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    嗜麥芽窄食單胞菌的培養(yǎng)基優(yōu)化及其在煙葉發(fā)酵中的初步應(yīng)用研究

    2021-06-18 07:20:52黃申周利峰呂喬孫海峰景天李石頭閆茗熠毛多斌
    輕工學報 2021年3期
    關(guān)鍵詞:二醇菌液碳源

    黃申,周利峰,呂喬,孫海峰,景天,李石頭,閆茗熠,毛多斌

    1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州450001;

    2.深圳煙草工業(yè)有限責任公司,廣東 深圳 518109;

    3.浙江中煙工業(yè)有限責任公司 技術(shù)中心,浙江 杭州 310024

    0 引言

    西柏烯類化合物(Cembratrienes)是煙草中重要的大環(huán)二萜類物質(zhì).西柏烯類化合物在自然界中主要存在于新鮮煙葉、煙花的表面腺毛分泌物和海洋珊瑚生物中[1-4].煙葉表面腺毛分泌物隨新鮮煙葉成熟度的增加而增多,當煙葉完全成熟時其質(zhì)量分數(shù)達到最大值,而作為其主要成分的西柏烯類化合物也會逐步累積并達到質(zhì)量分數(shù)最大值.其中,新鮮煙葉中的西柏三烯-4,6-二醇質(zhì)量分數(shù)可達0.7%,同時具有α-CBD和β-CBD兩種差向異構(gòu)體[5-7].西柏三烯-4,6-二醇是一種重要的致香前體物,在一系列加工處理過程中,其發(fā)生氧化降解,生成多種重要的煙氣香氣物質(zhì),而這些香氣物質(zhì)主要成分是茄酮及其衍生物,能與煙草本香相協(xié)調(diào),是卷煙香氣成分的重要貢獻者[8-11].另外,西柏三烯-4,6-二醇對卷煙品質(zhì)也有一定影響,據(jù)報道,將西柏三烯-4,6-二醇加入卷煙中,可使吃味更豐滿,提高卷煙的吸食品質(zhì)[12].

    然而,國內(nèi)外關(guān)于西柏烯類化合物生物降解的研究較少,僅有利用雷公藤植物、美花煙草植物細胞催化降解西柏三烯-4,6-二醇,使其11位、12位雙鍵被環(huán)氧化,10位、12位和13位雙鍵被羥基化,并無西柏烯開環(huán)類化合物生成[13-17].黃申等[18-20]從初烤后煙葉中篩選到一株新鞘氨醇桿菌,該菌可降解西柏三烯-4,6-二醇生成金合歡醛,但催化效率偏低.

    近年來,利用微生物發(fā)酵提升煙葉的可用性及品質(zhì)已逐漸成為煙草行業(yè)的研究熱點.筆者前期從煙葉中篩選到一株嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1),能以西柏三烯-4,6-二醇為唯一碳源生長,并檢測到中間代謝物金合歡醛[21].本研究擬以該嗜麥芽窄食單胞菌為實驗菌株,通過單因素試驗優(yōu)化其培養(yǎng)基,在此基礎(chǔ)上,將該菌株制備成菌制劑后初步應(yīng)用于煙葉發(fā)酵,并對比研究發(fā)酵前后煙葉的品質(zhì),以期為嗜麥芽窄食單胞菌在發(fā)酵煙葉中的應(yīng)用提供新思路.

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    材料:嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1),保存于鄭州輕工業(yè)大學煙草行業(yè)生物技術(shù)重點實驗室;云煙87 B2F,產(chǎn)自云南玉溪.

    主要試劑:西柏三烯-4,6-二醇標樣(純度99 %),鄭州輕工業(yè)大學實驗室自制[22-23];K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaNO3、KNO3、FeSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4、MnSO4、(NH4)2SO4、CaCl2·2H2O、Na2MoO4·2H2O、葡萄糖、蔗糖、乳糖、β-環(huán)糊精、麥芽糖、果糖、胰蛋白胨、尿素、酵母粉,上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.

    主要儀器:Agilent 6890a/5975c 型GC-MS聯(lián)用儀,美國Agilent公司產(chǎn);J6-MI型冷凍離心機,美國Beckman公司產(chǎn);2600 UC/VIS型紫外可見分光光度計,美國Unic公司產(chǎn);KBF240型恒溫恒濕箱,德國 Binder公司產(chǎn).

    1.2 實驗方法

    1.2.1 主要培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基(1 L):蛋白胨 10 g,酵母粉 5 g,NaCl 10 g,蒸餾水 1 L,pH值為7.

    初始發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g,NaCl 0.5 g,KH2PO40.65 g,MnSO40.001 g,(NH4)2SO40.5 g,CaCl2·2H2O 0.1g,Na2MoO4·2H2O 0.005 g,pH值為7,高溫滅菌20 min后加入西柏三烯-4,6-二醇水溶液,配制西柏三烯-4,6-二醇質(zhì)量濃度為0.3 g/L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基.

    1.2.2 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線的繪制將嗜麥芽窄食單胞菌接種到種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、150 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h.在無菌條件下,配制14份等量的發(fā)酵培養(yǎng)基,每瓶按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%接種種子菌液,以不接種種子菌液的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照,于30 ℃、150 r/min條件下進行培養(yǎng).在培養(yǎng)6 h后,每隔6 h取樣1次,72 h后停止取樣.用移液槍取4 mL發(fā)酵菌液,采用紫外可見分光光度計檢測其OD600,以反映菌體生長量;然后立即將剩余的菌液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,用二氯甲烷溶劑萃取西柏三烯-4,6-二醇,采用GC-MS檢測其質(zhì)量分數(shù),并計算其降解率[18].以培養(yǎng)時間為橫坐標,西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600為縱坐標,利用Oringe軟件繪制菌株生長曲線和降解曲線.

    1.2.3 單因素試驗1)碳源的選擇.選擇葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、β-環(huán)糊精6種碳源,以不添加碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照.分別在1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 g碳源,分裝后滅菌,在超凈工作臺中,按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%接種種子菌液,于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h.然后經(jīng)離心、溶劑萃取、GC-MS檢測確定西柏三烯-4,6-二醇的質(zhì)量分數(shù),計算其降解率,從而選擇最佳碳源.改變最佳碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L 、16.0 g/L),根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況,確定最佳質(zhì)量濃度.

    2)氮源的選擇.在最佳碳源的基礎(chǔ)上,選擇硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素6種氮源,最佳氮源的選擇方法同1).改變最佳氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L),根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況,確定最佳質(zhì)量濃度.

    3)初始pH值的選擇.pH值對蛋白酶的活性具有一定的影響,因此發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株的生長及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影響.在最佳碳源、氮源的基礎(chǔ)上,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值(5、6、7、8、9、10),根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況,確定最佳培養(yǎng)pH值.

    4)培養(yǎng)溫度的選擇.溫度對蛋白酶的活性具有一定的影響,因此發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度對菌株的生長及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影響.在最佳pH值的基礎(chǔ)上,將發(fā)酵液分別置于不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃)的搖床中進行培養(yǎng),根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況,確定最佳培養(yǎng)溫度.

    1.2.4 菌制劑的制備于10 000 r/min條件下,將培養(yǎng)24 h的菌液離心20 min得到菌體,再將其溶于無菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,得到OD600為2.0的細胞懸液,即為菌制劑.

    1.2.5 煙葉發(fā)酵實驗1)將菌制劑于35 ℃、pH值為7、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h,得到嗜麥芽窄食單胞菌活化液,待用.

    2)將嗜麥芽窄食單胞菌活化液按5.00%、2.50%、1.25%和1.00%的添加量均勻噴灑到回潮后的煙葉樣品(水分含量為15%)上,然后置于恒溫恒濕箱(溫度28 ℃,濕度80%)中進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,每2 d取樣一次.

    3)取6 g煙葉樣品剪碎置于250 mL三角瓶中,加入150 mL二氯甲烷,于20 ℃、100 W條件下超聲萃取30 min,用100 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的磷酸酸洗3次,再用100 mL飽和食鹽水水洗,直至pH值為7.經(jīng)減壓濃縮,以2,6-二氯甲苯作為內(nèi)標,利用GC-MS聯(lián)用儀檢測煙葉樣品中的揮發(fā)性香味物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù).GC-MS的檢測條件如下.

    GC條件:色譜柱為HP-5 MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);進樣口溫度280 ℃;高純He作載氣,流速為1 mL/min;升溫程序設(shè)置為初始溫度50 ℃,停留4 min,然后以2 ℃/min的速率升溫至240 ℃時結(jié)束;不分流進樣,進樣量為1 μL;采用全掃描模式.

    MS條件:傳輸線溫度為280 ℃;離子源溫度為280 ℃,四極桿溫度為150 ℃;電離方式為電子轟擊(EI),電子能量為70 eV;溶劑延遲時間為8 min;掃描質(zhì)量范圍(m/z)為35~550 amu.

    1.2.6 感官質(zhì)量評吸將菌制劑發(fā)酵前后的煙葉樣品制絲并添加到待評吸的卷煙中,由河南中煙技術(shù)中心組建11人評吸小組,采用對比評吸法進行感官質(zhì)量評吸[24].

    2 結(jié)果與討論

    2.1 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線分析

    菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線如圖1所示.由圖1可以看出,在0~20 h,嗜麥芽窄食單胞菌生長遲緩,西柏三烯-4,6-二醇的降解率變化不明顯.從20 h開始,嗜麥芽窄食單胞菌進入快速增長期,西柏三烯-4,6-二醇的降解率顯著下降,這主要是因為西柏三烯-4,6-二醇作為碳源開始被菌株大量利用以維持自身的繁殖生長.隨著代謝產(chǎn)物的累積,嗜麥芽窄食單胞菌的生長率與死亡率在培養(yǎng)36 h后達到平衡,表現(xiàn)為其菌株數(shù)量總體不變并保持穩(wěn)定;之后,隨著嗜麥芽窄食單胞菌死亡率的增加,逐步進入衰亡期,西柏三烯-4,6-二醇的降解率基本不再變化.因此,在后期培養(yǎng)基優(yōu)化過程中,以36 h作為最佳培養(yǎng)周期.

    圖1 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線

    2.2 單因素試驗結(jié)果分析

    2.2.1 碳源碳源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖2所示.由圖2可以看出,在不添加任何外加碳源的情況下,發(fā)酵菌液的OD600只有0.24,表明菌株未達到旺盛生長期,而西柏三烯-4,6-二醇的降解率也只有73.4%.在培養(yǎng)基中添加不同碳源后,西柏三烯-4,6-二醇的降解率表現(xiàn)為:添加麥芽糖時的降解率最高,可達84.0%,明顯優(yōu)于其他碳源,發(fā)酵菌液OD600為0.65,表明菌株達到旺盛生長期;而添加乳糖時的降解率最低,僅為38.2%.故最佳碳源為麥芽糖.

    圖2 碳源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

    不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖3所示.由圖3可以看出,不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇的降解率有較為明顯的差異.在0~2.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),西柏三烯-4,6-二醇的降解率隨麥芽糖質(zhì)量濃度的增加而增加;在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600達到最高值,分別為85.9%和0.69,表明菌體生長較好;但隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的不斷增加,西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均迅速下降,這可能是因為隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的增加,培養(yǎng)基的滲透壓隨之升高,而滲透壓過高會抑制菌體的生長及降解酶的合成.因此,選擇麥芽糖質(zhì)量濃度為2.0 g/L較適宜.

    圖3 不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

    2.2.2 氮源氮源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖4所示.由圖4可以看出,在培養(yǎng)基中添加無機氮源時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率明顯高于添加有機氮源時的降解率.其中,當以硫酸銨為氮源時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率最高,達到88.6%,明顯優(yōu)于其他氮源,發(fā)酵菌液OD600為0.73,表明菌株生長旺盛;當以尿素為氮源時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均最低.故最佳氮源為硫酸銨.

    圖4 氮源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

    不同質(zhì)量濃度的硫酸銨對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖5所示.由圖5可以看出,在0~2.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),西柏三烯-4,6-二醇的降解率隨硫酸銨質(zhì)量濃度的增加而增加,發(fā)酵菌液OD600總體也呈增加的趨勢;當質(zhì)量濃度大于2.0 g/L時,由于培養(yǎng)基pH值的升高,菌體繁殖加速,導致代謝產(chǎn)物的生成量較少.因此,選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為2.0 g/L較適宜.

    圖5 不同質(zhì)量濃度的硫酸銨對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

    2.2.3 初始pH值不同初始pH值對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖6所示.由圖6可以看出,當初始pH值為5時,菌體基本不生長,這導致西柏三烯-4,6-二醇的降解率也很低;當初始pH值范圍為5~8時,發(fā)酵菌液OD600隨pH值的升高也逐漸增加,菌體開始旺盛生長,西柏三烯-4,6-二醇的降解率也隨之增加;當初始pH值為8時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均達到最大值,分別為87.0%和0.73;當初始pH值大于8時,培養(yǎng)基的堿性過強,不適合菌株的生長及降解產(chǎn)物的積累,從而導致發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率的下降.因此,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為8較適宜.

    2.2.4 培養(yǎng)溫度不同培養(yǎng)溫度對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖7所示.由圖7可以看出,當培養(yǎng)溫度為 25 ℃ 時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率只有57.6%;隨著培養(yǎng)溫度的升高,菌體旺盛生長,發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率隨之增加;當培養(yǎng)溫度為40 ℃時,西柏三烯-4,6-二醇降解率達到88.7%,發(fā)酵菌液OD600也最大,為0.73;當培養(yǎng)溫度超過40 ℃時,由于溫度過高,菌株體內(nèi)蛋白酶的活性下降,致使發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定程度的下降.因此,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度為40 ℃較適宜.

    圖7 不同培養(yǎng)溫度對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

    2.3 菌制劑發(fā)酵煙葉前后香味成分變化分析

    對比發(fā)酵前后煙葉中的香味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)約有15種煙葉香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了明顯變化.經(jīng)過仔細甄別,上述發(fā)生變化的香味物質(zhì)中共有5種確定了分子式,分別為茄酮、5-異丙基-6-甲基-庚-3,5-二烯-2-醇、9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、葉綠醇和2,2′-(1,2-乙二基)雙[6,6-二甲基]-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯.這5種變化明顯的香味物質(zhì)在發(fā)酵前后煙葉中質(zhì)量濃度的變化見表1.由表1可知,葉綠醇的質(zhì)量濃度下降,其他4種香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度增加.其中,對香氣組成影響較大的茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮的質(zhì)量濃度增加較明顯.

    表1 5種變化明顯的香味物質(zhì)在發(fā)酵前后煙葉中質(zhì)量濃度的變化

    煙葉發(fā)酵過程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的變化見表2.由表2可知,隨著發(fā)酵時間的延長,西柏三烯-4,6-二醇的降解率逐漸增加,當菌制劑添加量為5.00%時,在發(fā)酵第 4 d,西柏三烯-4,6-二醇的降解率達到80%,在發(fā)酵第8 d達到87%.隨著菌制劑添加量的減少,西柏三烯-4,6-二醇的降解率迅速下降,例如,在添加量為1.00%,發(fā)酵4 d時,西柏三烯-4,6-二醇的降解率為50%.在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn),發(fā)酵到第6 d時有部分煙葉發(fā)生了霉變及顏色明顯加深,這可能是由于水分含量較大所致.綜上所述,選擇發(fā)酵時間為4 d,菌制劑的添加量為5.00%.

    表2 煙葉發(fā)酵過程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的變化

    2.4 感官質(zhì)量評吸結(jié)果分析

    發(fā)酵前后煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果見表3.由表3可知,與發(fā)酵前煙葉相比,菌制劑發(fā)酵后的煙葉總評分提高了1分,其中,在香氣質(zhì)、香氣量及香氣濃度這3個方面的評分提高較明顯,分別提高了0.3分、0.3分和0.4分.這與發(fā)酵后煙葉香味成分中茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮這兩種煙葉中重要香味物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加有關(guān).因此,初步推測可能是由于嗜麥芽窄食單胞菌制成的菌制劑在發(fā)酵煙葉時,將煙葉中的西柏烯類物質(zhì)降解,生成了茄酮類的重要香味物質(zhì),使發(fā)酵后煙葉的吸味品質(zhì)得到提升.

    表3 發(fā)酵前后煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果

    3 結(jié)論

    本文通過單因素試驗對嗜麥芽窄食單胞菌的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,優(yōu)化后培養(yǎng)基中適宜的碳源為質(zhì)量濃度為2.0 g/L的麥芽糖,氮源為質(zhì)量濃度為2.0 g/L的硫酸銨,初始pH值為8,培養(yǎng)溫度為40 ℃.將能高效降解西柏三烯-4,6-二醇的嗜麥芽窄食單胞菌制成菌制劑后用于發(fā)酵煙葉,經(jīng)GC-MS檢測分析發(fā)現(xiàn)煙葉發(fā)酵后有5種香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了明顯變化,其中對香氣組成影響較大的茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮的質(zhì)量濃度均有不同程度的增加.將經(jīng)菌制劑發(fā)酵的煙葉制成卷煙進行評吸,發(fā)現(xiàn)總分較發(fā)酵前提高了1分,其中香氣質(zhì)、香氣量和香氣濃度分別提高了0.3分、0.3分和0.4分.

    本文利用嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)酵煙葉可提升卷煙的香氣量和香氣質(zhì),理論上證明了利用微生物發(fā)酵煙葉以提升其品質(zhì)的可行性,并為該類研究奠定了基礎(chǔ).后期擬繼續(xù)優(yōu)化煙葉發(fā)酵參數(shù)及研究發(fā)酵機制,以期縮短發(fā)酵時間,提升發(fā)酵效果,為利用微生物發(fā)酵煙葉的實際應(yīng)用打下基礎(chǔ).

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