gè)月相對(duì)穩(wěn)定，結(jié)合微生物數(shù)量和皂苷含量結(jié)果，可知人參粉選用輻照滅菌劑量為6 kGy是可行的。本實(shí)驗(yàn)可為人參粉滅菌工藝提供理論支撐，但滅菌后的人參粉中多糖、還原糖、蛋白質(zhì)含量、抗氧化活性以及藥效作用是否存在變化，是否能夠保證人參粉臨床應(yīng)用的有效性和安全性，有待今后進(jìn)一步研究。