致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離鑒定及三重PCR檢測(cè)方法的建立

張楠馳，茍小蘭，王 利

（西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）屬于腸桿菌科、耶爾森氏菌屬[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種人畜共患病原菌，也是一種重要的食源性致病菌，很多國(guó)家都已將該菌列為進(jìn)出口食品的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目[2]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可導(dǎo)致人和動(dòng)物患急性腹瀉、腦膜炎、心肌炎等臨床疾病，極易感染免疫力低下的初生動(dòng)物和嬰兒，對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體健康造成一定的威脅[3-4]。該菌具有廣泛的宿主性，傳播范圍廣、感染頻率高，可感染家畜、家禽、鳥(niǎo)類及昆蟲(chóng)等[5]。該菌廣泛分布于自然界，在水、土壤、動(dòng)物以及食物中均可被檢測(cè)出，可通過(guò)人、動(dòng)物、食物、水源等介質(zhì)進(jìn)行傳播，也是少數(shù)能在冷藏溫度下生長(zhǎng)的腸道致病菌之一[4,6-8]。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可能含有ystA、ystB、yadA和virF等多個(gè)毒力基因[9]。檢測(cè)位于染色體上的黏附侵襲位點(diǎn)基因ail可鑒定食品中致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，該方法被ISO/TS18867:2015等標(biāo)準(zhǔn)所采用[9]。intB基因是耶爾森氏菌屬所攜帶的耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島（High-pathogenicity island，HPI）毒力基因中的一段基因，耶爾森氏菌侵襲蛋白（Invasin，inv）在致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌中表達(dá)[10]。因此同時(shí)檢測(cè)ail、intB和inv基因可鑒定樣品中是否含有致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

我國(guó)目前檢測(cè)動(dòng)物和食品中致病菌的方法主要是傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法，雖然結(jié)果較為可靠，但具有檢測(cè)速度慢、程序復(fù)雜和成本高等缺點(diǎn)。因此，需要建立一種快速、準(zhǔn)確、有效地檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法?？焖贆z測(cè)細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)主要是擴(kuò)增細(xì)菌的一條特異性基因，而不同細(xì)菌間16S rDNA基因、23S rDNA基因序列具有一定同源性，這將對(duì)該檢測(cè)方法的特異性產(chǎn)生一定的影響[11-12]。多重PCR技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有更高的特異性，被應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)和基因分型鑒定等方面，在細(xì)菌快速檢測(cè)方面也有著重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景[13-14]。本實(shí)驗(yàn)室從病鯽魚(yú)心臟中鑒定出菌株fsznc-10，設(shè)計(jì)并建立一種可以快速、準(zhǔn)確、有效的鑒定該菌的多重PCR方法，以期為防治和檢測(cè)由該菌引起的人和動(dòng)物共患疾病的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

患病魚(yú) 來(lái)源于四川省某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的一批腹部輕微出血、腫脹、肛門(mén)紅腫的鯽魚(yú)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CIN-1培養(yǎng)基及配套試劑、改良Y培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；PremixTaq（TaKaRa Taq Ver.2.0 plus dye）、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品（DL2000 Marker） 大連寶生生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物有限公司；細(xì)菌生化鑒定管 杭州微生物試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色試劑盒 北京雷根生物技術(shù)有限公司；假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、門(mén)多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗勞地枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）、中間氣單胞菌（Aeromonas media）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）和無(wú)丙二酸枸櫞酸桿菌（Citrobacter amalonaticus） 均保藏于西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；85條健康成年鯽魚(yú)（516.05±20.04 g） 購(gòu)自成都某市場(chǎng)。

ESJ200-4電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 四川新科儀器有限公司；SteriLGARD IIIADVANCE生物安全柜 Baker公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DHG-9203A高溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度計(jì) 上海昕瑞儀器儀表有限公司；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；13395H2X生物顯微鏡 Leica公司；KW-1000DC恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；S1000 Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀、GEL DOC2000凝膠成像系統(tǒng) 伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病料及處理 接種環(huán)無(wú)菌處理后，在病魚(yú)心臟取樣并接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h觀察。

1.2.2 菌株分離和生理生化鑒定 挑取1.2.1中外觀一致的單菌落，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h。采用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌菌體進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察其顏色和形狀。采用細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行生化鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《魚(yú)類及其他水生動(dòng)物細(xì)菌實(shí)用鑒定指南》[15]。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取及16S rDNA序列分析

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取分離細(xì)菌總DNA。采用本實(shí)驗(yàn)室使用的16S rDNA通用引物（F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' /R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'），以提取的分離菌DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收后由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接。將分離菌命名為fsznc-10，拼接后的16S rDNA序列提交至GenBank獲取登錄號(hào)，并在GenBank上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，選取相似度較高的細(xì)菌16S rDNA基因序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 分離菌毒力基因擴(kuò)增 采用文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)的ail、ystB、virF、yadA、intB5對(duì)毒力基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的菌株fsznc-10 DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 分離菌藥敏試驗(yàn) 采用KB紙片擴(kuò)散法，培養(yǎng)后的菌液用細(xì)菌濁度儀測(cè)量細(xì)菌濃度后無(wú)菌水調(diào)至到0.5麥?zhǔn)希?00 μL涂布于Mueller-Hinton Agar培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)18 h后測(cè)量結(jié)果。藥物藥敏紙片規(guī)格及敏感程度判斷標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參照第28版CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 分離菌致病性能驗(yàn)證 將分離菌分別制備成濃度為3×103～3×108CFU/mL的菌懸液作為試驗(yàn)組，10倍等比稀釋，共6個(gè)濃度梯度。選取60尾健康鯽魚(yú)，每濃度梯度10尾，分別腹腔注射0.1 mL菌懸液，另選取10尾健康鯽魚(yú)腹腔注射0.1 mL生理鹽水作對(duì)照，飼養(yǎng)7 d觀察發(fā)病和死亡情況，參照文獻(xiàn)[16]計(jì)算分離菌的半數(shù)致死量（LD50）。致病菌的再次分離采用改良Y選擇性培養(yǎng)基。

1.2.7 特異性引物設(shè)計(jì)及三重PCR擴(kuò)增 利用表1中ail和intB毒力基因引物，并根據(jù)GenBank公布的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌inv毒力基因設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物（詳見(jiàn)表1）建立檢測(cè)分離菌（小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌）的三重PCR方法。取1.2.3中提取的fsznc-10細(xì)菌基因組DNA作為模板，用表1中的ail、intB和inv三對(duì)引物分別擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL，PremixTaq12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O9.5 μL。單重PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s、（45～64 ℃）45 s、72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，確定三對(duì)引物的共同最佳退火溫度。三對(duì)引物按照1:1:1的比例進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，通過(guò)觀察目的條帶的亮度，調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)引物對(duì)的添加比例，以優(yōu)化各引物在三重PCR總反應(yīng)體系中的濃度。三重PCR退火溫度在45～64 ℃范圍的16個(gè)溫度梯度進(jìn)行篩選，以確定三重PCR的最佳退火溫度。PCR均采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.8 特異性和敏感性試驗(yàn) 采用細(xì)菌基因組DNA提取1.1中保存的各菌種的基因組作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的特異性。測(cè)定菌株fsznc-10基因組DNA濃度后，用無(wú)菌去離子水對(duì)DNA樣品進(jìn)行10倍倍比稀釋（100～109倍）后作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。

1.2.9 三重PCR檢測(cè)法的臨床應(yīng)用 隨機(jī)選擇15個(gè)1.2.1中采集的發(fā)病和死亡鯽魚(yú)的心臟組織樣品，勻漿后進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，采用本研究建立的三重PCR擴(kuò)增，同時(shí)利用CIN-1培養(yǎng)基和改良Y培養(yǎng)基對(duì)各心臟組織中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行16S rDNA序列分析，比較檢測(cè)結(jié)果。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌毒力基因引物序列Table 1 Primers of the virulence genes in the Y. enterocolitic strains

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增圖譜均有BioradChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)生，后由Adobe Photoshop 13.0處理。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖片由Mega 5.0軟件構(gòu)建，Adobe Photoshop 13.0處理。菌株生化鑒定和耐藥表型試驗(yàn)均為三個(gè)重復(fù)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌形態(tài)學(xué)和理化特性鑒定

將分離菌fsznc-10在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，菌落呈現(xiàn)為圓形，直徑1.0～3.2 mm，乳白色隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)。經(jīng)革蘭氏染色后，菌株為革蘭氏陰性短桿菌，多單個(gè)散在分布或排列成堆。分離菌fsznc-10的主要生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株具有動(dòng)力性，V-P試驗(yàn)、β-半乳糖苷酶、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，不利用枸椽酸鹽，不分解蔗糖、葡萄糖，不發(fā)酵鼠李糖、棉籽糖，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，不產(chǎn)H2S，部分菌株分解肌醇、七葉苷。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]和《魚(yú)類及其他水生動(dòng)物細(xì)菌實(shí)用鑒定指南》[15]，基本符合小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生化特性。

2.2 分離菌16S rDNA序列分析

分離菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示其片段約為1500 bp（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株16S rDNA片段長(zhǎng)度為1424 bp。將分離菌株16S rDNA基因序列提交到GenBank中獲得登錄號(hào)MN416303。16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，菌株fsznc-10與Yersinia enterocoliticaGM2402聚為一支（圖2），置信度為100。結(jié)合分離菌株形態(tài)學(xué)和理化特性，綜合判定菌株fsznc-10為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）。

圖1 分離菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA gene of the isolate strain

2.3 分離菌毒力基因擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)分離菌株毒力基因結(jié)果顯示，菌株fsznc-10擴(kuò)增出長(zhǎng)度分別約為351、200、561和714 bp的條帶（圖3）。表明菌株fsznc-10攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因。

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)

菌株fsznc-10對(duì)諾氟沙星、慶大霉素、多粘菌素B、阿米卡星和鏈霉素敏感，對(duì)頭孢曲松和復(fù)方新諾明中度敏感，對(duì)氨芐青霉素、呋喃唑酮和頭孢噻吩耐藥（表2）。表明可采用諾氟沙星、慶大霉素、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素防治由小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌引起的鯽魚(yú)疾病。

圖2 菌株fsznc-10 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain fsznc-10 16S rDNA gene sequence

2.5 分離菌致病性能驗(yàn)證

經(jīng)腹部注射最高濃度（3 × 108CFU/mL）分離菌株的鯽魚(yú)，1 d后出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍的癥狀，部分病魚(yú)魚(yú)鰭基部、上下顎、眼球等部位略有出血點(diǎn)，約36 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，72 h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組未見(jiàn)異?；蛩劳鲷~(yú)。參照文獻(xiàn)[16]計(jì)算得出菌株fsznc-10的LD50為7.54×104CFU，表明菌株fsznc-10對(duì)鯽魚(yú)具有較強(qiáng)的致病性。從感染死魚(yú)的心臟中分離出的細(xì)菌在改良Y平板上呈現(xiàn)粉紅色、向上隆起、表面濕潤(rùn)的特征菌落，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

圖3 毒力基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of virulence gene

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of antibiotic sensitivity test

2.6 單一PCR和三重PCR擴(kuò)增

3對(duì)毒力基因的單一PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出了約300、500和700 bp的目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示各基因片段大小均與預(yù)期結(jié)果基本一致（圖4）。經(jīng)優(yōu)化，確定三重PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：Premix Taq 12.5 μL，ail上下游引物各1.5 μL，inv上下游引物各1.0 μL，intB上下游引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 4.5 μL，總體系為25 μL。三重PCR最優(yōu)反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。三重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，出現(xiàn)三條清晰條帶，且無(wú)其他雜帶，三對(duì)引物之間無(wú)干擾，擴(kuò)增準(zhǔn)確。

圖4 單一PCR與多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Results of single PCR and multiplex PCR amplifications

2.7 特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅fsznc-10三重PCR擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)3條清晰目的條帶，片段大小分別約為351、520和714 bp，其他菌株均未擴(kuò)增出三條目的條帶（圖5），表明所建立的三重PCR方法特異性較強(qiáng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），菌株fsznc-10 DNA模板稀釋前的濃度為170.40 ng/μL，所建立的多重PCR檢測(cè)法檢測(cè)fsznc-10的最低模板濃度為1.704 × 10-6ng/μL，表明該方法敏感性較高。

圖5 三重PCR的特異性檢測(cè)Fig.5 Specificity detection of triple PCR

圖6 三重PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of triple PCR

圖7 臨床樣品三重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Triple PCR results of clinical samples

2.8 三重PCR檢測(cè)法的臨床應(yīng)用

采用本試驗(yàn)建立的三重PCR方法對(duì)15個(gè)發(fā)病鯽魚(yú)心臟組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示13個(gè)樣品呈陽(yáng)性（圖7），陽(yáng)性檢測(cè)率約為86.67%。另外，采用CIN-1培養(yǎng)基和改良Y培養(yǎng)基對(duì)上述各心臟組織中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行16S rDNA序列分析，均得到了相同的結(jié)果。表明本試驗(yàn)建立的三重PCR方法適合應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌作為一種食源性人畜共患致病菌，該菌的檢測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義[17-18]。由該菌引起的臨床癥狀主要表現(xiàn)為急性腹痛、腹瀉、嘔吐等胃腸現(xiàn)象及結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、肝炎、敗血癥等并發(fā)癥[19]。目前，已有研究人員從糞便、肉類食品等分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌并檢測(cè)到一些毒力基因。許文炯等[20]、姜曉梅等[21]分別檢測(cè)到鮮肉樣品、人糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均攜帶ail、ystA、ystB、yadA、virF等毒力因子。YadA、ail、intB、virF和inv毒力因子可介導(dǎo)膠原蛋白、纖粘蛋白和層粘連蛋白等結(jié)合從而增加細(xì)菌的粘附作用，還能減弱抗菌多肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。YstB毒力因子是耶爾森氏菌引起腹瀉的重要原因之一。本試驗(yàn)檢測(cè)到菌株fsznc-10攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因，未檢測(cè)到y(tǒng)adA，這與茍小蘭等[22]的檢測(cè)結(jié)果基本一致。結(jié)合毒力基因檢測(cè)和致病性能驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明該菌具有較強(qiáng)的致病性。

傳統(tǒng)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法需通過(guò)中溫增菌培養(yǎng)、理化鑒定、血清學(xué)分析等一系列復(fù)雜過(guò)程，存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣等特點(diǎn)，而且檢出率不高，不利于及時(shí)準(zhǔn)確診斷小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。目前報(bào)道的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)方法主要有熒光定量及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能要求也較高，不利于普及運(yùn)用[23]。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，相關(guān)學(xué)者對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的毒力基因及致病機(jī)制有了更加深入細(xì)致的了解，這為從分子水平上鑒定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及評(píng)估菌株的毒力提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。影響多重PCR檢測(cè)的效果的因素有很多，模板濃度、引物特異性和穩(wěn)定性等均可影響檢測(cè)效果。在目前的研究中，有多種形式的多重PCR檢測(cè)方法，如利用一條或多條保守基因的方法檢測(cè)一種或多種細(xì)菌、利用數(shù)條特異性基因同時(shí)檢測(cè)數(shù)種細(xì)菌等，此類方法通過(guò)一條特異性基因或多條非特異性基因（如16S rDNA和23S rDNA序列）來(lái)判斷樣品中是否含有目的細(xì)菌，但檢測(cè)方法的特異性和準(zhǔn)確性欠佳[24-26]。本試驗(yàn)采用三條毒力基因檢測(cè)一種細(xì)菌的方法，以提高所建立檢測(cè)法的特異性和準(zhǔn)確性，在臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)出100%含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的樣品。該檢測(cè)方法具有特異性高、敏感性高、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，并且可在2 h內(nèi)檢測(cè)出菌樣是否含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，同時(shí)降低了鑒定細(xì)菌的成本。

綜上所述，本試驗(yàn)從病鯽魚(yú)中分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，檢測(cè)該菌攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因，經(jīng)分離菌致病性能驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌為病原菌。利用ail、inv和intB三條毒力基因建立了一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的三重PCR方法，并檢測(cè)出該菌對(duì)諾氟沙星和慶大霉素等5種抗生素敏感。這為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的快速檢測(cè)及防控提供了科學(xué)資料。