不同能量平衡狀態(tài)下瘦素及瘦素受體在小鼠肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制

李婷，霍泉，孫東君，路志國(guó)，杜勇

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 小兒外科，寧夏 銀川 750004）

能量平衡是攝入和消耗的能量達(dá)到一種平衡狀態(tài)，若攝入能量大于消耗能量時(shí)為正能量平衡，若攝入能量低于消耗能量時(shí)為負(fù)能量平衡。目前能量代謝相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年增加，最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)特發(fā)性顱內(nèi)高壓也是一種代謝性疾病[1]。能量代謝性疾病的作用機(jī)制也成為近年來(lái)研究中的熱點(diǎn)之一。在整個(gè)能量平衡調(diào)節(jié)過(guò)程中瘦素（leptin）和瘦素受體（leptin receptor，LEPR）是重要的調(diào)節(jié)分子，leptin來(lái)源于白色脂肪分泌[2]，通過(guò)肝糖原和脂肪代謝，參與能量平衡代謝過(guò)程[3]。外周leptin需與LEPR結(jié)合通過(guò)血腦屏障，作用于下丘腦從而抵抗脂質(zhì)沉積[4]。研究發(fā)現(xiàn)敲除Mex3c基因的小鼠通過(guò)增加活動(dòng)量而減少脂質(zhì)儲(chǔ)存，并全面抵抗由飲食導(dǎo)致的肥胖[5]，另外發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控IGF-1導(dǎo)致生長(zhǎng)遲滯[6]。目前研究證實(shí)Mex3c基因主要調(diào)控leptin參與中樞能量代謝過(guò)程[7]?，F(xiàn)就不同能量狀態(tài)下肝細(xì)胞損傷與leptin、LEPR的關(guān)系進(jìn)行探討，以期為肝臟細(xì)胞損傷的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：FVB/N雌鼠購(gòu)自于賽業(yè)公司，利用CRISPR/Cas9[8]技術(shù)構(gòu)建Mex3c+/-小鼠模型，所有小鼠均飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)所用飼料：（1）普通飼料（寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供）；（2）高脂飼料：預(yù)混料2.0%、磷酸氫鈣2.0%、大豆分離蛋白10.0%、豬油12.0%、蔗糖20.0%、膽固醇1.0%、維持鼠料53.0%（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建：對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行分組：Mex3c+/-突變組（Mex3c+/-組，n=6）、高脂飲食組（HFD組，n=6）、對(duì)照組（Contorl組，n=6）。均在4周齡與母鼠分開，高脂飲食組給與混合飼料（高脂飼料和普通飼料按照1:1混合）1周后，改成高脂飼料。其余兩組一直給與普通飼料。環(huán)境溫度保持在24 ℃，光照時(shí)間8:00-20:00，每天更換墊料，所有小鼠均自由取水；每周測(cè)體質(zhì)量（禁食8 h）記錄體質(zhì)量變化曲線，當(dāng)高脂飲食組體質(zhì)量高于對(duì)照組20%，視為造模成功。

1.2.2 小鼠實(shí)驗(yàn)取材：于14周齡取材，注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，通過(guò)心臟采血，置于4 ℃靜置2 h離心后留取血清；取血結(jié)束后迅速取出肝臟并記錄重量，置于冰上取出1 cm×1 cm肝右葉放入4%的多聚甲醛固定24 h；其余肝臟儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.2.3 光鏡及免疫組化觀察：取已固定的小鼠肝臟做成4 μm厚的石蠟切片，HE染色進(jìn)行光鏡觀察。取已固定小鼠肝組織制成4 μm的石蠟切片，按免疫組化兩步法檢測(cè)肝臟組織leptin（1:1 200）、LEPR（1:1 200）蛋白表達(dá)，經(jīng)Image-Pro-Plus6.0 軟件分析leptin和LEPR蛋白表達(dá)。

1.2.4 RNA提取及cDNA轉(zhuǎn)錄：取肝臟組織40 mg，轉(zhuǎn)移到消毒好研磨缽中，加液氮研磨成粉末，按照使用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒得到RNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA：反應(yīng)條件42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。引物設(shè)計(jì)：LEPR正義鏈5’-CGTGGTCAGAAGATGTGG-3’，反義鏈5’-CAGG AAAGGATGACAGC-3’。按照Tip Green qPCR Super Mix的兩步法實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western blotting法。取40 mg肝臟組織，按照凱基全蛋白提取試劑盒方法獲取蛋白，按照BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，煮沸后經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電（SDS-PAGE、8%）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，分別孵育一抗β-actin（1:5 000）、leptin（1:3 000）、LEPR（1:2 000）、4 ℃過(guò)夜，二抗常溫孵育1.5 h（1:10 000），電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色曝光，經(jīng)Image J軟件處理并分析圖像。

1.2.6 LEPR、ALT、AST及膽紅素檢測(cè)：取血清置于冰上解凍，按照BSTER試劑盒進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物體質(zhì)量差異

4 周齡時(shí)HFD組與Control組體質(zhì)量相近，HFD組經(jīng)過(guò)10 周高脂飼料飼養(yǎng)。3 組小鼠14 周齡體質(zhì)量結(jié)果顯示Control組（18.20±1.04）g、Mex3c+/-組（15.23±0.57）g、HFD組（21.56±2.56）g；與Control組相比，Mex3c+/-組體質(zhì)量降低（P＜0.01），HFD組體質(zhì)量增加（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠肝臟組織形態(tài)差異

光鏡下Control組肝細(xì)胞包膜、胞核完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見；Mex3c+/-組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞內(nèi)有小脂滴，沒(méi)有HFD組脂肪變明顯；HFD組的肝小葉結(jié)構(gòu)損傷但基本結(jié)構(gòu)可見，肝細(xì)胞增大、細(xì)胞核萎縮，甚至細(xì)胞無(wú)核徹底空泡化，被大量脂滴充斥。見圖1。

圖1 光鏡下各組小鼠肝臟組織形態(tài)（HE，×40）

2.3 各組小鼠肝臟組織中LEPR的mRNA相對(duì)表達(dá)量

與Control組（1.01±0.02）相比，Mex3c+/-組LEPR mRNA表達(dá)略升高（1.44±0.30），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但HFD組明顯升高（1.90±0.37）（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠血清中可溶性LEPR濃度差異

血清中含可溶性LEPR，可以通過(guò)血腦屏障，在下丘腦發(fā)揮功能。當(dāng)leptin與血清中的LEPR結(jié)合通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦，進(jìn)而參與下丘腦對(duì)食欲調(diào)控。ELISA測(cè)LEPR結(jié)果顯示，與Control組[（2 011.60±589.07）pg/mL]相比，Mex3c+/-組血清中可溶性LEPR濃度[（1 873.62±643.49）pg/mL]略下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HFD組明顯升高[（7 264.33±1 640.83）pg/mL，P＜0.01]。

2.5 各組小鼠leptin、LEPR在肝細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：leptin在細(xì)胞核表達(dá)，LEPR主要在細(xì)胞膜上表達(dá)但由于肝臟也可以分泌LEPR，因此胞漿內(nèi)可見LEPR蛋白表達(dá)，圖片中黃色或棕色為陽(yáng)性表達(dá)（紅色箭頭所指）。3 組肝臟組織leptin蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；3 組肝臟組織LEPR蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組均高表達(dá)LEPR蛋白（P＜0.01，P＜0.001）。見圖2～3。

圖2 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化（×40）

圖3 各組小鼠肝臟組織leptin、LEPR免疫組化數(shù)據(jù)

Western blotting結(jié)果顯示：3組leptin蛋白水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與Control組相比，Mex3c+/-組和HFD組肝臟組織leptin蛋白水平差異不大，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Mex3c+/-組和HFD組LEPR蛋白升高明顯，以HFD組表達(dá)水平最高（P＜0.01）。具體見圖4、圖5。

圖5 小鼠肝臟組織leptin、LEPR蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)

圖4 各組小鼠肝臟組織中l(wèi)eptin、LEPR蛋白表達(dá)電泳圖

2.6 各組小鼠血清ALT、AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）水平比較

與Control組比，Mex3c+/-組血清ALT、AST水平降低（P＜0.05），但TBIL、DBIL水平升高（P＜0.05）；但HFD組血清ALT、AST、TBIL和DBIL水平均升高（P＜0.05）。具體見表1。

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

表1 三組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL濃度水平比較（）

注：P1，Control組與Mex3c+/-組比較；P2，Control組與HFD組比較；P3，Mex3c+/-組與HFD組比較。

3 討論

能量平衡取決于食物的攝入與消耗之間是否平衡，相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，瘦素或者饑餓激素通過(guò)調(diào)控突觸后C-FOS表達(dá)參與能量平衡[9]。為了探索不同能量平衡狀態(tài)下肝臟細(xì)胞是否有損傷，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)敲除Mex3c基因誘導(dǎo)負(fù)能量狀態(tài)，高脂飲食誘導(dǎo)正能量狀態(tài)；定期測(cè)定小鼠體質(zhì)量，當(dāng)HFD組動(dòng)物體質(zhì)量高于Control組體質(zhì)量20%時(shí)為造模成功，結(jié)果表明模型構(gòu)建成功。測(cè)定ALT、AST、DBIL、TBIL指標(biāo)結(jié)果顯示，與Control組相比，Mex3c+/-組ALT、AST降低而TBIL、DBIL升高；HFD組的ALT、AST、TBIL、DBIL指標(biāo)均升高。關(guān)于負(fù)能量平衡中酶與膽紅素表達(dá)結(jié)果不一致原因，推測(cè)Mex3c基因誘導(dǎo)機(jī)體處于負(fù)能量平衡狀態(tài)，可能導(dǎo)致機(jī)體合成谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶降低，而膽紅素中直接膽紅素占總膽紅素比值在50%，提示肝臟細(xì)胞損傷。為了探究肝功能損傷原因，首先觀察肝臟病理結(jié)果。HE染色結(jié)果顯示，HFD組、Mex3c+/-組肝臟細(xì)胞內(nèi)有大小不一脂滴沉積，這提示正負(fù)能量狀態(tài)下肝臟細(xì)胞可能存在脂代謝紊亂。在正常人體內(nèi)，脂質(zhì)合成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡中，維持機(jī)體對(duì)能量需求；但長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)致使脂質(zhì)沉積，脂肪增多，打破人體脂質(zhì)代謝平衡，誘發(fā)非酒精性脂肪肝[10]，邵華等[11]實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可以誘導(dǎo)小鼠形成脂肪肝。在Mex3c+/-突變小鼠誘導(dǎo)負(fù)能量狀態(tài)的肝細(xì)胞中觀察到脂滴沉積，可能與長(zhǎng)期處于負(fù)能量狀態(tài)誘導(dǎo)高非酯化脂肪酸（NEFA），適量的NEFA被肝臟吸收用于氧化生成能量，而大量的NEFA會(huì)產(chǎn)生酮體進(jìn)而脂化，再次形成脂質(zhì)沉積肝臟[12]。

課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明Mex3c基因缺陷小鼠誘導(dǎo)機(jī)體形成負(fù)能量狀態(tài)[5]；通過(guò)誘導(dǎo)下丘腦內(nèi)C-FOS表達(dá)參與能量代謝研究[13]。經(jīng)過(guò)多年研究，學(xué)者們已經(jīng)證實(shí)下丘腦是能量代謝的中樞系統(tǒng)，可以通過(guò)調(diào)控leptin-LEPR進(jìn)而調(diào)節(jié)食物的攝入與排出[14]。Thaler JP等[15]發(fā)現(xiàn)人類和嚙齒動(dòng)物的肥胖與下丘腦損傷有關(guān)。高脂飲食可以使下丘腦炎癥損傷和增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，進(jìn)而導(dǎo)致leptin和胰島素敏感性下降[10，16]。肝臟作為外周代謝中心器官，基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知正負(fù)能量平衡會(huì)導(dǎo)致肝功能下降。其次檢測(cè)肝臟組織內(nèi)leptin、LEPR蛋白表達(dá)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組間leptin蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，除了能量狀態(tài)會(huì)影響leptin分泌，還與促性腺激素、甲狀腺激素及生長(zhǎng)激素以及l(fā)eptin自身調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。繼續(xù)檢測(cè)LEPR蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HFD組、Mex3c+/-組肝臟組織高表達(dá)LEPR蛋白，Coleman等[17]發(fā)現(xiàn)LEPR蛋白升高會(huì)增加基礎(chǔ)代謝和脂代謝過(guò)程。與病理學(xué)染色結(jié)果一致，高脂飲食組和Mex3c+/-組肝細(xì)胞中存在大小不一脂滴，表明可能存在脂代謝紊亂；可能與長(zhǎng)期高表達(dá)LEPR致使leptin發(fā)生抵抗，抑制胰島素分泌相關(guān)[18]。結(jié)合血清可溶性LEPR結(jié)果，當(dāng)leptin發(fā)生抵抗時(shí)，致使HFD組LEPR高表達(dá)，其結(jié)合敏感度減低；但Mex3c+/-組可溶性LEPR水平低，推測(cè)與此基因?qū)е聶C(jī)體負(fù)能量狀態(tài)，白色脂肪少，導(dǎo)致分泌leptin減少，進(jìn)而導(dǎo)致血清中LEPR低表達(dá)。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正能量平衡通過(guò)攝取過(guò)多營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，據(jù)莊波等[19]研究，吲哚菁綠清除試驗(yàn)可以評(píng)估剩余肝功能，可以利用此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善肝功能的評(píng)估。而Mex3c缺陷小鼠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)能量平衡，ALT、AST低表達(dá)，而膽紅素指標(biāo)高表達(dá)，推測(cè)Mex3c誘導(dǎo)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體合成ALT、AST原料減少；但為了維持機(jī)體對(duì)能量需求，可能將外周脂肪進(jìn)行非酯化，轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞中提供能量，若酯化物過(guò)多，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，引起膽紅素升高。Chao等[20]研究表明，Mex3c+/-促進(jìn)聚積脂質(zhì)、細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，可能與含有EH結(jié)構(gòu)相關(guān)；除此之外，Cao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Mex3c通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)FGF14加速了骨肉瘤的惡性進(jìn)程，這些表明Mex3c基因仍有許多未解之謎。最新研究發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠可增強(qiáng)線粒體功能，抵抗高脂飲食誘導(dǎo)脂肪變性，通過(guò)補(bǔ)充雌二醇可以改善小鼠卵巢切除后誘發(fā)的膽汁酸代謝障礙[22]，這為以后研究提供新思路。在leptin-LEPR參與的肝細(xì)胞損傷中，LEPR比leptin更具有意義，但目前的研究資料有限，leptin-LEPR是否通過(guò)影響線粒體功能參與到肝臟細(xì)胞損傷紊亂，有待進(jìn)一步研究，尋找到關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)。