納豆芽孢桿菌發(fā)酵菜用大豆中總黃酮的提取及其降血脂效果評(píng)價(jià)

李秀涼，倪慶圓，楊 宸，宋 永，韓曉云，孫慶申,

（1.黑龍江大學(xué)，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080）

調(diào)查顯示，我國15～69歲的人群當(dāng)中約有40%是高血脂癥患者，病癥主要是由長期高脂飲食導(dǎo)致對(duì)脂質(zhì)的過度吸收或者是體內(nèi)脂質(zhì)代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)異常引起[1]。目前，市面上治療高脂血癥的藥物主要包括他汀類及樹脂類藥物、煙酸和依折麥布等[2]，這些藥物大多具有副作用，所以尋找天然的降血脂物質(zhì)顯得尤其重要。

大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期食用富含總黃酮的食品能夠有效降低心血管疾病的發(fā)病率[3]。陳會(huì)良等[4]研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮類物質(zhì)在降脂方面主要是通過對(duì)抗低密度脂蛋白的氧化、清除體內(nèi)自由基及抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。

納豆主要是以大豆為原料，蒸煮后接入納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成。納豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高，具有多種醫(yī)療保健功能。納豆含有總黃酮、卵磷脂、皂苷、生物堿等多種生理活性物質(zhì)，長期食用可提升機(jī)體的免疫力[5]。納豆中的總黃酮更是具有抗氧化[6-7]、抗癌[8-11]、降血壓和降血脂[12-15]等功效。因此，選擇特定的豆制品原料，再通過一定的生物技術(shù)手段提高其中的總黃酮類物質(zhì)的含量具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

菜用大豆是一種含有豐富植物蛋白、多種有益礦物質(zhì)、維生素及膳食纖維等成分的豆類植物。目前，我國對(duì)于菜用大豆深加工產(chǎn)品的研究和開發(fā)還比較落后。本課題研究目的是以菜用大豆等外品為原料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期分析顯示，通過蘆丁比色法未能測到總黃酮類物質(zhì)，因此，本文擬利用納豆芽孢桿菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵處理，以期提高總黃酮含量，為企業(yè)提高菜用大豆的附加值、增加收入提供重要的解決方案。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌粉 日本有限會(huì)社高橋祐藏研究所；菜用大豆 山東陽光農(nóng)業(yè)生物科技有限公司；SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠90只 6～8周齡，18～22 g，長春長生生物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)NO.SCXK（遼）2020-0001；高脂飼料 北京泰博宏達(dá)生物有限公司；普通飼料 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；奧利司他 中山萬漢制藥；小鼠高密度脂蛋白（High density lipoprotein, HDL）、總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α, TNF- α）ELISA試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑 市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆發(fā)酵 按照傳統(tǒng)的方法[15]制作納豆，具體過程如下：挑選無發(fā)霉、蟲害的菜用大豆，清洗后浸泡過夜，在121 ℃條件下蒸煮20 min，自然冷卻至50～60 ℃后，按5.75×1010～2.3×1011CFU/100 g接入納豆菌菌液，接種完成后置于恒溫培養(yǎng)箱中，于35～41 ℃發(fā)酵12～48 h，發(fā)酵完成后，將納豆放入4 ℃冰箱中后熟6～24 h后取出，即得到發(fā)酵好的納豆。

1.2.2 總黃酮提取及含量測定 參考文獻(xiàn)[16-18]的方法提取總黃酮。將發(fā)酵好的納豆置于-20 ℃預(yù)凍12 h后，進(jìn)行冷凍干燥，然后將冷凍干燥完成的納豆置于粉碎機(jī)中粉碎，過80目篩后，稱量所得納豆粉質(zhì)量。向納豆粉中加入10倍體積石油醚，在超聲功率為300 W的條件下間歇處理10次，每次3 min，萃取脂肪，棄去石油醚層后，加入30倍體積60%乙醇，80 ℃熱回流3 h，收集提取液，即得總黃酮粗提液。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定總黃酮含量[16-19]。具體操作如下：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL（相當(dāng)于0、75、150、300、450、600 μg蘆丁），移入10 mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5 mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

取適量的黃酮粗提物粉末，配制成合適濃度的溶液，按照對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的處理過程獲得黃酮粗提物待測液，測得的OD510吸光值，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.3 納豆發(fā)酵工藝單因素實(shí)驗(yàn) 將菜用大豆清洗后倒入250 mL錐形瓶中，121 ℃、0.1 MPa下高溫蒸煮20 min后，以納豆中總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)處理：

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間 按1.150×1011CFU /100 g添加納豆芽孢桿菌，于37 ℃條件下分別靜置發(fā)酵12、24、36和48 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同發(fā)酵時(shí)間下得到的納豆中總黃酮的含量，確定最適合的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度 按1.150×1011CFU /100 g添加納豆芽孢桿菌，分別于35、37、39和41 ℃靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同發(fā)酵溫度下得到的納豆中總黃酮的含量，以確定最適合的發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 接 菌 量 分 別 按5.750×1010、1.150×1011、1.725×1011和2.300×1011CFU /100 g添 加 菌 液，37 ℃靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同接菌量下發(fā)酵制得的納豆中總黃酮的含量，得到最適合的接菌量。

1.2.3.4 后熟時(shí)間 按1.150×1011CFU /100 g添加菌液，37 ℃分別靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱分別后熟6、12、18和24 h，測定不同后熟時(shí)間下發(fā)酵制得的納豆中總黃酮的含量，得到最適合的后熟時(shí)間。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)納豆黃酮產(chǎn)量影響顯著的三個(gè)因素，即發(fā)酵時(shí)間（A）、接菌量（B）和后熟時(shí)間（C）為變量，納豆中總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用正交表L9（34）進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，確定納豆發(fā)酵條件最佳組合（如表1所示）。

表1 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for optimization of natto fermentation process

1.2.5 總黃酮粗提液的純化 參考文獻(xiàn)[16-18]的方法純化黃酮粗提液。將D101型大孔樹脂倒入95%乙醇中預(yù)處理12 h，然后填入層析柱中，用蒸餾水洗至無味，然后以1.5 mL/min的流速加入250 mL總黃酮粗提液，靜置平衡30 min；平衡完成后使用70%乙醇溶液以1.5 mL/min的流速洗滌直至大孔樹脂無色，收集洗脫液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液，濃縮完成后置于-20 ℃預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥，獲得純化的總黃酮粉末。將純化的總黃酮粉末配制成一定濃度的總黃酮水溶液，并根據(jù)1.2.2的方法確定總黃酮的含量。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及劑量 實(shí)驗(yàn)選擇80只雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，體重18～22 g。將實(shí)驗(yàn)小鼠放置在動(dòng)物飼養(yǎng)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間12 h光照和12 h黑暗，動(dòng)物自由飲食攝水。適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，進(jìn)行以下分組實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.1 緩解實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取48只小鼠，分為6組，每組8只，除空白對(duì)照組（A組）以外，其余各組連續(xù)喂養(yǎng)8周的高脂飲食以建立高脂動(dòng)物模型。建模成功后，A組繼續(xù)飼喂普通飼料，每天灌胃0.2 mL/d的無菌水；陽性對(duì)照組（B組）每天飼喂高脂飼料，同時(shí)灌胃1.8 mg/d的奧利司他1次；模型組（C組）每天飼喂高脂飼料并灌胃與陽性對(duì)照組等量的生理鹽水1次；總黃酮高、中、低劑量組（D～F組）每天飼喂高脂飼料并分別按照100、50和20 mg/kg·d灌胃總黃酮水溶液1次。每只小鼠的灌胃量為0.2 mL/d，連續(xù)灌胃處理4周。

1.2.6.2 預(yù)防實(shí)驗(yàn) 32只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組（A組）：飼喂普通飼料，灌胃0.2 mL/d的無菌水；陽性對(duì)照組（B組）：飼喂高脂飼料，灌胃1.8 mg/d的奧利司他；模型組（C組）：飼喂高脂飼料，灌胃與陽性對(duì)照組等量的生理鹽水；總黃酮提取物處理組（D組）：飼喂高脂飼料，灌胃50 mg/（kg·d）的納豆總黃酮提取物。每組8只，連續(xù)灌胃處理喂養(yǎng)8周，每只小鼠的灌胃量為0.2 mL/d，每日灌胃1次。

1.2.7 總黃酮對(duì)小鼠體重及Lee’s指數(shù)影響 實(shí)驗(yàn)過程中每周測定小鼠的體重和體長（從鼻子到肛門），按照如下公式計(jì)算Lee’s指數(shù)：

1.2.8 總黃酮對(duì)小鼠肝脾指數(shù)影響 在眼球取血結(jié)束后，斷頸處死小鼠，迅速收集小鼠的肝臟和脾臟，并用濾紙吸去血漬，除去周圍的組織和脂肪后稱量其濕重。根據(jù)以下公式計(jì)算免疫器官的指數(shù)：

1.2.9 總黃酮對(duì)小鼠血清中血脂及炎癥因子影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12 h，期間自由飲水，采用摘眼球法取血，用不含內(nèi)毒素的1.5 mL離心管收集血液，1652 g離心10 min，取上清到新離心管中，-20 ℃的冰箱保存，待檢測時(shí)，提前將血清放入冰浴環(huán)境中解凍，使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TNF-α、HDL、IL-6、IL-10、TG和TC的含量，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用Origin 2018軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和作圖。通過ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。標(biāo)記小寫字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)，字母相同或部分相同或未標(biāo)記者表示差異不顯著(P＞0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆發(fā)酵產(chǎn)黃酮工藝的確定

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 如圖1A所示，納豆中總黃酮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在12～24 h這個(gè)階段，納豆中總黃酮含量逐漸升高，發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，納豆中總黃酮含量達(dá)到最高；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過24 h時(shí)，發(fā)酵底物的營養(yǎng)物質(zhì)可能不足以維持納豆菌的代謝，同時(shí)次級(jí)代謝產(chǎn)物過多，對(duì)初級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生抑制[16-18]，使得納豆中總黃酮含量逐漸降低。為此，選擇發(fā)酵時(shí)間為24、36和48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵溫度對(duì)納豆中總黃酮含量的影響如圖1B所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，納豆中的總黃酮含量不斷變化。而當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，納豆中總黃酮含量最高。因此，發(fā)酵溫度選擇為37 ℃。

如圖1C所示，接菌量對(duì)納豆發(fā)酵過程中總黃酮的產(chǎn)生具有一定影響。當(dāng)接菌量為5.75×1010CFU/100 g時(shí)，納豆的總黃酮含量較低，造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)榻泳刻?，?xì)菌生長速度緩慢，發(fā)酵過程不完全；當(dāng)接菌量為1.15×1011CFU/100 g時(shí)，納豆中總黃酮含量達(dá)到最大；接菌量大于1.15×1011CFU/100 g時(shí)，納豆中總黃酮含量隨接菌量增大而降低，此時(shí)細(xì)菌繁殖速度過快導(dǎo)致菜用大豆中營養(yǎng)成分迅速耗竭，從而導(dǎo)致納豆中總黃酮含量減少[16-18]。因此，接菌量選擇為5.75×1010、1.15×1011、1.73×1011CFU/100 g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從圖1D可以看出，當(dāng)后熟時(shí)間為12 h時(shí)，納豆的總黃酮含量最高，納豆的獨(dú)特氨味較少、黏度較低；當(dāng)后熟時(shí)間大于12 h時(shí)，納豆的氨臭味過大，納豆中總黃酮含量逐漸降低。因此，后熟時(shí)間選擇為6、12和18 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接菌量（C）和后熟時(shí)間（D）對(duì)納豆中總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time (A), fermentation temperature (B), inoculation dose (C) and ripening time (D)on the content of total flavonoids in natto

有研究表明，大豆產(chǎn)品經(jīng)微生物發(fā)酵后，可以實(shí)現(xiàn)一些次級(jí)代謝物的轉(zhuǎn)化，如大豆經(jīng)黑曲霉（A. nigerM46）發(fā)酵，其異黃酮化合物的組成發(fā)生了改變，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性[20]。Moktan等[21]研究也顯示，大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵以后，其總酚含量明顯增加，導(dǎo)致其抗氧化能力得到顯著提高。因此，本研究以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵后提高菜用大豆黃酮含量具有可行性。

2.1.2 正交試驗(yàn) 由表2、表3可知，3個(gè)因素對(duì)菜用大豆發(fā)酵納豆中總黃酮類物質(zhì)含量影響順序?yàn)锳＞B＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞接菌量＞后熟時(shí)間。A1B2C3是正交試驗(yàn)得出的納豆中總黃酮類物質(zhì)含量最高的發(fā)酵方案，即菜用大豆發(fā)酵時(shí)間24 h，接菌量1.15×1011CFU /100 g，后熟時(shí)間18 h，此發(fā)酵方案下納豆中的總黃酮類含量為4.35 mg/g（以菜用大豆計(jì)）；經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下納豆黃酮產(chǎn)量與A1B2C2（4.30 mg/g）條件下差異不顯著（P＞0.05），考慮到后熟時(shí)間18 h時(shí)間過長，選擇A1B2C2作為最優(yōu)發(fā)酵方案。

F檢驗(yàn)結(jié)果表明，各因素F值遠(yuǎn)小于F0.05（2，4），這說明三個(gè)因素的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響均不顯著，可以選擇上述實(shí)驗(yàn)方案作為最優(yōu)組合。

表2 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result for optimization of natto fermentation process

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of orthogonal experimental variance

2.2 總黃酮對(duì)小鼠體重及Lee’s指數(shù)的影響

圖2A為緩解實(shí)驗(yàn)中第0、8、12周小鼠體重變化情況。第8周末時(shí)，飼喂高脂飼料的小鼠體重顯著高于正常對(duì)照組（A）的體重（P＜0.05），表明高脂動(dòng)物模型建立成功。建模成功后再連續(xù)灌胃總黃酮4周，各組小鼠體重變化差異明顯，第12周末時(shí)，總黃酮各劑量處理組的小鼠體重顯著低于模型組（C）（P＜0.05）。

圖2B為預(yù)防實(shí)驗(yàn)中第0周、第4周、第8周小鼠體重變化情況。第4周末時(shí)，模型組（C）和正常對(duì)照組（A）小鼠的體重顯著高于灌胃奧利司他干預(yù)的陽性對(duì)照組（B）和總黃酮組（D）小鼠的體重（P＜0.05）；在第8周末時(shí)，模型組（C）小鼠體重顯著高于其他三組小鼠體重（P＜0.05），其中總黃酮組（D）小鼠的體重略低于正常對(duì)照組（A）。

如表4所示，緩解實(shí)驗(yàn)中各組小鼠在第12周末體長無顯著性差異（P＞0.05），C組小鼠Lee’s指數(shù)顯著高于其他五組（P＜0.05）?？傸S酮各劑量處理組小鼠的Lee’s指數(shù)與正常對(duì)照組（A）、陽性對(duì)照組（B）無顯著性差異（P＞0.05）。

預(yù)防實(shí)驗(yàn)中第8周末各組小鼠體長無顯著性差異（P＞0.05），C組小鼠Lee's指數(shù)顯著高于另外三組（P＜0.05），正常對(duì)照組（A）、陽性對(duì)照組（B）和總黃酮組（D）Lee's指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 緩解實(shí)驗(yàn)（A）和預(yù)防實(shí)驗(yàn)（B）各組小鼠體重變化Fig.2 Body weight change of mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

2.3 總黃酮對(duì)小鼠肝脾指數(shù)的影響

高脂飲食會(huì)損害肥胖動(dòng)物的肝臟，這主要是由于空泡樣變性、肝脂肪變性和肝纖維化所致[22]。脾臟是人體中最大的淋巴器官，能夠合成某些具有生物活性的物質(zhì)，同時(shí)也是發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的場所[23]。由表5可以看出，在緩解實(shí)驗(yàn)中，總黃酮處理的各組小鼠肝脾指數(shù)均顯著高于模型組（C）（P＜0.05）。在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，模型組（C）小鼠肝臟指數(shù)最低，各組小鼠脾臟指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

表4 各組小鼠體長及Lee’s指數(shù)Table 4 Body length and Lee’s index of mice in different groups

表5 緩解實(shí)驗(yàn)及預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組小鼠肝臟及脾臟系數(shù)Table 5 Liver and spleen coefficients of mice in alleviating experiment and prevention experiment

2.4 總黃酮對(duì)小鼠血清中血脂的影響

由圖3可知，在緩解實(shí)驗(yàn)中模型組（C）小鼠的血清中TG水平最高，顯著高于其他5組（P＜0.05），總黃酮處理的各組小鼠血清中TG水平與正常對(duì)照組（A）和陽性對(duì)照組（B）無顯著差異（P＞0.05）。預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果與緩解實(shí)驗(yàn)類似，模型組（C）小鼠血清中的TG水平顯著高于其他三組（P＜0.05），灌胃奧利司他和黃酮粗提物都顯著地降低了小鼠TG含量（P＜0.05）。

圖3 緩解實(shí)驗(yàn)（A）和預(yù)防實(shí)驗(yàn)（B）各組小鼠血清甘油三酯變化Fig.3 Changes of triglycerides in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

圖4 緩解實(shí)驗(yàn)（A）和預(yù)防實(shí)驗(yàn)（B）各組小鼠血清總膽固醇變化Fig.4 Changes of total cholesterol in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

由圖4A可知，緩解實(shí)驗(yàn)中模型組（C）小鼠血清中TC含量顯著高于其他五組（P＜0.05）；灌胃奧利司他處理的陽性對(duì)照組（B）小鼠血清中TC含量與總黃酮各劑量處理組沒有顯著性差異。如圖4B所示，預(yù)防實(shí)驗(yàn)中模型組（C）小鼠血清TC含量顯著高于其他三組（P＜0.05），正常對(duì)照組（A）的TC含量也顯著高于陽性對(duì)照組（B）和總黃酮組（D）（P＜0.05）。

由圖5可知，緩解實(shí)驗(yàn)中，灌胃總黃酮的三組小鼠血清中的HDL水平顯著高于其他三組（P＜0.05），其中總黃酮處理組小鼠血清中的HDL水平呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預(yù)防實(shí)驗(yàn)與緩解實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，同樣是模型組（C）小鼠血清中HDL水平最低，總黃酮組（D）HDL水平最高。Aloud等[24]研究顯示，高良姜黃素（一種天然黃酮類化合物）可以降低糖尿病大鼠血清中低密度脂蛋白（LDL）水平，并升高HDL含量，使得糖尿病大鼠的血脂水平恢復(fù)到正常水平，這與本研究所得到的結(jié)果一致。

圖5 緩解實(shí)驗(yàn)（A）和預(yù)防實(shí)驗(yàn)（B）各組小鼠高密度脂蛋白變化Fig.5 Changes of High density lipoprotein in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

圖6 緩解實(shí)驗(yàn)（A、C、E）和預(yù)防實(shí)驗(yàn)（B、D、F）各組小鼠血清炎性因子含量的變化Fig.6 Changes of proinflammatory factors in mice serum in alleviating experiment (A, C, E) and prevention experiment (B, D, F)

2.5 總黃酮對(duì)小鼠炎癥因子的影響

總黃酮提取物對(duì)高脂飲食小鼠炎癥因子產(chǎn)生的影響如圖6所示。高脂飲食會(huì)引起血清促炎因子IL-6、TNF-α含量提高（圖6A, B, E, F），而抗炎因子IL-10含量下降（圖6C, D）。緩解實(shí)驗(yàn)中總黃酮各劑量處理組促炎因子IL-6、TNF-α含量都明顯降低，沒有明顯的劑量依賴效應(yīng)。緩解實(shí)驗(yàn)中給予總黃酮處理的三組小鼠血清中IL-10含量顯著高于其他各組（P＜0.05）（圖6C），預(yù)防實(shí)驗(yàn)中總黃酮組（D）小鼠血清中IL-10含量顯著高于其他三組（P＜0.05）（圖6D）。IL-10具有抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的作用[25]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵菜用大豆產(chǎn)生的總黃酮提取物具有降血脂、抗炎的功效，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[26]。

本研究中，從納豆菌發(fā)酵菜用大豆中提取了總黃酮，其中含有多種成分，有研究顯示，總黃酮中的不同成分在降脂方面具有協(xié)同效應(yīng)[27]，本研究中也顯示出總黃酮的優(yōu)異效果。

3 結(jié)論

本研究利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵菜用大豆，優(yōu)化了總黃酮的發(fā)酵工藝，通過大孔樹脂純化，得到黃酮粗提物，其含量為4.30 mg/g菜用大豆。該黃酮粗提物可預(yù)防和緩解高脂飲食引起小鼠的血脂升高，降低血清中炎癥因子水平。本研究進(jìn)一步證實(shí)了利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵可以提高菜用大豆中黃酮類物質(zhì)的含量，這為通過生物發(fā)酵法提高菜用大豆的產(chǎn)品附加值提供了新思路。