35味中草藥提取物體外抑菌活性的研究

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喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000

地理區(qū)位、生態(tài)條件獨特的新疆維吾爾自治區(qū)，蘊藏著豐富、上好的中藥材資源[1]。南疆四地州(阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)與克孜勒蘇柯爾克孜自治州)冬季溫和、日照充足、外貿(mào)潛力深厚[2]。近些年來，中草藥種植業(yè)逐漸成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶增收致富的新途徑，展現(xiàn)出良好的經(jīng)濟(jì)、社會效益，前景廣闊。其中已經(jīng)達(dá)到了一定的種植規(guī)模、具有地理標(biāo)志性的中藥材有：和田玫瑰、岳普湖孜然、阿克蘇甘草、烏什沙棘、克州紅花與葉城紫草。帶動南疆地區(qū)中草藥種植業(yè)的優(yōu)質(zhì)、長效發(fā)展，需要解決產(chǎn)業(yè)鏈短、附加值低等一系列市場難題?，F(xiàn)今，維吾爾民族醫(yī)藥尚缺乏經(jīng)現(xiàn)代化、規(guī)范化研發(fā)生產(chǎn)的特色新藥品種[3]。新疆深居內(nèi)陸、氣候干燥、人口集中，而抗菌素易積累于稀缺的水資源中[4]，故“減抗”、“替抗”刻不容緩、勢在必行。研究中草藥材的體外抑菌活性，可以在一定程度上幫助疾病防治、新藥開發(fā)、環(huán)境保護(hù)與產(chǎn)業(yè)規(guī)劃。

發(fā)達(dá)的物流加速了優(yōu)質(zhì)藥材的流動，為民族藥劑創(chuàng)新搭建了嶄新的平臺。全國各族人民在長期實踐中發(fā)掘的本草、方藥[6]，擴(kuò)展了維吾爾醫(yī)藥的科研視野。表1中列出的35味載于《中華本草》、《維吾爾藥志》的藥材[7-8]。它們或清熱解毒，或化痰止咳，或消腫排膿，或祛風(fēng)解表，或理血固澀，常被用于抗炎、殺菌[9]，且療效確切、基源可靠。

表1 35種供試草藥

表2中列出的14種標(biāo)準(zhǔn)指示菌在有氧環(huán)境中生長良好。其中的革蘭氏陽性(G+)球菌S.a、S.p，革蘭氏陰性(G-)腸桿菌K.p、E.c與G-非發(fā)酵菌P.a、A.b，是臨床感染與傳播中最常檢出的病原菌[10]。L.m、S.t、S.f常見于食源性人畜共患疾病。P.m、S.m、A.f廣泛分布于水與土壤中，是重要的條件致病菌。B.s具有典型的芽孢桿菌特征。C.a是常見于頑固的皮膚黏膜感染的真菌。

表2 14種指示菌株

中草藥體外抑菌活性是中醫(yī)研究的經(jīng)典課題。早在1947年，徐振氏[11]就進(jìn)行了400種中草藥對4種病原菌的體外抑菌實驗。據(jù)筆者于2020年10月的查詢，中國知網(wǎng)收錄的標(biāo)題中含“中藥”與“體外抑菌”的文獻(xiàn)已達(dá)2651篇。微量增效劑即可大幅提高主方藥物的抑菌活性。然而，礙于“試管法”與藥敏紙片法程序繁瑣，前人的工作大多停留在單方藥層次，少見關(guān)于藥物間增效抑菌的研究。96孔板微量肉湯稀釋法操作簡便、功能多樣、結(jié)果可靠。采用此方法，筆者測定35種中草藥提取物與10種抗菌素對14種標(biāo)準(zhǔn)指示菌株的MIC90；并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了10種中草藥提取物經(jīng)超濾離心分離得到的大、小分子的MIC90；篩選出可增效抑菌的藥物組合。

1 儀器與材料

1.1 指示菌 K.p、P.a、A.b、S.a、E.c由深圳市呼吸疾病研究所提供，10%甘油凍藏于離心管內(nèi)。C.a、L.m、B.s、S.p、S.t、P.m、A.f、S.m、S.f購于廣東環(huán)凱微生物生物技術(shù)有限公司，為凍干粉。

1.2 抗菌素 紅霉素(ERY)、四環(huán)素(TCY)、頭孢他啶(CFZ)、卡那霉素(KAN)、萬古霉素(VAN)、氯霉素(CHL)、青霉素(PEN)、氧氟沙星(OFX)、多粘菌素B(PB)、美羅培南(MEM)由深圳市呼吸疾病研究所提供。

1.3 中草藥 野生人字草、千葉蓍采自喀什市英吾斯坦鄉(xiāng)，沙棘、玫瑰、紫草、孜然、甘草、紅花為人工栽植品。以上藥材經(jīng)超聲清洗后，于干燥箱內(nèi)烘干。秦艽、伊貝母、洋甘菊、雪蓮本草購自新疆伊鼎輝煌生物科技有限公司，為干品。木香、胡黃連30∶1(料液比)提取物購自陜西橫嶺生物科技有限公司。其余20∶1提取物購自西安金綠生物工程技術(shù)有限公司。以上直接購得的提取物均由大宗正品本草經(jīng)三次75%乙醇提取而成，干粉收率為8%±2%。所有藥材標(biāo)本均保存于喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室中，經(jīng)顯微形態(tài)學(xué)鑒定均符合2020年版《中國藥典》與以往文獻(xiàn)報道中的相關(guān)描述。

1.4 試劑 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，生工生物工程，批號：F411BA0017)；龍膽苦苷(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；雙蒸水(粵戴水處理設(shè)備有限公司)；

1.5 培養(yǎng)基 陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯(Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth,CAMHB)，pH 7.2，大連美侖生物，批號:MB2439-Jul-11D)。LB平板(常德比克曼生物科技有限公司)。

1.6 儀器 IX53倒置顯微鏡(Olympus)；高壓蒸汽滅菌器(PHCbi)；KH3200DE型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器)；XA-1型多功能粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠)；ZK-82B真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Scilogex)；HR40-IIA2型生物安全柜(青島海爾)；Bluepard THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床、Bluepard DHP-9031微生物培養(yǎng)箱(上海一恒)；Centrifuge 5810R大容量離心機(jī)、AG22331 Hamburg紫外可見光分光光度計(Eppendorf)；iMark酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；JJ224BC型電子天平(G&G)；PHS-3C酸度計(成都銳新)；075870麥?zhǔn)媳葷峁?廣東環(huán)凱)；5mL截留分子量3kDa超濾離心管(PALL)；各量程單道、八道移液器(RAININ)；

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 提取 將干燥、粉碎、過篩(40目，孔徑0.37 mm)的藥材粉末稱取16 g，置于無紡布袋內(nèi)，300 mL 60%乙醇70 ℃水浴浸泡2 h。20 kHz超聲提取40 min。抽濾除渣。12000 rpm離心3 min。棄沉淀。減壓濃縮上清液至稍有固體粉末析出。用雙蒸水溶解至10 mL。購得的提取物粉末取1.28 g溶于10 mL雙蒸水中。得到生藥當(dāng)量濃度1600 mg/mL的藥液。搖勻。加入10 mL 2×CAMHB。得到800 mg/mL藥液。測定pH值。配置與35種藥液中最低pH值等同的CAMHB培養(yǎng)基(沙棘，pH 3.76)用于陽性對照。800 mg/mL藥液用0.22 um微孔濾膜濾過除菌。置于4℃冰箱備用。

2.1.2 菌株 菌株經(jīng)復(fù)蘇、復(fù)壯后，于CAMHB中37 ℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6000.6～0.8)。菌液調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫?OD6250.08～0.13)后，2∶3稀釋，使其中含菌1×108cfu/mL。

2.1.3 微量肉湯稀釋法測MIC90遵照ISO 20776-1[12]、CLSI M07-A10[13]與M27-S4[14]中關(guān)于肉湯微量稀釋法的操作規(guī)范，在96孔微量稀釋板中，一列一藥，A孔加入各800 mg/mL藥液200 μL；B-G孔內(nèi)加入100 μL CAMHB；A孔吸取100 μL，依次倍比稀釋至G孔，棄余液100 μL。使A-G生藥當(dāng)量濃度 (Crude drug equivalent concentration)ck(k=1、2…7)分別為800、400、200、100、50、25、12.5 mg/mL。由于高濃度中藥液呈深色，需要在H孔內(nèi)各加入800 mg/mL藥液100 μL作陰性“藥液對照”。留未接菌板作“初始對照”?？咕厮幟粼囼灍o需陰性對照。A-H孔抗菌素濃度梯度ck(k=1、2…8)為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。如圖1所示。

一板一菌。實驗組各孔接1 μL 1×108CFU/mL菌液；使其中最終接菌量為1×106CFU/mL。第12列A-D孔加入100 μL CAMHB作空白“肉湯對照”。E-H加入100 μL酸性對照培養(yǎng)基，并同上接菌1 μL，作陽性“生長對照”。加蓋，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。MTT可被活菌線粒體中的琥珀酸脫氫酶氧化為藍(lán)紫色結(jié)晶。96孔內(nèi)均加入20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液(初始對照同)。37 ℃避光30 min。測定OD600。

2.1.4 超濾分離 取4 mL 800 mg/mL藥液于3 kDa超濾管中離心至完全分離，得到含大、小分子成分的兩組子藥液。高溫高壓滅菌后，子藥液分別重復(fù)前述步驟，測定MIC90。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理方法 各行A-G、H格抑菌率Ik(k=1、2…7、8)(%)=1-[Ok-(On/Osn)×Osk]/(Op-Ob)×100%。Ok：第k孔中的OD值；On：陰性對照孔OD值；Osn：初始對照該列陰性對照OD值；Op：陽性對照孔平均OD值；Ob：空白對照孔平均OD值；Osk：該列初始對照第k孔OD值；滿足In(n∈k)>90%的最低cn記為MIC90。2.1.3、2.1.4中每列藥-菌試驗重復(fù)7次，得離散MIC90數(shù)列mp(p=1、2…7)。取mp中的眾數(shù)記錄。

2.1.6 抗菌增效藥物組合的篩選 ①制備“增效劑庫”。取一96孔板，1-5、7-11列前35孔依藥材編號次序加入200 μL 800mg/mL的中藥液，5、11兩列后5孔加入10種200 μL 16 μg/mL抗菌素，6、12列加入200 μL CAMHB。 ②制備“實驗板”?！霸鲂臁备骺兹? μL對應(yīng)加入空白96孔板后，在第該板1-5、7-11列加入98 μL 1/2 MIC90主方的接菌肉湯(空白對照加入等量無菌無藥CAMHB肉湯)，6、12列加入98 μL CAMHB?！皩嶒灠濉奔由w，37 ℃培養(yǎng)18 h后，加入MTT。判定清亮孔中的藥物組合增效抑菌作用為顯著。

2.1.7 棋盤法藥物聯(lián)用將兩種抗菌藥物倍比稀釋為8個濃度梯度。按A-G、8-1濃度遞減順序，各取50 μL兩兩組合加入96孔平板中，得到每孔100 μL的8×8棋盤矩陣。遵照2.1.3中的方案，9、10列照作兩種藥物的MIC實驗；剩余孔作陰性、陽性、空白對照。留未接菌板作初始對照。

2.2 結(jié)果

2.2.1 中草藥提取物對標(biāo)準(zhǔn)指示菌株實驗中所有空白、陰性對照孔均清亮，陽性對照孔呈深藍(lán)紫色； CLSI M100[15]中涉及到的標(biāo)準(zhǔn)株均為敏感；實驗處于正常狀態(tài)。由表3、4可知，玫瑰對于除C.a外的13種指示菌，秦艽對B.s、E.c、S.f、K.p、A.b，沙棘對P.a，千葉蓍對S.p、K.p和A.b，胡黃連對S.a和A.b，駱駝篷子與紅花對E.c，人字草、巖白菜與甘草對S.a，駱駝蓬子與甘草對S.p，薄荷對S.a、P.a，具有較強的抑菌作用。甘草對G+細(xì)菌的抑菌活性高于G-細(xì)菌。只有紫草、薄荷可以抑制C.a。

表3 10種抗菌素對14種標(biāo)準(zhǔn)指示菌株的MIC90 (μg/mL)

表4 35種中草藥提取物對14種標(biāo)準(zhǔn)指示菌株的的MIC90

2.2.2 10種中草藥提取液經(jīng)篩分后成分的結(jié)果 選取云南產(chǎn)胡黃連，西藏產(chǎn)巖白菜，新疆產(chǎn)秦艽、沙棘、千葉蓍、人字草、玫瑰、駱駝蓬子、紅花、甘草10種中草藥液超濾分離。因各子藥液體積均不低于原藥液的1/3，其生藥當(dāng)量濃度記為800 mg/mL。由表5可知，千葉蓍抗S.p時的活性的物質(zhì)為3000 Da以下小分子，抗S.t時大、小分子的MIC90等同于未經(jīng)超濾離心分離的原藥液。沙棘在抗P.a、E.c時，大、小分子的MIC90也與原藥液相同。秦艽、胡黃連、人字草在抑制S.a等菌時的活性物質(zhì)為3000Da以上大分子。以龍膽苦苷為代表的裂環(huán)環(huán)烯醚萜類常被認(rèn)為是秦艽的特征成分。本實驗證實，4 mg/mL的龍膽苦苷對E.c、A.b無抑菌活性。玫瑰(圖2.1)、駱駝蓬子、紅花、甘草的大、小分子普遍具有協(xié)同抑菌作用。人字草的小分子雖然無法直接抑制S.a，但是可以增強其大分子的抑菌能力(圖2.2)。巖白菜提取物中的大、小分子在抑制S.a、P.a、E.c時有協(xié)同作用，而在抑制A.b時，則大、小分子拮抗。這表明，中草藥抑菌是多靶點的。針對不同的菌株，中草藥成分的藥效作用機(jī)制不同。

表5 10種中草藥提取液經(jīng)3 kDa超濾離心管篩分后成分的MIC90

2.2.3 抗菌增效藥物組合 秦艽、柴胡、甘草是常用于治療發(fā)熱與上呼吸道感染的復(fù)方搭配。秦艽可顯著增效頭孢他啶對大腸埃希菌的抑菌活性(圖2.3)；50%抑菌折點為CFZ 0.125 μg/mL、秦艽12.5 mg/mL。CFZ抑制轉(zhuǎn)肽酶在細(xì)菌細(xì)胞壁形成過程中的轉(zhuǎn)肽作用。牛俊瑞[30]的研究指出，破壞生物膜可有效抑制E.c，且只有當(dāng)頭孢他啶與黃芩等中藥提取物的濃度均達(dá)到一定閾值時，聯(lián)合用藥才可有效抑菌。此結(jié)果與本實驗圖2.3中明顯的橫、縱分界線吻合，提示秦艽增效CFZ的抑菌機(jī)制可能與破壞E.c的生物膜相關(guān)。黏肽合成酶PBP1b是亞-MIC CFZ抑制E.c生物膜形成的主要靶點[31]。童麗艷[32]使用計算機(jī)輔助分子對接技術(shù)，從104萬個化合物中篩選出的4種作用于PBP1b的先導(dǎo)化合物，均具有苯磺酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)，分子量在275～425 Da之間，對E.c、L.m、B.s、S.a、P.a的MIC為175～225 μg/mL。然而，龍膽科植物化學(xué)成分中未見此類化合物的報導(dǎo)。秦艽中增效CFZ的化學(xué)成分，有待進(jìn)一步發(fā)掘研究。

沙棘可增效CHL、OFX抑制銅綠假單胞菌；50%抑菌折點分別為CHL 8 μg/mL、沙棘6.25 mg/mL與OFX 1 μg/mL、沙棘25 mg/mL。銅綠假單胞菌在呼吸系統(tǒng)感染中最為常見，是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的重要病原菌。在沙棘濃度為25 mg/mL時，CHL對P.a的90%最小抑菌濃度可由單用時的16 μg/mL降低至4 μg/mL。CHL通過干擾tRNA結(jié)合在在細(xì)菌70S核糖體50S亞基上，抑制蛋白質(zhì)合成。OFX抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性而阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制。戴曉天[33]發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境抑制P.a的生長與生物膜的生成，并降低P.a蛋白水解酶的分泌；OFX抑制P.a活性隨Ph的增高而降低。于是，筆者將沙棘藥液Ph調(diào)節(jié)至7.2再次測試，發(fā)現(xiàn)其對OFX的增效作用略微減弱，而對CHL的增效作用無變化(圖2.4)。見表6。

表6 抗菌增效藥物組合

千葉蓍耐脊薄、干旱，易于栽培，與薄荷、獨活、柴胡等多種藥物聯(lián)用時可以有效抑制P.a與A.b。而現(xiàn)今，千葉蓍在南疆地區(qū)仍然鮮有栽植。

3 討論

抗菌素的廣泛使用，在有效地控制細(xì)菌感染的同時，造成了不同程的殘留和耐藥性后果。中藥以其毒副作用小、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)勢，愈加受到科研工作者的重視。各地中藥材的研究，都為民族醫(yī)藥的現(xiàn)代化研發(fā)提供了參照。據(jù)報導(dǎo)，鞣質(zhì)為500 Da以上的水溶性酚類化合物，存在于70%以上的植物藥中，與許多藥物的抑菌活性有關(guān)[31]；玫瑰中芳香類與多酚類[23-32]，沙棘果中的黃酮、多糖[33-34]，異甘草素對于G+菌[35]，具有較強的抑菌活性。近20年來，盡管分子水平的中草藥化合物研究已全面展開，千葉蓍、駱駝蓬子等新疆常見中藥材中的化合物的分子作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

本實驗研究了35種中草藥對細(xì)菌的體外抑菌活性，得到的各MIC90值與文獻(xiàn)中記載的研究成果大致相似。但是，由于藥品品種、產(chǎn)地、提取工藝的差異，部分結(jié)果稍有不同。分級抑菌濃度結(jié)果(圖2.3～2.4)證明了中藥聯(lián)用可減少抗菌素的用量。與化學(xué)特征顯著的現(xiàn)代抗菌素“藥物”理念不同的是，民族民間醫(yī)學(xué)主張通過調(diào)節(jié)人體的“氣質(zhì)”，從整體上提高機(jī)體的免疫力，以實現(xiàn)病灶的清除。受制于樣本來源單一、“南橘北枳”、未進(jìn)行動物實驗，本實驗究仍然具有一定的局限性，有待后續(xù)研究予以加強。