外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸微生物群落組成變化的影響

陳援援，于德陽(yáng)，秦建鵬，馬儷珍

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

風(fēng)干腸是在適宜的條件下進(jìn)行風(fēng)干成熟而制成的一類自然發(fā)酵肉制品，因?yàn)樵陲L(fēng)干過程中水分活度和pH逐漸降低，加之優(yōu)勢(shì)微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用，所以能抑制產(chǎn)品中有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，使產(chǎn)品具有營(yíng)養(yǎng)豐富、色澤美觀、風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長(zhǎng)等特點(diǎn)，深受北方消費(fèi)者的青睞[1-3]。

目前，我國(guó)風(fēng)干腸的生產(chǎn)仍然存在一些不容小覷的問題，如傳統(tǒng)風(fēng)干腸的加工是采用自然發(fā)酵方式，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，微生物來源復(fù)雜，易受微生物污染而腐敗變質(zhì)，使產(chǎn)品質(zhì)量不能得到很好的控制，而工業(yè)化生產(chǎn)為了提高風(fēng)干腸的生產(chǎn)效率，使用快速風(fēng)干成熟法，使風(fēng)干腸失去了原有的獨(dú)特發(fā)酵風(fēng)味[4-5]。因此使用天然抑菌劑，研究風(fēng)干腸在自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化及微生物群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)于實(shí)現(xiàn)風(fēng)干腸發(fā)酵過程的人工控制和工業(yè)化生產(chǎn)，提高其安全品質(zhì)具有重要意義[6-8]。風(fēng)干腸中的主要微生物有細(xì)菌、霉菌和酵母[9]。Hu等[10]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)東北5個(gè)不同地區(qū)的風(fēng)干香腸的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：硬壁菌和蛋白菌是優(yōu)勢(shì)菌門，乳酸桿菌、葡萄球菌、明串珠菌、乳球菌和魏氏菌是優(yōu)勢(shì)菌屬，木糖葡萄球菌、清酒乳酸桿菌、希臘魏氏菌、檸檬明串珠菌、棉子糖乳球菌和植物乳桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種。Chen等[11]研究表明乳酸桿菌和葡萄球菌是影響哈爾濱干香腸品質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌。本實(shí)驗(yàn)室前期將已優(yōu)選的復(fù)合抗氧化劑（Compound antioxidants,CA）、復(fù)合香辛料（Compound spice，CS）、發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（Fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）及其組合應(yīng)用到風(fēng)干腸的加工中，研究了其對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味、生物胺、N-亞硝胺以及脂肪氧化等相關(guān)理化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)這些外源抑制物有一定的提高產(chǎn)品風(fēng)味和安全品質(zhì)的作用[12-14]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究這些外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸在風(fēng)干過程中的細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)、腸桿菌科菌數(shù)的變化，并通過16S rDNA高通量測(cè)序分析等儀器手段，分析風(fēng)干終點(diǎn)（12 d）產(chǎn)品的微生物群落組成變化，比較幾種外源抑制物對(duì)風(fēng)干腸微生物安全性的影響，以期為風(fēng)干腸的加工工藝提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬后腿肉（冷卻肉）、豬肥膘 天津市康寧肉制品有限公司；食鹽、白沙糖、曲酒、味精、醬油、葡萄糖、木糖 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；冷凍牛骨肉末（骨肉比為3:7） 天津掛月食品有限公司；胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油 頂興（天津）食品科技發(fā)展有限公司；茶多酚、迷迭香 豫中生物科技有限公司；VE、Vc、VB1蘇州佰億鑫生物科技有限公司；VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌） 意大利薩科公司；風(fēng)味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g）、復(fù)合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；L-半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸 冀州市華陽(yáng)化工有限責(zé)任公司；人工膠原蛋白腸衣（牛二層皮提取、孔徑30 mm） 神冠控股（集團(tuán)）有限公司（以上材料均為食品級(jí)）；MRS培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY有限公司；CLIMACELL恒溫恒濕箱、Friocell 22恒溫恒濕培養(yǎng)箱 艾力特國(guó)際貿(mào)易有限公司；BVBJ-30F真空攪拌機(jī) 浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；XZ-5L灌腸機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；CLASSⅡ生物安全柜 天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 風(fēng)干腸的制作 參照李木子等[15]的方法。

1.2.2 幾組外源抑制物的配制方法

1.2.2.1 CA的配比 按照熊鳳嬌等[12]的研究結(jié)果，以每組的總?cè)饬坑?jì)，依次添加茶多酚60.14 mg/kg、迷迭香60.11 mg/kg、VE60.00 mg/kg和抗壞血酸鈉60.00 mg/kg。

1.2.2.2 CS的配比 按照陳文靜等[16]的研究結(jié)果，以每組的總?cè)饬坑?jì)，依次添加胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油的含量分別為2.08、3.12、3.69、2.83、0.22 mL/kg。

1.2.2.3 FBF的制備 參照樊曉盼等[17]的方法。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 按照1.2.1風(fēng)干腸的制作方法制作出6組風(fēng)干腸，CK（Control group，CK）組作為空白對(duì)照組，風(fēng)干腸的原輔料配比同1.2.1，其它5組風(fēng)干腸均是在CK組的基礎(chǔ)上添加不同種類的外源抑制物，其中CA和CS分別按照1.2.2.1和1.2.2.2的比例添加，F(xiàn)BF按照原料肉重的2%比例添加。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1所示。各組分別在風(fēng)干成熟過程的第1、3、6、9、12 d取樣，進(jìn)行菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、腸桿菌科菌數(shù)的測(cè)定；取6組風(fēng)干腸成品（風(fēng)干成熟第12 d）進(jìn)行微生物多樣性分析。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Scheme of experiment design

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 乳酸菌總數(shù) 按GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[18]6.2.3.4乳桿菌計(jì)數(shù)方法執(zhí)行。

1.3.2 菌落總數(shù) 按GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[19]方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 腸桿菌科總數(shù) 按GB 4789.41-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科檢驗(yàn)》[20]執(zhí)行。

1.3.4 微生物多樣性分析 將6組風(fēng)干腸成品送到北京奧維森基因科技有限公司，采用擴(kuò)增子測(cè)序方法分析樣品16S rDNA的V3-4區(qū)段、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析[21]，擴(kuò)增區(qū)段引物序列為：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA，GTGGAC TACHVGGGTWTCTAAT。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，Origin 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 6組風(fēng)干腸在風(fēng)干過程中乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)和腸桿菌科菌數(shù)的變化

6組風(fēng)干腸在風(fēng)干過程中乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)和腸桿菌科菌數(shù)的變化見圖1所示。由圖1可以看出，各組樣品的乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)和腸桿菌科菌數(shù)變化趨勢(shì)基本一致，在風(fēng)干前6 d呈升高趨勢(shì)隨后緩慢下降，此變化與韋友兵[22]研究薩拉米發(fā)酵成熟過程中微生物菌群變化趨勢(shì)基本一致。各組的乳酸菌數(shù)由風(fēng)干第1 d的6.00～6.28 lg CFU/g升高到第6 d的8.64～9.18 lg CFU/g再到第12 d的7.33～8.41 lg CFU/g（見圖1A）。菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)，風(fēng)干第1 d為5.70～6.12 lg CFU/g，風(fēng)干第6 d達(dá)到最大值8.09～8.84 lg CFU/g，然后緩慢降低到風(fēng)干12 d為7.44～8.33 lg CFU/g（見圖1B），腸桿菌科菌數(shù)在風(fēng)干第6 d達(dá)到最大6.90～8.47 lg CFU/g，風(fēng)干結(jié)束時(shí)降低到5.40～6.79 lg CFU/g（見圖1C）。各組風(fēng)干腸之間在風(fēng)干過程中的菌數(shù)未呈現(xiàn)規(guī)律性變化，比較6組風(fēng)干腸之間在風(fēng)干第12 d的菌數(shù)變化，乳酸菌數(shù)從高到低依次為：CK＞FBF≈CS≈CA＞CSA＞FBFA，菌落總數(shù)從高到低依次為：CK＞FBF＞CS＞CA＞CSA＞FBFA，腸桿菌科菌數(shù)從高到低依次為：CK＞CA＞CS＞CSA＞FBFA＞FBF。由此可以看出，添加了外源抑制物的5組試驗(yàn)組的各種菌數(shù)均顯著低于CK組（P＜0.05），特別是FBF組的腸桿菌科數(shù)明顯降低，F(xiàn)BFA組的菌落總數(shù)為組內(nèi)最低，說明添加FBF和FBFA對(duì)有害微生物有較好的抑制作用。吳晨燕等[23]研究FBF對(duì)大腸桿菌的抑菌作用及機(jī)理，通過掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率了解胞膜通透性時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BF會(huì)破壞細(xì)胞的正常形態(tài)，使菌體表面出現(xiàn)褶皺、孔洞，影響菌體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常傳遞和運(yùn)輸，從而抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，這對(duì)于控制風(fēng)干腸的安全性有利，因?yàn)槟c桿菌科細(xì)菌屬于條件致病菌[24]。但是，仔細(xì)觀察FBF組、FBFA組和CSA組的腸桿菌科數(shù)仍高達(dá)5.40～5.54 lgCFU/g，瑞士對(duì)發(fā)酵成熟的生香腸中的腸桿菌科限量值為100 CFU/g[25]。雖然目前我國(guó)對(duì)發(fā)酵成熟的生香腸中的腸桿菌科數(shù)沒有限量標(biāo)準(zhǔn)，但為了提高風(fēng)干腸的品質(zhì)和安全性，考慮在后期研究中應(yīng)采用人工接種乳酸菌和天然抗氧化劑，利用優(yōu)勢(shì)菌群等溫和的柵欄技術(shù)來控制雜菌的繁殖。

圖1 不同外源抑制物組風(fēng)干腸在風(fēng)干過程中乳酸菌總數(shù)、菌落總數(shù)和腸桿科菌數(shù)的變化Fig.1 Changes of total number of lactic acid bacteria, total number of colonies and the number of Enterobacteriaceae in airdried sausages with different exogenous inhibitors

2.2 6組風(fēng)干腸成品的微生物多樣性指數(shù)分析

利用Alpha多樣性指數(shù)goods_coverage、chao1、observed species及shannon可進(jìn)行樣品微生物物種豐富度和多樣性評(píng)估[26]。6組風(fēng)干腸成品的Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表2所示。由表2可知，6組風(fēng)干腸成品的測(cè)序覆蓋率goods_coverage在99%以上，說明風(fēng)干腸中未被測(cè)到的序列概率很低。CK組的chao1和observed_species指數(shù)高于5個(gè)試驗(yàn)組，因?yàn)橥庠匆种莆锏囊志煞帜軌蚱鸬揭欢ǖ囊志饔?，所以添加了外源抑制物的CA、CS、FBF、FBFA、CSA組的菌群豐度均低于CK組。另外，F(xiàn)BFA組的chao1和observed_species指數(shù)達(dá)到了組內(nèi)最低，且shannon指數(shù)低于FBF組，說明物種多樣性最低，且FBF與CA復(fù)配的抑菌效果優(yōu)于FBF單獨(dú)使用。

表2 6組風(fēng)干腸成品的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of 6 groups of air-dried sausages products

2.3 基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

圖2為6組風(fēng)干腸成品在門水平上最大豐度排名前5的物種相對(duì)豐度所占比例。由圖2可知，6組風(fēng)干腸成品的微生物群落主要由5個(gè)門組成，分別為：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），各組基于門水平的微生物群落主要是由厚壁菌門和變形菌門組成，占比達(dá)到96%以上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CSA組、FBF組和FBFA組厚壁菌門所占的比例最大，分別為74.87%、74.51%、68.89%，變形菌門其次，分別為23.82%、22.99%、29.51%；相反，CK組、CA組、CS組變形菌門比例最高分別為60.34%、59.33%、71.64%，其次是厚壁菌門，占比分別為38.14%、39.25%、27.03%。

圖2 6組風(fēng)干腸成品基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度Fig.2 Composition and relative abundance of microbial community structure based on phylum level in 6 groups of air-dried sausages products

2.4 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

6組風(fēng)干腸成品基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度分析結(jié)果見圖3所示。由圖3可以看出，除CSA組含有19個(gè)屬水平的微生物群落組成，相對(duì)豐度為98.91%外，CK組、CA組、CS組、FBF組、FBFA組均包含20個(gè)屬，相對(duì)豐度分別為99.19%、99.54%、99.17%、98.92%和99.21%，6組風(fēng)干腸樣品在屬水平的群落結(jié)構(gòu)組成基本一致，均以變形桿菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、腸球菌屬占主要部分，但相對(duì)豐度差異較大，CK、CA、CS組的優(yōu)勢(shì)菌屬為變形桿菌屬，其相對(duì)豐度分別為50.89%、55.33%、60.97%，其次為乳球菌屬和葡萄球菌屬；而CSA、FBF、FBFA組的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳球菌屬，其相對(duì)豐度分別為49.57%、47.46%、40.09%，其次從高到低依次為變形桿菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬。6組風(fēng)干腸樣品中乳酸桿菌屬在FBF組中的相對(duì)豐度最大（9.08%），F(xiàn)BFA次之（5.24%），腸球菌屬在CK組中的相對(duì)豐度最高（5.42%）。由此可以看出，外源抑制物CA、CS、CSA、FBF、FBFA均能影響風(fēng)干腸中微生物群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度，值得關(guān)注的是，CSA組、FBF組和FBFA組的乳球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，說明這三組更有益于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。在發(fā)酵肉制品加工中，常接種乳酸菌發(fā)酵劑來形成產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味[27]，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)保質(zhì)期[28]，在一定程度上提高了產(chǎn)品的安全性[29-30]。研究表明，乳酸菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)和抗氧化產(chǎn)物[31-32]，如Nisin細(xì)菌素[33]、乳酸乙酸等有機(jī)酸、過氧化氫、乙醇、乙醛、丁二酮等[34]。此外，大部分葡萄球菌對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味的形成具有明顯的促進(jìn)作用，因?yàn)樗鼈兙哂械鞍缀椭舅饷富钚?，能?duì)蛋氨酸、苯丙氨酸和一些支鏈氨基酸進(jìn)行降解生成醛、醇和酸等前體風(fēng)味物質(zhì)[35-36]。本試驗(yàn)的6組樣品中葡萄球菌屬豐度的大小關(guān)系為FBFA＞CA＞CSA＞FBF＞CK＞CS，這說明將FBF與CA復(fù)配添加到風(fēng)干腸中能提高產(chǎn)品中葡萄球菌屬的相對(duì)豐度。

圖3 6組風(fēng)干腸成品基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度Fig.3 Composition and relative abundance of microbial community structure based on genus level in 6 groups of air-dried sausages products

3 結(jié)論

隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，6組風(fēng)干腸樣品中的微生物數(shù)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，F(xiàn)BFA能有效的控制成熟風(fēng)干腸的乳酸菌和菌落總數(shù)，F(xiàn)BF對(duì)腸桿菌科的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。微生物多樣性分析表明，變形桿菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬和腸球菌屬是風(fēng)干腸中的主要微生物菌群，其中添加外源抑制物CSA、FBF、FBFA的風(fēng)干腸有利于乳球菌屬微生物的生長(zhǎng)。因此，實(shí)驗(yàn)中篩選出的FBF、FBFA適合作為傳統(tǒng)風(fēng)干腸的天然抑菌劑，在一定程度上提高了風(fēng)干腸的食用安全性，為傳統(tǒng)風(fēng)干腸天然抑菌劑研制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)于該抑菌劑在其他傳發(fā)酵肉制品中的應(yīng)用及與其他菌種結(jié)合開發(fā)復(fù)配抑菌劑還需進(jìn)一步研究。