鳳仙花花青素苷的超聲輔助提取工藝及其抗氧化研究

蔡 珊，紀(jì) 樸，張卓爾，張易華，黃亞梅，曹澳華，楊 芳

(1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000;2.陜西安康中學(xué),陜西 安康 725000;浙江農(nóng)林大學(xué) 理學(xué)院,浙江 杭州 311300)

鳳仙花(Impatiensbalsamina.L)，俗稱指甲花，為鳳仙花科、鳳仙花屬，一年生草本花卉，花形似蝴蝶，花色多，自播繁殖[1]，生存力強，適應(yīng)性好，一般很少有病蟲害，且鳳仙花具有祛風(fēng)除濕、活血定痛、抗菌、抗氧化防止蛋白損傷[2]等功效，故而在諸多方面有較大的應(yīng)用價值。

花青素(anthocyanin)又稱花色素、花色苷，為酚類化合物中類黃酮物質(zhì)，普遍存在于植物花瓣、果實等部位，是一類水溶性色素[3]，以C6-C3-C6為基本結(jié)構(gòu)骨架。因其結(jié)構(gòu)中的酚羥基，花青素苷具有一定的抗氧化活性：呂婉婉等[4]、郭麗等[5]、曹柏營等[6]、杭園園等[7]、Sharma. G[8]研究表明花青素苷對自由基具有較高的清除能力，且王彥平等[9]、葛艷林[10]、李玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、OH自由基的清除能力均高于維生素C?；ㄇ嗨剀粘寡趸膺€具有諸多生理功能：Erlei Wang[12]. Ashley M. Mudd[13]. Faeeukh Aqil[14]. Lilliana Primo da Silva[15]. Radha Munagala[16].研究表明花青素苷能夠抑制細胞增殖進而抑制癌細胞生長并引發(fā)細胞凋亡；Jonfeng LI. Sharma. G[17]、鄧紅梅等[18]、孫倩怡等[19]、胡能兵[20]等研究表明花青素苷有著良好的抗炎抑菌效果；Bushra Hasan Khan[21]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷具有一定的保護作用；Yoon-Mi Lee[22]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對肥胖誘導(dǎo)的代謝紊亂和炎癥有益。隨著科技的發(fā)展，花青素苷在醫(yī)藥、保健品等行業(yè)有著巨大的發(fā)展空間，故而對花青素苷的需求量也日益增大。

花青素苷的提取方法主要有兩大類，一類為傳統(tǒng)提取法，即有機溶劑浸提；另一類是在傳統(tǒng)提取法的基礎(chǔ)上增加超聲、微波、超臨界等方法輔助，以增加提取率。筆者實驗以超聲輔助法對鳳仙花花青素苷進行提取，以單因素實驗、正交試驗優(yōu)化提取方案，并通過大孔吸附樹脂純化，以DPPH自由基清除率、2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽{2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt， ABTS}自由基清除率以及還原力測定(鐵氰化鉀法)為指標(biāo)，對比鳳仙花花青素苷與維生素C的抗氧化性，為今后鳳仙花花青素苷的進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Sonicator4000超聲波破碎儀(美國QSonica公司)；V-1100D型可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；H-1850R高速臺式冷凍離心機(上海利鑫堅離心機有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲輔助法提取鳳仙花花青素苷 準(zhǔn)確稱取鳳仙花花粉1.0000 g于燒杯中，分別以超聲頻率(90、92、95、97、100Hz)、乙醇濃度(55%、60%、65%、70%、75%)、超聲溫度(35、37、40、43、45℃)為實驗條件，pH=1的乙醇溶液為提取劑，超聲提取30 min(料液比為1∶20)，6 000 r·min-1離心10min，取上清液測OD530，每組實驗設(shè)置3個平行重復(fù)；根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行正交試驗。

1.3.2 鳳仙花花青素苷提取率的計算 花青素苷提取率(mg·g-1)=A*V*M*DF/(ε*d*m)[20]A為530 nm處測得的吸光度，V為提取液體積，DF為稀釋倍數(shù)，d為光路直徑，M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量455.2，m為品質(zhì)量，ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)29600[20]。(絕大多數(shù)花青素苷中以矢車菊素-3-葡萄糖苷為主，故以矢車菊素-3-葡萄糖苷為對象計算。)

1.3.3 鳳仙花花青素苷的分離純化 大孔樹脂的活化、篩選：大孔吸附樹脂的預(yù)處理見杭園園等[7]。篩選方法見李健等[23]，吸附率(%)=[A530nm(前)-A530nm(后)]/A530nm(前)×100，計算解吸率(%)=A530(解析)/A530(前)×100。比較選擇進行動態(tài)吸附試驗，分析大孔樹脂的選擇結(jié)果。

柱層析法純化花青素苷：稱取最佳樹脂100 g，預(yù)處理后裝柱。將提取液過該樹脂柱，花青素苷被吸附在樹脂上，待樹脂飽和后用蒸餾水沖洗，再用無水乙醇洗脫，收集洗脫液，測定吸光度。

1.3.4 鳳仙花花青素苷抗氧化活性試驗 DPPH自由基清除率的測定：具體操作見王彥平等[9]。

ABTS自由基清除率測定：具體操作見慈美琳等[24]。

還原力測定(鐵氰化鉀法)：具體操作方法見慈美琳等[24]。

習(xí)近平在慶祝中國共產(chǎn)黨成立95周年大會上指出：“在5000多年文明發(fā)展中孕育的中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，在黨和人民偉大斗爭中孕育的革命文化和社會主義先進文化，積淀著中華民族最深層的精神追求，代表著中華民族獨特的精神標(biāo)識。”[1]因而可以說，由中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化、革命文化、社會主義先進文化構(gòu)成的中國特色社會主義社會主義文化，就是中華民族的文化。中國特色社會主義文化自信，就是中華民族的文化自信，本質(zhì)上就是中華民族的民族自信。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010、spss19.0軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，極差分析法對正交試驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助法提取鳳仙花花青素苷

2.1.1 單因素結(jié)果分析 由圖1所得，隨著超聲頻率增大，花青素苷提取率逐漸升高，當(dāng)超聲頻率為100Hz時提取率最高。但在超聲頻率為95Hz時，提取率有所下降?？赡芤驗槌暡ㄌ幚磉^程中空化泡沫劇烈壓縮和崩潰的瞬間，產(chǎn)生的熱氧化效應(yīng)造成花青素苷的損失，也可能是因為隨著超聲波的增加，與蛋白質(zhì)等結(jié)合的花青素苷被提取出來，當(dāng)超聲波熱氧化效應(yīng)大于花青素苷提取率時，會顯示為花青素苷的提取了降低，而在締合的花青素苷提取率高于超聲波熱氧化效應(yīng)時，花青素苷的提取率又會升高[25]。

圖1 超聲頻率對鳳仙花花青素苷提取率影響

由圖2可知，隨乙醇濃度的升高，花青素苷提取率逐漸增加，乙醇濃度達到70%時，花青素苷的提取率最高，隨后有略微下降趨勢，原因是花青素苷不穩(wěn)定，隨著乙醇濃度的增加，可能導(dǎo)致花青素苷結(jié)構(gòu)改變，降低花青素苷提取率[26]。

由圖3可知，隨提取溫度逐漸升高，花青素苷提取率逐漸增大，在43℃時達到最大，而后下降，分析其原因可能是花青素苷性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫破壞花青素苷的結(jié)構(gòu)，使花青素苷發(fā)生降解，提取率降低[27,28]。

圖2 乙醇濃度對鳳仙花花青素苷提取率影響

圖3 提取溫度對鳳仙花花青素苷提取率影響

2.1.2 正交結(jié)果分析 正交試驗因素水平見表1，由表2、表3可知，各因素對花青素苷提取率影響大小為超聲頻率>乙醇濃度>提取溫度，且超聲頻率、乙醇濃度、提取溫度對花青素苷提率影響均為極顯著，優(yōu)化后的因素條件為超聲頻率100 Hz、乙醇濃度74%、提取溫度43℃。由于優(yōu)化后的因素條件不在表內(nèi)，需要進行驗證，驗證結(jié)果為5.403 9±0.330 8 mg·g-1，符合理論結(jié)果。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交實驗結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗結(jié)果的方差分析

2.2 鳳仙花花青素苷的分離純化

如圖4所示為靜態(tài)吸附下，大孔樹脂對鳳仙花花青素苷的吸附率與解析率的繪制曲線。(純化方法見1.3.3)相同條件下，NKA-II的吸附率最高，但解析率最低。HPD-400與ADS-7的解析率近似，ADS-7的吸附率顯然高于HPD-400，故選用ADS-7進行花青素苷粗提液的純化，純化后的花青素苷濃度為4.4096 mg·g-1。

圖4 74%乙醇、超聲波輔助提取的花青素苷粗提液

2.3 鳳仙花花青素苷抗氧化活性試驗

進行抗氧化活性實驗時，花青素苷與維生素C在比較時均在相同質(zhì)量濃度下進行。

如圖5所示，鳳仙花花青素苷和維生素C在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基均有較好的清除能力。質(zhì)量濃度較小時，維生素C對DPPH自由基的清除率高于花青素苷，隨質(zhì)量濃度的增大，花青素苷對DPPH自由基的清除率高于維生素C，花青素苷的清除能力逐漸增大。

圖5 DPPH自由基清除率測定

如圖6所示，鳳仙花花青素苷和維生素C在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對ABTS自由基均有一定的清除能力。隨質(zhì)量濃度的增大，純花青素苷對ABTS自由基陽離子的清除率高于維生素C對ABTS自由基陽離子的清除率?；ㄇ嗨剀盏馁|(zhì)量濃度越大，清除ABTS自由基陽離子的能力越好。

圖6 ABTS自由基清除率測定

如圖7所示。質(zhì)量濃度較小時，維生素C與花青素苷的吸光度相近，隨質(zhì)量濃度的增加，花青素苷的吸光度高于維生素C，由此可見花青素苷的還原能力高于維生素C。

圖7 還原力測定(鐵氰化鉀法)

3 結(jié)論與展望

由實驗結(jié)果可知，優(yōu)化后的鳳仙花花青素苷超聲輔助提取因素條件為超聲頻率100Hz、乙醇濃度74%、提取溫度43℃；提取率為：5.4039±0.3308 mg·g-1；且高濃度的鳳仙花花青素苷對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力及其還原力均高于維生素C。故結(jié)果表明超聲輔助法對鳳仙花花青素苷的提取率較高，且鳳仙花花青素苷具有較高的抗氧化活性。

由于花青素苷苷易受影響分解，吳敏綜述表明天然花青素苷在酸性條件下比較穩(wěn)定，在光線(特別是紫外線)下易分解或氧化，避光保存可降低花青素苷降解率，低溫保存可延長其半衰期，且金屬活性的副族金屬離子可與花青素苷反應(yīng)，影響其穩(wěn)定性[29]。故花青素苷在保存時應(yīng)確保其處于避光低溫條件下。

花青素苷的提取方法較多，而超聲波的空化作用能夠促進樣品分解，加大樣品與溶劑的接觸面積，進而提高提取率，故超聲輔助提取法是一種簡單快速，有應(yīng)用前景的一種方法[30]；同樣，花青素苷的提取劑多樣，而以乙醇溶液為提取劑時，具有成本低，對環(huán)境污染較小等優(yōu)點，故以超聲輔助乙醇提取鳳仙花花青素苷。在實驗中往往會出現(xiàn)一些特殊情況，如以超聲頻率為單因素時，在超聲頻率為95Hz處，花青素苷的提取率會突然下降，通過文獻查閱，發(fā)現(xiàn)姜桂全等研究表明：第一是因為超聲波處理過程中空化泡沫劇烈壓縮和崩潰的瞬間，產(chǎn)生的熱氧化效應(yīng)造成花青素苷的損失，而當(dāng)熱氧化效應(yīng)造成的花青素苷的損失低于花青素苷提取增加速度時，花青素苷得率有所增加，第二，隨著超聲波的增加，與蛋白質(zhì)等結(jié)合的花青素苷被提取出來，所以當(dāng)超聲波熱氧化效應(yīng)大于花青素苷提取率時，會顯示為花青素苷的提取了降低，而在締合的花青素苷提取率高于超聲波熱氧化效應(yīng)時，花青素苷的提取率又會升高[25]。

有關(guān)于鳳仙花花青素苷的提取相關(guān)文獻較少，可能是鳳仙花種類繁多，材料獲取不易，并且全部進行實驗時實驗量過大等。但將筆者實驗結(jié)果與其他材料結(jié)果相比，筆者試驗結(jié)果均高于其他材料結(jié)果：如鈕福祥等[31]對紫甘薯花青素苷的提取最優(yōu)提率為723.1mg·kg-1；楊敏等[32]對紫玉米花青素苷的提取最優(yōu)提率為3.542 mg·g-1；于莉莉等[27]對黑豆種皮花青素苷提取最優(yōu)提率為3.87 mg·g-1；徐娟等[33]對藍莓酒渣中花青素苷的提取最優(yōu)提率為4.67 mg·g-1，而筆者實驗的最優(yōu)提率為5.4039 mg·g-1，略高于其他材料。

目前對物質(zhì)進行體外抗氧化研究時，評價指標(biāo)主要有：清除DPPH自由基、結(jié)晶紫法、亞硝基R鹽-Co2+褪色法、2-脫氧-D核糖法、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)的自氧化法、TAB硫代巴比妥酸法、清除ABTS自由基、抑制肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化檢測法、還原力測定、抑制雙氧水誘導(dǎo)的紅細胞溶血能力實驗、抑制蛋白質(zhì)羰基生成法等。筆者對花青素苷進行抗氧化測定時，采取DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及對其還原力的測定，并分別與相同條件下維生素C對上述自由基清除能力以及還原力進行對比，結(jié)果表明鳳仙花花青素苷具有較好的抗氧化能力。

花青素苷的抗氧化機理與黃酮類化合物通過酚羥基與自由基分子反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以減少并清除自由基[34]相似?；ㄇ嗨剀盏奶厥饪寡趸瘷C制是通過對自由基的清除、金屬離子的絡(luò)合以及對抗氧化酶系的促進與激活[3]，進而達到抗氧化效果。

花青素苷作為一種天然色素，受到了人們的廣泛關(guān)注，且在化妝品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)均具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者實驗結(jié)果為今后鳳仙花花青素苷的研究提供了一定的基礎(chǔ)，且超聲提取時超聲頻率對提取率影響最大以及超聲頻率為95Hz時提取率下降的原因給花青素苷的研究提供了一個新的探究方向。在今后的研究中，可以繼續(xù)尋求其最佳提取方法，優(yōu)化提純工藝；另一方面可以探究其大批量生產(chǎn)的最佳模式，為今后花青素苷的大規(guī)模應(yīng)用提供依據(jù)。