蕎麥葉黃酮的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性

宋越冬，陳曉慶，張毓敏，張艷芳，王智怡，王 菲

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，山東淄博 255049）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench）又名烏麥、三角麥，即通俗意義上的甜蕎麥，屬廖科廖屬雙子葉一年生草本植物[1]，性喜冷涼，耐貧瘠，我國是蕎麥的原產(chǎn)地之一，種植面積達到70萬公頃，產(chǎn)量多年位居世界第二位[2]。因蕎麥籽粒含有黃酮、維生素、甾醇等[3-5]活性物質而具有抗菌消炎、降血糖、預防心腦血管疾病等功效[6-8]。但是蕎麥低產(chǎn)，廣種薄收，籽粒畝產(chǎn)不到100 kg，精耕細作產(chǎn)量也僅為200 kg，種植收益較低，影響了農(nóng)民的種植積極性。而據(jù)報道，蕎麥葉片含有諸如黃酮類等的生物活性物質，并且蕎麥葉中的黃酮含量遠高于蕎麥籽粒[9-10]，然而目前蕎麥葉卻沒有得到充分的利用，除少量用作飼料外，其余的大多丟棄，造成資源浪費。

目前，從植物中提取黃酮的研究報道較多，孫艷等[11]對從酸棗葉中提取的黃酮進行了研究，王樹寧等[12]優(yōu)化了從側柏葉提取黃酮的工藝，Wang等[13]對不同干燥方式下洋蔥黃酮的提取量和性質做了研究，Wang等[14]對桑葉黃酮提取及抗氧化性進行了系統(tǒng)研究，Li等[15]則對番石榴葉黃酮水提法進行了優(yōu)化，徐樹來等[16]則用超聲波法和微波法對蒲公英黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化；自諸多文獻可以看出，不同植物黃酮的性質和提取方式都有不同，甚至同一種植物的產(chǎn)地、采收期以及取樣部位都會影響到黃酮的提取量和性質，然而目前從蕎麥葉提取黃酮報道卻較少，蕎麥葉黃酮的抗氧化性尚未有報道，為了充分利用蕎麥葉這一資源，有必要對從其中提取黃酮進行研究，并對其抗氧化性能做分析，從而為更好地利用這一資源提供理論依據(jù)。

本研究以分枝期的蕎麥葉為研究對象，用超聲波乙醇提取法提取黃酮，以黃酮得率為目標，在單因素實驗基礎上，對影響黃酮提取效果較大的因素超聲時間、超聲溫度以及提取溶劑乙醇體積分數(shù)進行響應面優(yōu)化，建立二項式回歸模型，并對試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析，得到最佳提取條件，利用HPLC法檢測蕎麥葉黃酮的組分，并對蕎麥葉黃酮清除DPPH·、ABTS+·和·OH的能力進行測定，以期為蕎麥葉的綜合利用提供必要的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試的蕎麥葉片 采自山東省淄博市本地農(nóng)戶，種植的土地為沙壤土，種植土地沒有施用化肥與農(nóng)家肥，屬于接近野生狀態(tài)的廣種薄收種植類型，采樣時期為分枝期的成熟葉片；蘆丁標準品、槲皮素標準品（生物制品，BR，純度≥98%）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，BR，純度≥96%）、2,2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，BR，純度≥98%）、D101大孔吸附樹脂（BR，30～60目） 上海源葉生物制品有限公司；乙腈、甲酸（色譜純） 北京迪科馬科有限公司；其它試劑 均為分析純。

KQVDE-100型三頻數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲有限公司；V-2550型雙光束紫外分光光度計 日本島津；FD-1A-50型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，配有Waters 2489UV/vis 紫外檢測器 美國Waters公司；TGL-20M型高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機有限公司；RE-52C型旋轉蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；FW80型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；THE-98A 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕎麥葉粉的制備 蕎麥葉采收后，-40 ℃冷凍3 d，然后放置于-40 ℃低溫冷凍干燥機干燥24 h，干燥完全后樣品用高速萬能粉碎機（10000 r/min）瞬時粉碎成粉末，干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蕎麥葉黃酮的提取 準確稱取一定量的蕎麥葉粉，加入一定量的乙醇提取液，4 ℃浸提20 min后，在超聲頻率45 kHz、功率100 W條件下，超聲20 min，然后10000 r/min冷凍離心10 min（4 ℃），上清液用70%乙醇溶液定容到50 mL，棕色細口瓶4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實驗 在液料比60:1、乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率100 W、室溫（25 ℃）、超聲時間20 min條件下，設定超聲頻率分別45、80、100 kHz，按照1.2.5方法測定不同超聲頻率下蕎麥葉黃酮的提取量；在超聲頻率45 kHz、功率100 W、乙醇體積分數(shù)70%、室溫（25 ℃）、超聲時間20 min條件下，加入料液比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1(mL:g）的乙醇水溶液，按照1.2.5方法測定不同液料比下樣品黃酮的提取量；在超聲頻率45 kHz、功率100 W、液料比60:1、室溫（25 ℃）、超聲時間20 min條件下，加入體積分數(shù)分別為0、20%、30%、40%、50%、60%、70%、95%的乙醇提取液，按照1.2.5方法測定不同乙醇體積分數(shù)下樣品黃酮的提取量；在超聲頻率45 kHz、功率100 W、液料比60:1、乙醇體積分數(shù)70%、超聲時間20 min條件下，超聲溫度分別設定為20、30、40、50、60、70 ℃，按照1.2.5 方法測定不同超聲溫度下樣品黃酮的提取量；在超聲頻率45 kHz、功率100 W、液料比60:1、乙醇體積分數(shù)70%、室溫（25 ℃）條件下，設定超聲時間分別為5、10、20、30、40、50、60 min，按照1.2.5方法測定不同超聲時間下樣品黃酮的提取量。

1.2.4 響應面法試驗 根據(jù)單因素實驗結果，選取對蕎麥葉黃酮提取影響較大的三個因素：超聲溫度、超聲時間、提取液乙醇體積分數(shù)為Box -Behnken設計的自變量，以黃酮提取量為響應值，通過響應面分析對提取條件進行優(yōu)化。試驗因素及水平設計如表1所示。

1.2.5 蕎麥葉總黃酮提取量的測定 總黃酮的測定采用魏永生的硝酸鋁-亞硝酸鈉法[17]測定。準確稱取0.0185 g蘆丁標準品，用70%的乙醇溶液溶解并定容到100 mL，得濃度為0.185 mg/mL蘆丁標準溶液，在510 nm下按照文獻方法[17]測定各處理的吸光度值。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，做標準曲線，得到回歸方程為：y=9.4969x+0.0002（R2=0.999），在濃度0.0037～0.0555 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

取0.5 mL蕎麥葉提取液按照同樣方法測定樣品總黃酮濃度。蕎麥葉黃酮提取量（以蘆丁計）按照以下公式計算：

式中：C為測試液黃酮濃度，mg/mL；V為測試液總體積，mL；V0為提取液總體積，mL；m為樣品質量，g；V1為提取液取樣體積，mL。

1.2.6 液相色譜法分析蕎麥葉黃酮組分 蕎麥葉黃酮提取物在進行液相色譜分析之前要進行大孔樹脂純化，方法為：將活化并純化好的D101大孔樹脂放置到干凈的錐形瓶中，加入蕎麥葉黃酮提取液并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩吸附24 h，頻率為80 r/min，溫度為25 ℃，結束后用50%的乙醇溶液進行解析12 h，之后將解析液置于旋轉蒸發(fā)器中濃縮，并將濃縮液置于-40 ℃冷凍干燥機干燥24 h，得到干燥的蕎麥葉黃酮樣品[14]。在進行液相色譜測定之前，樣品用50%的乙醇溶解并通過0.22 μm的微孔過濾膜過濾。色譜條件參考文獻[15]的方法并稍作調整，具體為：Waters 2489UV/Vis 檢測器，Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色譜柱，溫度30 ℃，波長254 nm，流動相：0.3 %的甲酸水溶液（A），乙腈（B），洗脫梯度為：0～5 min，10%～25%B，5～10 min ，25%～30%B，10～15 min， 30%～20%B，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，保留時間為15 min。

1.2.7 蕎麥葉黃酮抗氧化能力 清除DPPH·測定采用文獻[18]方法，清除ABTS+·的測定采用Re 等[19]的方法，清除·OH方法采用鄰二氮菲法[20-21]。實驗時配制抗壞血酸溶液用做對照，并計算半抑制濃度（IC50）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復三次，實驗數(shù)據(jù)取均值；采用SPASS 19.0進行差異性分析，Origin 8.5作圖，Design Expert 8.0.6 做響應面設計并進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲頻率對蕎麥葉黃酮提取的影響 超聲頻率對蕎麥葉黃酮的提取有影響。由于實驗室條件限制，本次實驗只設定了45、80和100 kHz三個頻率，結果顯示三個頻率對應的蕎麥葉黃酮提取量分別為74.19、60.96、和47.41 mg/g；此結果說明超聲頻率越高，黃酮提取量越低。在超聲波法提取銀杏黃酮研究中發(fā)現(xiàn)，低頻超聲波較高頻超聲波更有利于有效成分的析出，20 kHz比40 kHz的黃酮提取量要高[22]，這跟本研究結論相似，這是因為高頻情況下，不利于液體的空化效應，所以不利于黃酮的析出[22]。然而徐艷麗等[23]報道，超聲頻率為70 kHz時的苦參種子黃酮的提取量要遠高于50、60 kHz的提取量，產(chǎn)生這種差異或許是因為樣品本身性質不同造成。鑒于實驗室的超聲波儀僅具有三個頻率波段，所以在后期的優(yōu)化實驗中未能將此因素作為優(yōu)化因素，后續(xù)實驗都采用45 kHz。

2.1.2 超聲時間對蕎麥葉黃酮提取的影響 從（圖1A）中可以看出，隨著超聲時間的增長，黃酮提取量增加，在超聲20 min時黃酮提取量較高，此后即使繼續(xù)增大提取時間，提取量變化不大，說明物料中的黃酮基本已經(jīng)溶解出來，再增加時間作用不大，所以提取時間設定為20 min較好。

2.1.3 液料比對蕎麥葉黃酮提取的影響 不同液料比對蕎麥葉粉黃酮提取影響如圖1B所示，隨著液料比的增加，黃酮提取量增加，當液料比超30:1之后，提取量雖有增大，但是增加量無顯著性差異（P＞0.05）；而在料液比增大到50:1后，黃酮提取量出現(xiàn)降低趨勢，這是因為隨著料液比的增加，樣品中的一些其它醇溶性物質的溶解速度增大，從而抑制了黃酮的溶出[24]。因此選定液料比為30:1。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對蕎麥葉黃酮提取的影響 提取液乙醇體積分數(shù)對蕎麥葉黃酮提取有一定作用（圖1C）。在乙醇體積分數(shù)較低時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，黃酮提取量增大，當乙醇體積分數(shù)增大到60%時，黃酮提取量達到最大，其后隨著乙醇體積分數(shù)的增加，黃酮提取量逐漸降低，95%時的黃酮提取量比60%降低近一半，這是因為在乙醇體積分數(shù)增大后，葉綠素、脂類等非極性物質溶出的比率增大，降低了黃酮的溶解所致[25]。雖然在乙醇體積分數(shù)為60%時的提取量最高，但是跟50%時沒有顯著性差異（P＞0.05），從能耗和成本方面考慮，選擇乙醇體積分數(shù)為50%。

2.1.5 超聲溫度對蕎麥葉黃酮提取的影響 溫度對蕎麥葉黃酮提取有影響（圖1D）。低溫有抑制黃酮溶出的作用，當溫度升到30 ℃時，提取量顯著增加（P＜0.05），但此后隨著溫度升高，提取量逐漸降低，溫度達到70 ℃時，提取量比30 ℃時降低近一半，這是因為黃酮含有羥基，溫度過高會影響其穩(wěn)定性，黃酮被氧化破壞[26]。因此選定超聲溫度為30 ℃。

圖1 提取因素對黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of extraction factors on extraction amout of flavonoids

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 二次響應面回歸模型方差分析及顯著性檢驗結果Table 3 ANOVA for quadratic response surface model and significance of difference

2.2 響應面試驗

2.2.1 模型擬合分析 通過三因素三水平的響應面設計方法設計，試驗結果如表2所示，對所得試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果如表3所示，用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結果回歸擬合，得到蕎麥葉總黃酮提取量對超聲時間（A）、乙醇體積分數(shù)（B）以及超聲溫度（C）的二次多項回歸方程為：

由表3可以得知，模型的F值為64.11，P＜0.0001，說明模型極顯著；失擬項P=0.065，影響不顯著，說明非試驗因素對試驗結果影響不大；回歸模型的決定系數(shù)R2=0.988,說明試驗中98.8%的數(shù)據(jù)是合理的；預測系數(shù)R2Pred=0.8416 和調整決定系數(shù)R2Adj=0.9726的差值小于0.2，說明模型其具有合理的一致性；變異系數(shù)0.74%小于1%，說明模型外因素對試驗結果影響較小，該模型可以用于擬合分析；精密度值20.7大于4，說明此模型具有合理性，可以用于蕎麥葉黃酮提取產(chǎn)量的預測[27]。

從表3可以看出，提取時間、乙醇體積分數(shù)和提取溫度都對蕎麥葉黃酮提取量的影響具有極顯著性（P＜0.01），其影響的主次順序為A（超聲時間）＞C（超聲溫度）＞B（乙醇體積分數(shù)）。

圖2 各因素交互作用對蕎麥葉黃酮提取量影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on extraction amout of flavonoids

2.2.2 交互作用分析 由表3可以看出，A（超聲時間）和C（超聲溫度）交互作用有極顯著性影響（P＜0.01），而 A（超聲時間）和 B（乙醇體積分數(shù)）、B（乙醇體積分數(shù)）和 C（超聲溫度）交互作用無顯著性影響（P＞0.05）。利用回歸模型作各因素之間的響應面圖和等高線如圖2所示。

不同因素之間交互作用對模型影響從等高線的形狀上能得到直觀反映，等高線呈現(xiàn)橢圓形顯示出兩因素交互作用顯著，反之形狀為圓形則說明交互作用不顯著。由圖2可以看出，超聲時間和超聲溫度交互作用呈現(xiàn)顯著性，而超聲溫度和乙醇體積分數(shù)、超聲時間和乙醇體積分數(shù)交互作用無顯著差異性，這與表3的結論相一致。

2.2.3 試驗驗證 根據(jù)響應面模型和結果分析，得到蕎麥葉黃酮最佳提取條件為：超聲時間21.743 min，提取液乙醇體積分數(shù)為51.673%，超聲溫度為28.40 ℃，此條件下蕎麥葉粉黃酮提取量為81.414 mg/g，根據(jù)實驗室實際情況，對驗證試驗條件調整為：超聲時間22 min，提取液乙醇體積分數(shù)為51%，超聲溫度為28 ℃。進行三次驗證試驗，黃酮的提取量均值為80.311 mg/g，與預測值81.414 mg/g接近，相對誤差為1.35%，說明該模型可以用于擬合分析。據(jù)孫艷華等[28]報道，其在用乙醇預處理常規(guī)方法提取蕎麥莖葉黃酮時候，需要先將粉碎后的樣品用15倍的30%乙醇浸泡6 h，之后再用15倍的95%的乙醇70 ℃下恒溫浸提1 h，得出蕎麥葉中約含有黃酮5.1%的黃酮，而本實驗的提取時間要比已有的報道更短，乙醇濃度低，提取溫度低；且蕎麥葉黃酮提取量為81.414 mg/g，明顯高于已有的報道，這表明響應面法優(yōu)化可以用于蕎麥葉黃酮提取實驗。

2.3 HPLC 圖譜分析

蕎麥葉黃酮HPLC分析圖譜如圖3所示，從圖3中可以看出，蕎麥葉黃酮的主要成分是蘆丁和槲皮素，根據(jù)峰面積積分得到其相對含量分別為66.5%和13.9%，出峰時間分別為6.13和8.05 min，跟標準樣品出樣時間基本吻合，還有3個含量很少的組分，分別為圖3樣品圖中的3、4、5號峰，出峰時間分別為4.73、7.18和11.2 min，因含量太低，未做具體組分和含量分析。

2.4 蕎麥葉黃酮體外抗氧化能力

2.4.1 蕎麥葉黃酮清除DPPH·能力 由圖4A可知，蕎麥葉黃酮具有清除DPPH·的能力。在濃度為0～0.020 mg/mL之間，蕎麥葉黃酮和VC對DPPH·清除率呈線性增加，在濃度為0.025 mg/mL時，清除率已達98.29%，而VC在濃度為0.020 mg/mL時清除率已達100%，說明蕎麥葉黃酮的的清除能力弱于VC；在濃度0～0.016 mg/mL之間，蕎麥葉黃酮濃度（X）與清除率（Y）的回歸方程為y=3486x+7.383，R2=0.9984，VC濃度（X）與清除率（Y）的回歸方程為y=5647x+2.806，R2=0.9972。蕎麥葉黃酮和VC對DPPH·清除作用的IC50分別為0.012 和0.008 mg/mL。

2.4.2 蕎麥葉黃酮清除ABTS+·能力 蕎麥葉黃酮對ABTS+·自由基清除有明顯作用（圖4B）。在濃度0～0.080 mg/mL之間，蕎麥葉黃酮和VC對ABTS+·的清除能力都呈線性增加，當濃度為0.080 mg/mL時，二者的清除率都達到了96%之上，說明反應體系中的自由基已經(jīng)基本被清除。在濃度0～0.080 mg/mL之間，蕎麥葉黃酮濃度（X）和清除率（Y）的回歸方程為y=1306.5x-8.0193，R2=0.9949，VC濃度（X）與清除率（Y）回歸方程為Y=1200.4x+3.7953，R2=0.9909；蕎麥葉黃酮和VC對ABTS+·清除作用的IC50分別為0.044和0.039 mg/mL。

圖3 蕎麥葉黃酮液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Fagopyrum esculentum Moench leaves flavonoids

2.4.3 蕎麥葉黃酮清除·OH的能力 由圖4C可知，蕎麥葉黃酮對·OH清除作用明顯高于VC。蕎麥葉黃酮濃度在0～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，對·OH的清除能力呈線性增加趨勢，而VC在濃度低于0.5 mg/mL時，其清除率無法檢測到；在蕎麥葉黃酮濃度0～0.8 mg/mL之間，黃酮濃度（X）和清除率（Y）回歸方程為y=119.37x+8.9517，R2=0.9727；在VC濃度為0.5～4 mg/mL 之間時，VC濃度（X）和清除率（Y）回歸方程為y=25.142x-11.113，R2=0.9835；蕎麥葉黃酮和VC對·OH清除能力IC50分別為0.344 和2.431 mg/mL。蕎麥葉黃酮清除·OH高于VC的能力，這跟單科開等[29]對苦菜黃酮的研究結論相似。

圖4 蕎麥葉黃酮對DPPH·、ABTS+·和·OH清除能力Fig.4 Scavenging effect of Fagopyrum esculentum Moench leaves flavonoids on DPPH·(A), ABTS+·(B) and·OH (C)

3 結論

在單因素實驗基礎上，通過響應面試驗得到蕎麥葉黃酮的最佳提取工藝條件為：超聲時間22 min，提取液乙醇體積分數(shù)51%，超聲溫度28 ℃，在此條件下蕎麥葉黃酮的提取量為80.311 mg/g，與預測值理論值接近；HPLC檢測顯示蕎麥葉黃酮以蘆丁為主，其次是槲皮素；蕎麥葉黃酮抗氧化性實驗顯示，蕎麥葉黃酮對DPPH·、ABTS+·和·OH都有清除作用，顯示其具有較好的抗氧化性。本實驗顯示蕎麥葉可以作為黃酮提取的原料來源，從而為蕎麥葉的綜合利用提供了必要的理論依據(jù)。