來那度胺通過抑制VEGF蛋白表達(dá)抑制人肝癌細(xì)胞LM3的遷移和侵襲

來佳程，鄭亦胡，唐銀河

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

肝癌是常見的消化道腫瘤，GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2018 年全球診斷出約84.1萬肝癌新病例，并有78.1 萬人死于肝癌。肝癌在全球腫瘤中排名第5[1]，在中國惡性腫瘤發(fā)病率中排名第4，是中國癌癥死亡的第二大原因[2]。雖然肝癌的治療方式在進(jìn)步，但由于早期診斷的缺乏及其高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，肝癌的長期預(yù)后仍然較差，在中國5年生存率僅14.1%[3]。因此需要進(jìn)一步研究肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制，找到新的藥物和靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor，VEGF/VEGFR）在腫瘤中往往呈現(xiàn)高表達(dá)，VEGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，形成微血管，對腫瘤進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)供給[4]。在胰腺癌中，VEGF與VEGFR結(jié)合后可以激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[5]。在腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，VEGF和VEGFR-1的表達(dá)均增加，并通過自分泌途徑促進(jìn)細(xì)胞生長，以避免細(xì)胞因缺少黏附而凋亡[6]。來那度胺是一種免疫調(diào)節(jié)藥物，并具有良好的抑制血管生成作用，廣泛用于各種血液系統(tǒng)疾病。來那度胺具有抑制VEGF表達(dá)的效果，被發(fā)現(xiàn)可以抑制小鼠腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[7]并能促進(jìn)結(jié)直腸癌血管正?；?，增強(qiáng)化療效果[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究來那度胺對肝癌細(xì)胞LM3遷移和侵襲的影響并探究其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人肝癌細(xì)胞LM3 細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞庫），胎牛血清（美國，Sigma Chemical），E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白抗體（美國，Cell Signaling Technology），VEGF蛋白抗體（美國，Affinity Biosciences），GAPDH抗體（美國，Affinity Biosciences），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胰蛋白酶（美國，Gibco），蛋白酶抑制劑、RIPA緩沖液（中國北京，Solarbio），羊抗兔二抗（美國，Cell Signaling Technology），Transwell小室（美國，Costar），基質(zhì)膠（美國，Corning）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞LM3 培養(yǎng)于含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)細(xì)胞生長情況決定傳代時(shí)間，用0.25%EDTA胰酶進(jìn)行消化傳代，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.3 細(xì)胞活性測定

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)期生長的LM3細(xì)胞按照8×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，24 h后待腫瘤細(xì)胞貼壁，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入分別含有5、10、20、40、80 μmol/L來那度胺培養(yǎng)基100 μL，以不含來那度胺的培養(yǎng)基100 μL作為對照，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，分別每孔加入10 μL的CCK-8 試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，檢測450 nm波長處的吸光度（記為A值），則細(xì)胞存活率=[（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）]×100%。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲測定

NC組（對照組），Lena組（40 μmol/L來那度胺處理48 h），VEGF組（人重組VEGF 10 ng/mL處理48 h）和VEGF+Lena組（人重組VEGF 10 ng/mL預(yù)處理48 h后再用40 μmol/L來那度胺處理48 h）。

劃痕實(shí)驗(yàn)：分別取普通LM3 細(xì)胞及VEGF預(yù)處理的細(xì)胞5×105個(gè)植入6 孔板中，確保貼壁后融合率達(dá)到90%～100%。貼壁后用200 μL槍頭進(jìn)行劃痕之后，分別加入3 mL普通培養(yǎng)基，40 μmol/L來那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF預(yù)處理細(xì)胞中加入40 μmol/L來那度胺。拍照記錄并重新放回37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后再次拍照，并進(jìn)行對比。遷移率=[（0 h劃痕間面積-48 h劃痕間面積）/0 h劃痕間面積]×100%。

侵襲實(shí)驗(yàn)：取普通細(xì)胞以及VEGF預(yù)處理的細(xì)胞，用無FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL。24孔板中放置好8 μm孔徑的鋪有matrigel膠的Transwell小室，取200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室分別加入800 μL均含15%血清的普通培養(yǎng)基，40 μmol/L來那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF預(yù)處理組加入40 μmol/L來那度胺。培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，輕輕擦去上室沒有穿過的細(xì)胞。顯微鏡下記錄穿入下室的細(xì)胞數(shù)量。

1.5 蛋白表達(dá)測定

Western blotting實(shí)驗(yàn)：提取NC組、Lena組、VEGF組、VEGF+Lena組細(xì)胞總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，蛋白抗體雜交、顯影步驟進(jìn)行處理。以GADPH為標(biāo)準(zhǔn)，檢測E-cadherin、Vimentin、Snail、VEGF的蛋白相對表達(dá)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有分析均在SPSS 19.0軟件中進(jìn)行。取至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，獲得的數(shù)據(jù)用（）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度來那度胺對肝癌細(xì)胞 LM3的毒性作用及對VEGF蛋白表達(dá)的影響

不同濃度來那度胺（0、5、10、20、40、80 μmol/L）處理LM3細(xì)胞24 h和48 h后，各組細(xì)胞在450 nm處吸光度值和細(xì)胞活力與對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各實(shí)驗(yàn)組之間比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，見圖1），這說明5～80 μmol/L濃度的來那度胺對LM3細(xì)胞活性沒有影響。

圖1 不同濃度來納度胺處理肝癌細(xì)胞LM3 24 h和48 h后細(xì)胞活性的變化

不同濃度來那度胺（0、5、1 0、2 0、4 0、80 μmol/L）處理LM3細(xì)胞48 h后五組VEGF表達(dá)量分別為（0.815±0.048），（0.798±0.035），（0.671±0.058），（0.472±0.041），（0.231±0.040），（0.183±0.027），表達(dá)量降低呈劑量依賴性，5 μmol/L和10 μmol/L組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，20、40、80 μmol/L組與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于80 μmol/L組與40 μmol/L組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2），所以本研究采用40 μmol/L濃度來那度胺進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度來那度胺對肝癌細(xì)胞LM3 VEGF蛋白表達(dá)的影響

2.2 來那度胺對LM3細(xì)胞遷移和侵襲的影響

觀察40 μmol/L來那度胺作用下LM3 細(xì)胞遷移和侵襲的變化。如圖3 所示，來那度胺能有效抑制LM3細(xì)胞的遷移和侵襲。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件處理LM3細(xì)胞48 h后細(xì)胞的遷移率和侵襲數(shù)

圖3 來那度胺對LM3細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.3 來那度胺對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

本研究通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證明，在40 μmol/L來那度胺作用下，EMT相關(guān)蛋白標(biāo)志物Snail、Vimentin和VEGF蛋白表達(dá)水平下調(diào)；Snail作為E-Cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子，其表達(dá)量減少使得E-cadherin表達(dá)量升高，促進(jìn)細(xì)胞間黏附，從而減少細(xì)胞的侵襲性（見圖4 和表2）。而在VEGF的作用下，LM3 細(xì)胞發(fā)生EMT，引起Snail表達(dá)升高，進(jìn)而抑制E-cadherin表達(dá)；且VEGF和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)量也明顯升高，導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。經(jīng)VEGF預(yù)處理的細(xì)胞在來那度胺的作用下，因VEGF表達(dá)受到抑制，阻斷EMT的持續(xù)發(fā)生，因此遷移和侵襲程度較VEGF組減弱（見表2）。在此我們得出結(jié)論，來那度胺通過抑制LM3 細(xì)胞表達(dá)VEGF，從而減弱了細(xì)胞的侵襲性。

表2 不同實(shí)驗(yàn)條件處理LM3細(xì)胞48 h后EMT相關(guān)蛋白的相對表達(dá)值

圖4 來那度胺對LM3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

盡管索拉菲尼作為抗血管治療的一線藥物提高了晚期肝癌患者的總體生存率，卻常因耐藥性導(dǎo)致治療失敗[9]；但另一方面，抗血管治療的部分成功提示抗血管治療仍有巨大的探索空間。已有的研究證明，腸癌、鼻咽癌中腫瘤細(xì)胞通過自分泌和旁分泌的形式產(chǎn)生VEGF，與腫瘤細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后激活通路，促使腫瘤發(fā)生EMT[10-11]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞失去極性并表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特性從而引起細(xì)胞黏附能力降低的機(jī)制[12]。

在多數(shù)腫瘤中VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)，不僅誘導(dǎo)血管生成，使建立起血液供應(yīng)系統(tǒng)，從而加速生長和侵襲性[12]。肝癌是一種典型的高度血管增生腫瘤，而肝癌組織中出現(xiàn)VEGF高表達(dá)以及術(shù)前血漿高VEGF值的患者，總生存率（OS）和無病生存率（DFS）較短[13]，因此有學(xué)者提出將VEGF指標(biāo)作為診斷肝癌預(yù)后的重要指標(biāo)[14]。來那度胺是一款具有抗血管生成作用的藥物，已有研究證明來那度胺通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）來抑制VEGF的表達(dá)，并且通過阻斷PI3K-AKT通路來減弱VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的成管作用[15]。在動物實(shí)驗(yàn)中使用來那度胺后宮頸癌瘤塊邊緣及中心血管數(shù)量均明顯低于對照組[16]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來那度胺具有抑制肝癌細(xì)胞LM3 表達(dá)VEGF的作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制效果逐漸加強(qiáng)。同時(shí)來那度胺處理后增加了E-黏附蛋白的表達(dá)，減少了間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、Snail的表達(dá)，從而抑制了肝癌細(xì)胞LM3的遷移和侵襲。相反，VEGF與細(xì)胞表面受體結(jié)合促進(jìn)LM3 細(xì)胞的EMT，增加了LM3細(xì)胞的侵襲性，并且在該過程中細(xì)胞VEGF表達(dá)升高。而來那度胺作用于VEGF預(yù)處理的細(xì)胞后，抑制了VEGF的表達(dá)，減少了其與VEGFR-1結(jié)合，因此減少了遷移和侵襲的能力。

本研究我們選用具有高度侵襲性的肝癌LM3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)來那度胺對肝癌細(xì)胞的活性具有抑制作用，但是它能抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF，從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲，因此具有一定的肝癌治療潛力。