基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究清熱解毒與補(bǔ)氣養(yǎng)血中藥配伍對(duì)骨髓炎的分子作用機(jī)制

時(shí)永健,杜全紅,隋明軍,隋海明

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250035；2.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 威海 264400)

骨髓炎是一種由化膿性細(xì)菌感染骨髓、骨皮質(zhì)及骨膜等引起的慢性感染性疾病，常會(huì)造成周圍軟組織潰爛壞死[1]。多數(shù)由糖尿病足及血源性骨感染引起，但近年來隨著墜落傷、交通傷等高能量損傷發(fā)生率增加,骨髓炎已成為開放性骨折、內(nèi)固定手術(shù)的常見并發(fā)癥[2]。慢性骨髓炎往往反復(fù)發(fā)作,遷延難愈,急性發(fā)作常引起高熱、局部疼痛，若診治不及時(shí)也會(huì)轉(zhuǎn)為慢性，并造成局部肌肉萎縮、關(guān)節(jié)僵硬等,必要時(shí)不得不做出截肢保命的選擇，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給家庭及社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，尋找治療骨髓炎的有效藥物、途徑迫在眉睫。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，越來越多的研究著眼于骨感染治療，并取得一定的臨床療效。有報(bào)道顯示，常規(guī)抗菌藥物聯(lián)合中藥能產(chǎn)生協(xié)同作用，有效抑制多重耐藥菌[4]。

骨髓炎在中醫(yī)屬“附骨疽”范疇,其病機(jī)為濕熱之毒結(jié)聚于骨，或病后余毒未清，濕熱內(nèi)盛，化為深部膿瘍，熱毒注骨,正虛邪侵為其主要病機(jī)[5-6]。多項(xiàng)數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療骨髓炎中當(dāng)歸、黃芪、甘草、金銀花使用頻率最高[7-8]。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，為補(bǔ)血之圣藥；黃芪補(bǔ)氣升陽、托毒生肌，為補(bǔ)中益氣要藥；甘草補(bǔ)氣、緩急止痛、清熱解毒；金銀花清熱解毒，為治熱毒所致癰瘡之要藥。四藥共奏清熱解毒、補(bǔ)氣活血之功,符合消、托、補(bǔ)治法，在清熱解毒之時(shí)又補(bǔ)氣養(yǎng)血，顧護(hù)正氣。鑒于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)探究當(dāng)歸、黃芪、甘草、金銀花配伍治療骨髓炎過程中可能存在的分子作用機(jī)制，為探索中藥組方治療骨髓炎提供思路與方法。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究涉及的數(shù)據(jù)來源及運(yùn)算平臺(tái)主要是中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Pub Chem數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫、疾病基因數(shù)據(jù)庫、人類基因數(shù)據(jù)庫人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫、綜合型藥物數(shù)據(jù)庫、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫以及基因功能注釋數(shù)據(jù)庫。

1.2 研究方法

1.2.1 中藥活性成分及靶點(diǎn)篩選：依據(jù)TCMSP獲取當(dāng)歸、黃芪、甘草、金銀花符合參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(500≥MW≥180、AlogP<5、Caco-2>-0.4、OB≥30%、DL≥0.18)的活性成分，并通過PubChem數(shù)據(jù)庫保存對(duì)應(yīng)SMILES及2D結(jié)構(gòu)。將所得結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss target prediction及Drugbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，取0.85相似性閾值及人類基因型為篩查條件。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換基因名稱去重整合后，利用 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建散活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 骨髓炎靶點(diǎn)篩選：以“Osteomyelitis”作為關(guān)鍵詞，采用疾病基因數(shù)據(jù)庫、人類基因數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫、綜合型藥物數(shù)據(jù)庫以及治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫對(duì)UF已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，合并各數(shù)據(jù)庫的疾病靶基因。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、映射分析：將所篩選的中藥潛在靶基因與骨髓炎靶基因交叉生成Venny圖，得出中藥治療骨髓炎的映射靶基因，借助String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)，相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度(degree)值的大小進(jìn)行篩選，得到核心靶基因。

1.2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析、通路分析：將篩選出的核心靶基因?qū)牖蚬δ茏⑨寯?shù)據(jù)庫，進(jìn)行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及GO(Gene ontology，GO)生物過程的富集分析。以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別將篩選出的前20個(gè)GO條目與KEGG條目借助Omic Share云平臺(tái)繪制富集分析氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 藥物與疾病的靶基因 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出17個(gè)活性成分，具有161個(gè)靶基因(圖1)。經(jīng)相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫搜索查重后共選出140個(gè)骨髓炎已知靶基因，映射出關(guān)鍵靶點(diǎn)127個(gè)。

圖1 藥物活性物質(zhì)靶點(diǎn)圖

2.2 藥物與疾病的核心靶基因 經(jīng)String數(shù)據(jù)庫在0.4中信度下生成相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其中127個(gè)節(jié)點(diǎn)之間共有666條相互作用關(guān)系，平均自由度為11.6，以degree值≥23篩選到核心靶點(diǎn)13個(gè)(圖3)。

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 核心靶點(diǎn)圖

2.3 前20個(gè)生物過程及信號(hào)通路 經(jīng)David數(shù)據(jù)庫獲得126項(xiàng)GO富集結(jié)果及42條KEGG信號(hào)通路，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個(gè)生物過程和信號(hào)通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(圖4、5)。通路下所含靶點(diǎn)，見表1。

表1 KEGG通路下所含靶基因

圖4 GO富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路分析氣泡圖

3 討 論

通過TCMSP平臺(tái)分析得出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素等可能是黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花治療骨髓炎的有效成分。骨髓炎紅、腫、熱、痛等臨床癥狀均是炎癥的局部反應(yīng)，而上述活性物質(zhì)在炎癥反應(yīng)中均有獨(dú)特生物特性。槲皮素最突出的生理作用是抗炎[9]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有較強(qiáng)抑菌作用，并對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等有抑制作用，廣譜抗菌及不易耐藥成為槲皮素特質(zhì)[10]。木犀草素的多種藥理活性也被證實(shí)與抗炎有關(guān)[11]，木犀草素一方面控制體內(nèi)炎癥因子和炎癥介質(zhì)分泌，另一方面木犀草素還可抑制炎癥位置活性氧的產(chǎn)生并活化相關(guān)抗氧化酶，改善氧化應(yīng)激的進(jìn)一步損傷。山奈酚通過調(diào)控促炎酶活性和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、MMP等，達(dá)到治療炎性疾病的目的[12]。β-谷甾醇作為常見的植物甾醇之一，同樣具有良好抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能夠減少NO的合成,抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性,下調(diào)IL-1、TNF等炎癥因子分泌[13]。體外實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇除選擇性抑制外，還可通過抑制IL-6和TNF發(fā)揮抗炎作用[14]。隨著研究的不斷深入，在各組織、器官、系統(tǒng)中的抗炎作用正在不斷被發(fā)現(xiàn)。異鼠李素通過有效抑制LPS，刺激炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α的釋放；并作用于微生物細(xì)胞膜，從而影響相關(guān)蛋白酶[15-16]。由此可見，黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花四味中藥多種活性物質(zhì)在抗炎方面發(fā)揮著巨大作用。

經(jīng)靶點(diǎn)映射發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)占骨髓炎潛在靶點(diǎn)的91%，說明黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花與骨髓炎具有密切聯(lián)系，其活性成分能夠作用于骨髓炎絕大部分的治療靶點(diǎn)，AKT1、EGFR、HSP90AA1、SRC、ESR1等具有較高自由度，可能是治療骨髓炎的關(guān)鍵所在，黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花除清熱解毒，降低炎癥反應(yīng)外，還有其他生理作用干預(yù)骨髓炎進(jìn)程。成骨細(xì)胞的凋亡在骨髓炎中起關(guān)鍵作用[17]，而AKT1具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成熟分化的作用；此外AKT1還可以誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨血管生成和骨化[18]，因而具有修復(fù)軟骨能力。EGFR除參與炎癥反應(yīng)外，同樣可以通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)血管生成與構(gòu)建，并且廣泛表達(dá)于人的表皮細(xì)胞，具有表皮組織修復(fù)作用[19]。炎癥是氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)方式之一,HSP90AA1是一種在遺傳中高度保守的伴侶蛋白分子,在保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中具有重要作用[20]。SRC對(duì)于成骨細(xì)胞遷移具有重要作用，有研究顯示T3能夠通過SRC激活PI3K-Akt信號(hào)通路，發(fā)揮特異性成骨作用[21]。ESR1能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞，因而對(duì)骨髓炎具有骨生成作用[22]。當(dāng)然ESR1的轉(zhuǎn)錄活性是在核受體輔助因子調(diào)控下進(jìn)行的，而SRC可以提高轉(zhuǎn)錄活性，活化核受體調(diào)節(jié)骨代謝[23-24]。眾多靶點(diǎn)通過復(fù)雜的協(xié)同作用，依據(jù)多條通路調(diào)控骨髓炎發(fā)展過程，由此可見黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花清熱解毒、補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，不僅能改善炎癥反應(yīng)，同時(shí)能促進(jìn)骨形成、骨修復(fù)以及血管生成、改善血運(yùn)等。

通過基因可視化分析發(fā)現(xiàn)眾多靶點(diǎn)主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性、蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞核定位的正調(diào)控、ATP結(jié)合等多方面生物過程。核心靶點(diǎn)KEGG富集分析進(jìn)一步揭示了黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花通過多條通路干預(yù)骨髓炎。其中，雌激素通路對(duì)促進(jìn)成骨尤為重要，雌激素通過改善氧化應(yīng)激水平抑制成骨細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖與礦化[25]。此外，雌激素結(jié)合受體后還可以抑制破骨細(xì)胞活性和增殖，加速凋亡作用，進(jìn)一步促進(jìn)骨生成[26]。研究表明，雌激素缺乏可引起相關(guān)促炎因子表達(dá)，其機(jī)制可能與雌激素缺乏對(duì)促炎因子的mRNA表達(dá)抑制作用減弱有關(guān)[27]。前列腺癌與骨代謝有關(guān)，前列腺癌往往伴隨雄激素、睪酮的分泌下降，而雄激素、睪酮與雌激素同樣在骨骼的成長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。陳曉英等[28]研究發(fā)現(xiàn)睪酮水平可調(diào)節(jié)炎癥因子水平；相關(guān)研究進(jìn)一步證明降低睪酮水平可顯著降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平[29]。黏著斑信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)及分化等多種生物過程，在生理活動(dòng)中起重要作用。FAK是集中在黏著斑附近的一種激酶，參與多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大量數(shù)據(jù)證實(shí)FAK能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和血管生成。FAK參與調(diào)節(jié)相關(guān)成骨通路的下游分子，特異性加強(qiáng)相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，治療骨缺損[30]。RAP1信號(hào)通路與細(xì)胞分化、黏附有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)RAP1和VE能相互影響,協(xié)同調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)和血管壁的功能，改善血運(yùn)，增加血管通透性[31]。成骨液誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞時(shí)，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),Raplb表達(dá)量相應(yīng)上調(diào),因此Raplb參與了成骨細(xì)胞早期分化。甲狀腺激素通路可影響成骨及破骨細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)控OP。過高的甲狀腺激素水平會(huì)上調(diào)4-HNE表達(dá)，而4-HNE可以通過IRAK1和TRAF6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制激活炎性通路，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，提高氧化應(yīng)激水平。核心靶點(diǎn)富集出了大量通路，可見黃芪、當(dāng)歸、甘草、金銀花對(duì)于骨髓炎的復(fù)雜調(diào)控過程。

本文從數(shù)據(jù)挖掘角度，分析中藥治療骨髓炎的處方規(guī)律，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法從分子、通路方面分析清熱解毒、補(bǔ)氣養(yǎng)血相伍在骨髓炎中的治療機(jī)制，為今后研究提供了新的方向。