三葉木通籽油提取方法對(duì)比及超臨界CO2萃取法工藝優(yōu)化

李偉業(yè)，吳海順，于華忠

（吉首大學(xué), 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南張家界 427000）

三葉木通（Akebia trifoliata（Thunb.）koidz）是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的落葉木質(zhì)藤本植物，俗名八月瓜、金腎果、野香蕉，果實(shí)是中藥預(yù)知子[1]。三葉木通瓜籽分布密集，種籽細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)顯示胚乳細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，富含脂肪酸、氨基酸和粗纖維等，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，但現(xiàn)階段籽多作為廢棄物處理[2-3]。

油脂提取方法主要包括民間傳統(tǒng)的木榨、機(jī)榨，工廠采用的化學(xué)浸出[4]、索氏提取、超臨界萃取和壓榨[5]，以及近年來(lái)研究較多的水酶法[6]、三相分配法[7]、超聲波輔助提取法[8]等。不同提取方法得到的油脂成分組成不同，品質(zhì)上也有一定的差異。傳統(tǒng)的木榨、機(jī)榨、壓榨是對(duì)油料施以物理壓力，使油脂從油料中分離的一種提取方法，具有工藝簡(jiǎn)單、無(wú)有機(jī)溶劑殘留的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在殘油率高、需要精練等問(wèn)題[9]?；瘜W(xué)浸出法是利用有機(jī)溶劑溶解油脂，將油脂從油料中萃取出來(lái)，再經(jīng)過(guò)蒸餾等工序?qū)⒍叻蛛x的一種提取方法。在化學(xué)浸出法基礎(chǔ)上，與超聲波聯(lián)用能夠縮短提取時(shí)間，提高提取效率[10-11]。水酶法是在水代法基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化所得，利用酶制劑分解油料細(xì)胞壁，使蛋白質(zhì)、糖、油脂的結(jié)合結(jié)構(gòu)變得松散，從而使油脂游離出來(lái)，再利用水和油密度不同及互不相溶的性質(zhì)將二者分離。三相分配法通過(guò)在植物材料的水提取液中加入適量的有機(jī)溶劑，使得提取液分為三相，從而達(dá)到分離油脂的目的。超臨界CO2萃取法利用超臨界狀態(tài)下CO2對(duì)溶質(zhì)溶解力強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)油料中的油脂進(jìn)行提取和分離，具有提油效率高、所得油脂品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[12]。

本文對(duì)索氏提取法、超聲波輔助提取法、水酶法、三相分配法、超臨界CO2萃取法五種籽油提取方法進(jìn)行對(duì)比研究，旨在選擇一種用時(shí)短、得率高、操作簡(jiǎn)便的三葉木通籽油提取方法；同時(shí)通過(guò)籽油得率及感官評(píng)價(jià)選定超臨界CO2萃取法進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為綜合利用及開(kāi)發(fā)高品質(zhì)三葉木通籽油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉木通籽 秋季果實(shí)成熟時(shí)采收于湖南永州，曬干后備用；乙醇、石油醚、硫酸銨、叔丁醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑 均為分析純；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶 酶活力50000 U/g，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

HA121-5（10）型超臨界萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；Hei-VAP ValueG3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；XO-5200DT型超聲波清洗儀 南京先歐儀器制造有限公司；TDL-40B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；150T粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；HH-4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠；AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；GZX-9416 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三葉木通籽預(yù)處理 取三葉木通籽平鋪于托盤(pán)上，置于烘箱中，115 ℃干熱處理2 h[13]，水分含量約為5%。粉碎過(guò)40目篩，裝袋密封，放入冰箱冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 索氏提取法 稱取約10 g預(yù)處理后三葉木通籽粉末記為m0，加入100 mL石油醚，浸提12 h后置于70 ℃水浴鍋中抽提6 h。稱取空旋蒸瓶質(zhì)量記為m1，將提取液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至冷凝管壁無(wú)液滴滴落，取下旋蒸瓶放入70 ℃烘箱中干燥5 min，兩次稱量差值小于0.01 g視為恒重，記錄此時(shí)旋蒸瓶的質(zhì)量m2，計(jì)算三葉木通籽油的得率（%）。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.3 超聲波輔助提取法 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后三葉木通籽粉末3.0 g，按料液比（g/mL）1:7加入石油醚，置于超聲波清洗器中，上置冷凝裝置，50 ℃下超聲提取50 min，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到三葉木通籽油，重復(fù)測(cè)定三次，利用1.2.2中公式計(jì)算籽油得率。

1.2.4 水酶法 準(zhǔn)確稱取6份預(yù)處理后三葉木通籽粉末10.0 g，按料液比（g/mL）1:5加入超純水，分別加入三葉木通粉末質(zhì)量2%的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶[14]，利用鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液至酶制劑適宜pH，置于50 ℃水浴鍋中攪拌酶解5 h。酶解液以3000 r/min速度離心15 min，得到游離油、乳狀液、水解液和沉淀。取出乳狀液層在-20 ℃下凍結(jié)20 h，然后在35 ℃解凍2 h，8000 r/min速度下離心20 min[15]。破乳后取清油與游離油混合即得三葉木通籽油，重復(fù)測(cè)定3次，利用1.2.2中公式計(jì)算籽油得率。

1.2.5 三相分配法 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后三葉木通籽粉末10.0 g，按料液比（g/mL）1:5加入超純水混合，加入5 g硫酸銨，50 mL叔丁醇，搖勻、靜置3 h。提取液以3000 r/min速度離心15 min，離心后得到的三相中蛋白質(zhì)沉淀層作為界面層，位于上層有機(jī)層和下層水化層之間[16]。取有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到三葉木通籽油，重復(fù)測(cè)定3次，利用1.2.2中公式計(jì)算籽油得率。

1.2.6 超臨界CO2萃取法 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后三葉木通籽粉末100.0 g，置于2 L超臨界萃取釜中，設(shè)置CO2流量25 L/h、萃取釜壓力30 MPa、萃取釜溫度45 ℃，萃取120 min得到三葉木通籽油，重復(fù)測(cè)定3次，利用1.2.2中公式計(jì)算籽油得率。

1.2.7 籽油感官評(píng)價(jià) 參照GB/T 5525-2008對(duì)籽油的透明度、氣味、滋味進(jìn)行鑒定。

1.2.8 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 提取時(shí)間的篩選 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后三葉木通籽粉末100.0 g，置于超臨界萃取釜中，考察不同提取時(shí)間下三葉木通籽油的得率，分別提取40、60、80、100、120 min，其他因素水平同1.2.6。通過(guò)籽油得率的計(jì)算，得到在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高得率的提取時(shí)間范圍。

1.2.8.2 萃取釜壓力的篩選 萃取壓力是影響超臨界CO2萃取的主要因素之一。根據(jù)超臨界裝置壓力要求及預(yù)實(shí)驗(yàn)情況分別在萃取釜壓力20、25、30、35、40 Mpa下進(jìn)行籽油提取，其他因素水平同1.2.6。通過(guò)不同萃取釜壓力下籽油得率的計(jì)算，得到最經(jīng)濟(jì)適用、得率高的萃取釜壓力。

1.2.8.3 萃取釜溫度的篩選 參考李杏元等[11]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，分別在萃取釜溫度25、30、35、40、45 ℃下進(jìn)行籽油提取，其他因素水平同1.2.6。通過(guò)不同萃取釜溫度下籽油得率的計(jì)算，得到最佳萃取釜溫度。

1.2.9 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取時(shí)間100 min、最佳萃取釜壓力30 MPa、最佳萃取釜溫度35 ℃。利用Design Expert 8.0.6.1軟件以此為中心點(diǎn)進(jìn)行Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Origin Pro 8.5、Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取三葉木通籽油的結(jié)果

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水酶法添加的6種酶以中性蛋白酶效果最佳，得率最高，因此表2中僅列舉中性蛋白酶處理下的三葉木通籽油得率。雖然此法條件溫和，綠色環(huán)保[17-18]，但由表2可知，此方法得率最低，其原因可能是現(xiàn)階段對(duì)酶的特異性問(wèn)題研究較少，酶制劑對(duì)三葉木通籽細(xì)胞壁破壁效果不明顯，酶解效率較低[19-20]；同時(shí)相對(duì)油脂釋放而言，脂肪和蛋白質(zhì)的釋放更加顯著（P＜0.05），導(dǎo)致所得油脂乳化程度高，水和油之間形成乳化層不利于三葉木通籽油的提取，后續(xù)冷凍破乳、乙醇破乳效果均不顯著，后處理復(fù)雜，清油得率低；另外，酶制劑偏高的價(jià)格也會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高。

三相分配法和超聲輔助提取法得率略高。三相分配法從酶生物分離發(fā)展而來(lái)，通過(guò)在植物材料的水提取液中加入適量的硫酸銨和叔丁醇，使得蛋白質(zhì)沉淀層作為界面層，位于上層有機(jī)層和下層水化層之間，從而達(dá)到分離油脂的目的[7]。此法得率高于水酶法可能是由于硫酸銨和叔丁醇的加入，使得有機(jī)相穿透細(xì)胞壁、油體，并溶解甘油三酯[7,21]。但同時(shí)也易造成有機(jī)溶劑殘留，使得籽油有異味，影響品質(zhì)。而對(duì)于超聲輔助提取法，雖然超聲空化會(huì)大幅度縮短三葉木通籽細(xì)胞壁的破裂時(shí)間，同時(shí)產(chǎn)生的振動(dòng)作用也會(huì)加強(qiáng)油脂的釋放、擴(kuò)散和溶解[22]，從而提高三葉木通籽油的得率，但也會(huì)引入有機(jī)溶劑，從而限制所提取的籽油的用途。

相比之下，索氏提取法和超臨界CO2萃取法得率最高。其中索氏提取法作為提取油脂經(jīng)典方法，通過(guò)連續(xù)回流得率可達(dá)32.32%，所得油脂滋香濃郁、澄清透明，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也易造成有機(jī)溶劑殘留[23]。考慮到籽油的進(jìn)一步深加工，綜合多種因素后確定超臨界CO2萃取法提取三葉木通籽油仍有深入探討的必要性。

2.2 超臨界CO2萃取法工藝條件優(yōu)化研究

經(jīng)過(guò)五種提取方法的比較，得出超臨界CO2萃取法得率最高。同時(shí)超臨界法[24]提取的油脂無(wú)有機(jī)溶劑殘留、安全環(huán)保；無(wú)乳化現(xiàn)象、后處理簡(jiǎn)單；生物活性指標(biāo)更為突出，可以更好地保留三葉木通籽油中的天然香氣和風(fēng)味，油脂品質(zhì)高；精煉時(shí)也可省去減壓蒸餾和脫臭等工序，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，降低油脂損耗，具有良好的工業(yè)化前景。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)超臨界CO2萃取法工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 提取時(shí)間對(duì)籽油得率的影響 由圖1可見(jiàn)，三葉木通籽油得率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)先上升后趨于平緩。開(kāi)始上升較快可能是由于預(yù)處理后的三葉木通籽表面油脂豐富，短時(shí)間內(nèi)可以迅速釋放，但隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，表面油脂量減少，CO2滲透至樣品中使油脂擴(kuò)散出來(lái)的時(shí)間變長(zhǎng)[25]，得率增加變緩。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到100 min時(shí)，再延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)籽油得率影響不大，考慮其原因?yàn)橛椭贑O2中溶解已達(dá)飽和，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間不僅增加成本也可能會(huì)造成籽油成分變化。因此最佳提取時(shí)間為100 min。

表2 不同方法下三葉木通籽油的得率Table 2 Extraction yield of Akebia trifoliata (Thunb.) koidz seed oil under different methods

圖1 提取時(shí)間對(duì)三葉木通籽油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield of Akebia trifoliata (Thunb.) koidz seed oil

2.2.1.2 萃取釜壓力對(duì)籽油得率的影響 由圖2可見(jiàn)，三葉木通籽油得率隨壓力增大先上升后下降。萃取壓力在20～30 MPa之間得率呈上升趨勢(shì)，30～40 MPa時(shí)逐漸下降。這是因?yàn)槌跏茧A段壓力的增加使得CO2流體密度加大，同時(shí)使傳質(zhì)阻力降低、分子間的傳質(zhì)距離縮短，溶質(zhì)與溶劑間傳質(zhì)速率提高[26]，籽油得率提高。當(dāng)萃取壓力繼續(xù)增大時(shí)，高壓下CO2流體可壓縮性變小溶解度降低，從而導(dǎo)致籽油得率降低，同時(shí)提取的籽油顏色較深，品質(zhì)下降。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本及籽油質(zhì)量，選擇萃取壓力為30 MPa。

圖2 萃取釜壓力對(duì)三葉木通籽油得率的影響Fig.2 Effect of extraction kettle pressure on the extraction yield of Akebia trifoliata (Thunb.) koidz seed oil

2.2.1.3 萃取釜溫度對(duì)籽油得率的影響 由圖3可見(jiàn)，三葉木通籽油得率隨溫度增大總體呈先上升后下降趨勢(shì)。在25～35 ℃之間得率逐步上升，并在35 ℃達(dá)到最高，這是因?yàn)闇囟壬呤沟脗髻|(zhì)速度加快，加速油脂釋放。然而溫度繼續(xù)升高（35～40 ℃）會(huì)導(dǎo)致萃取釜內(nèi)CO2密度變小，溶解度下降，從而降低籽油得率。40～45 ℃之間有小幅度上升，但并未達(dá)到最高點(diǎn)。同時(shí)萃取釜溫度過(guò)高時(shí)籽油顏色變深，推測(cè)溫度升高萃取出的成分變多，其中色素使得其顏色加深。綜合考量后選擇萃取溫度35 ℃。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.2.1 模型建立及顯著性分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元化回歸擬合分析得到3個(gè)因素與三葉木通籽油得率之間二次回歸模擬方程為：

得率Y=36.53+0.65A-2.54B-0.83C-0.37AB+0.63AC+0.66BC-2.44A2-4.35B2-2.49C2。

圖3 萃取釜溫度對(duì)三葉木通籽油得得率率的影響Fig.3 Effect of extraction kettle temperature on the extraction yield of Akebia trifoliata (Thunb.) koidz seed oil

表3 Response surface 中心組合方案及響應(yīng)值Table 3 Response surface central combination project and response values

應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，回歸模型呈現(xiàn)高度顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.8885＞0.05），該模型真實(shí)可靠，能夠很好預(yù)測(cè)各條件下超臨界CO2萃取法提取三葉木通籽油的得率。模型決定系數(shù)R2=0.9912，證明該試驗(yàn)擬合程度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9799，說(shuō)明該試驗(yàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值高度吻合。因此該回歸模型適用于對(duì)三葉木通籽油得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)籽油得率的影響大小的順序?yàn)椋狠腿「獕毫Γ‵=195.39），萃取釜溫度（F=20.84），提取時(shí)間（F=12.72）。在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B、C與二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)籽油得率的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC、BC對(duì)籽油得率的影響顯著（P＜0.05），其余均無(wú)顯著影響。

2.2.2.2 交互因子效應(yīng)分析 根據(jù)回歸方程式，利用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制交互因子的響應(yīng)曲面及其等高線圖，如圖4所示。由等高線圖可以看出AC、BC交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，AB交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。當(dāng)提取時(shí)間為100 min、萃取釜壓力為28.46 MPa時(shí)三葉木通籽油得率最大；提取時(shí)間為100 min、萃取釜溫度為33.97 ℃時(shí)三葉木通籽油得率最大，萃取釜壓力為28.46 MPa、萃取釜溫度為33.97 ℃時(shí)三葉木通籽油得率最大。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

圖4 各兩因素交互對(duì)三葉木通籽油得率的影響Fig.4 Effect of interaction of two factors on the extraction yield of Akebia trifoliata（Thunb.）koidz seed oil

2.2.2.3 最優(yōu)條件確定以及驗(yàn)證 由嶺脊分析得到三葉木通籽油的最佳提取條件為提取時(shí)間100 min、萃取釜壓力28.46 MPa、萃取釜溫度33.97 ℃，得率37.01%?？紤]到工業(yè)上操作便利，將最佳提取工藝改進(jìn)為提取時(shí)間100 min、萃取釜壓力28 MPa、萃取釜溫度34 ℃，以回歸方程的最佳條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，得到三葉木通籽油得率平均值為36.87%±0.08%，與預(yù)測(cè)值相符。

3 結(jié)論

對(duì)索氏提取法、超聲波輔助提取法、水酶法、三相分配法、超臨界CO2萃取法五種三葉木通籽油提取方法進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明：水酶法得率最低，且所得籽油渾濁；三相分配法和超聲輔助提取法的得率處于中間，但引入有機(jī)溶劑使得籽油有異味，影響品質(zhì)；索氏提取法的得率雖然相對(duì)較高且操作簡(jiǎn)便，但提取時(shí)間較長(zhǎng)；相比之下，應(yīng)用超臨界CO2萃取法提取三葉木通籽油得率最高，所得油脂滋香濃郁、澄清透明、品質(zhì)高；除去CO2無(wú)需其他試劑，無(wú)有機(jī)溶劑引入，更加安全，利于后期應(yīng)用，具有良好的工業(yè)化前景。

利用響應(yīng)面法優(yōu)化所得三葉木通籽油最佳提取工藝為提取時(shí)間100 min、萃取釜壓力28 MPa、萃取釜溫度34 ℃，在此條件下，得率37.01%。以最佳條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，三葉木通籽油最終得率為36.87%±0.08%。所得籽油為淡黃色透明澄清液體，具有三葉木通籽油固有的氣味，無(wú)異味，研究為三葉木通籽油的綜合利用提供參考。